Результат интеллектуальной деятельности: Способ экспрессного определения суммарного содержания антоцианов

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано в заводских аналитических лабораториях для экспрессного определения содержания антоцианов в плодах и ягодах и продуктах их переработки, в том числе, в течение срока хранения.

В условиях климата подавляющей части РФ, плоды и ягоды являются сезонным продуктом, подлежащим переработке - высушивание, замораживание, получение сока и других напитков и фруктово-ягодных кондитерских изделий, современные технологии которых направлены на максимальное сохранение биологически активных веществ, в числе которых особое место занимают антоцианы. Антоцианы являются наиболее распространенными флавоноидными компонентами фруктов, овощей и продуктов их переработки, окраска которых в различные оттенки красного, синего и фиолетового цветов обусловлена наличием хромофорных групп в структуре антоцианов, которые поглощают свет при длине волны около 500 нм.

Разносторонняя биологическая активность антоцианов известна и доказана. Так, употребление в пищу антоцианов способствует снижению воспалительных процессов в организме, сокращает риск поражения раком пищевода и прямой кишки, антоцианы подавляют активность свободных радикалов, препятствуют их воздействию на биологические мембраны, что замедляет процесс старения. Следует отметить, что антоцианы некоторых ягод, особенно черники, оказывают эффективное воздействие на сосуды сетчатки глаза и улучшают состояние сосудистой ткани, что особенно перспективно в офтальмологии. Поэтому идентификация и контроль содержания антоцианов при производстве БАД к пище и продуктов специализированного и функционального назначения является обязательной процедурой технологического процесса, в ходе которого происходит разрушение антоциановых пигментов, обусловленное их неустойчивостью к процессам окисления, действию ферментов, чувствительности к изменению рН среды, свету (УФ) и температуре, особенно при длительном хранении [1-3], что влияет на их биологическую активность и оказывает существенное влияние на интенсивность и качество цвета [4].

Однако имеются сведения, что определенный процент антоцианов сохраняется при замораживании ягод [5], их термической обработке [6] и при длительном хранении (около года) [7]. При этом состав антоцианов продуктов, полученных непосредственно из плодов и ягод (соков, пюре, морсов и др.), совпадает с профилями хроматограмм, полученных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), аналогичных экстрактов, но пики имеют меньшую интенсивность [8, 9].

Общее содержание антоцианов в плодах, ягодах и продуктах их переработки определяется стандартными методами: обращенно-фазовой ВЭЖХ и рН-дифференциальной спектрофотометрией по ГОСТ 32709-2014 Продукция соковая. Методы определения антоцианинов и Р 4.1.1672-03 Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище.

Стандартные методы послужили аналогами и прототипами для следующих технических решений: «Способ количественного определения антоцианов в лекарственном растительном сырье» (Патент РФ 2557953), «Способ определения суммарного содержания антиоксидантов и суммарного содержания антоцианов в пищевых продуктах и напитках» (Патент РФ 2471181), «Method for analysis of anthocyanin» (Patent JP 2010236905 A) и др.; в том числе, применительно для конкретных видов растительного сырья с учетом номенклатуры и свойств обнаруженных антоцианов: «Method for determining anthocyanin components of strawberry fruits and their content by HPLC-MS/MS» (Patent CN 107966517 A), «Method for quickly determining anthocyanin in seed coat of black peanut by using UPLC/MS/MS (Ultra Performance Liquid Chromatography/tandem Mass Spectrometry)» (Patent CN 103235080 A), «Method for detecting anthocyanidin content of blueberries and application)) (Patent CN 108732298 A), «Method of measuring anthocyanins in ornamental Chinese flowering apple» (Patent CN 103499659 A), «HPLC (high performance liquid chromatography) determination method for cyanidin-3-rutinoside chloride in blackcurrants)) (Patent CN 104749279 A) и др.; в том числе, применительно для напитков и продуктов питания: «Способ определения наличия цианидин-3-о-глюкозида в биотехнологической жидкости» (Патент РФ 2709021), «Method for determining procyanidine in healthcare food» (Patent CN 103175904 A), «Method for analyzing oligomeric proanthocyanidin (opc)» (Patent CN 1989407 A), «Nitraria sibirica pall juice quality control method» (Patent CN 101865835 A), «Quality control method of black fruit lyceum juice» (Patent CN 101852729 А) и др.

Анализ нормативных документов и предлагаемых технических решений показал, что стандартные и заявленные методы, как правило, требуют использования специализированного высокотехнологичного дорогостоящего оборудования и продолжительной трудоемкой операции пробоподготовки: экстракционное и сорбционное концентрирование и очистка от балластных веществ, что не всегда приемлемо и оправдано. Сложившаяся мировая ситуация требует, с одной стороны, использование современных методов анализа, с другой - максимально простых и экспрессных методов измерения с сохранением достоверности результатов.

Таким образом, разработка простого, доступного и объективного метода, позволяющего в условиях заводской лаборатории определять и контролировать содержание антоцианов по интенсивности окраски экстракта ягод, представляется перспективной и практически значимой для перерабатывающих предприятий. На решение этой задачи направлено данное техническое решение.

Современные исследования показывают, что оптические характеристики ягод -цветовой тон, насыщенность, чистота и др., тесно коррелируют с содержанием антоцианов и указывают на то, что измерения оттенка и интенсивности цвета могут быть использованы для мониторинга содержания антоцианов в плодах, ягодах, овощах, зерновых и т.д. (и наоборот) [10]. Так, известны способы определения содержания антоцианов по показателям цветовых параметров в черном рисе [11], листьях пиона [12] и др.

Для ряда натуральных пигментов - β-каротин и хлорофилл - корреляция между их содержанием и визуальным восприятием цвета полученных продуктов установлена и выражается через шкалы цветности [13]. В таких случаях измерение характеристик цвета может стать простой и доступной альтернативой более сложным методам анализа, поскольку характеристики цвета - в частности цветовой тон, чистота и насыщенность - связаны с концентрацией природных пигментов, в том числе, антоцианов [14].

Задача, на реализацию которой направлено предлагаемое техническое решение, -разработка простого и доступного метода, позволяющего определять содержание антоцианов по интенсивности окраски экстракта плодов, ягод и продуктов их переработки, как в заводской лаборатории, так и во внелабораторных условиях, при этом не требующего высокой квалификации персонала.

Для определения цветометрических характеристик предлагается визуальное сравнение цвета анализируемых экстрактов плодов, ягод и продуктов их переработки с разработанной шкалой цветности по интенсивности окраски растворов хлорида кобальта (II) различной концентрации (таблица 1), выраженной через цветное число. Хлорид кобальта (CoCl₂ × 6Н₂О) применяют для визуальной оценки окраски жидкостей красного цвета согласно ОФС.1.2.1.0006.15 Степень окраски жидкостей [15].

Устойчивость окраски растворов хлорида кобальта (II) составляет один месяц (растворы хранились в темном помещении, при комнатной температуре 20-25°С). Диапазон измеряемых концентраций антоцианов в экстрактах составляет от 0 до 1,50%. При содержании антоцианов ниже 0,05% окраска практически отсутствует и не определяется визуально. При концентрациях антоцианов более 1,50% раствор приобретает насыщенный бордовый цвет, и пробы визуально не различаются. Градуировочный график зависимости цветного числа от концентрации антоцианов в растворе, построенный на основе экспериментальных данных, представлен на фиг. 1.

Способ осуществляют следующим образом. Получают извлечение антоцианов из плодово-ягодного сырья водно-спиртовой смесью, содержащей 1,0% кислоты хлористоводородной с концентрацией спирта этилового 60%, и определяют количественное содержание антоцианов методом спектрофотометрии (спектрофотометр UV-2401PC) по оптической плотности [16]. Затем суммарное содержание антоцианов в этом же водно-спиртовом извлечении плодово-ягодного сырья устанавливают сравнением окраски экстракта с разработанной шкалой цветности и по градуировочному графику, построенному в координатах - цветное число, ед. / массовая доля антоцианов, %, находят массовую долю антоцианов.

Реализация предлагаемого способа показана на примере определения суммарного содержания антоцианов в экстрактах, полученных из ягод черники обыкновенной (лат. Vaccinium myrtillus), брусники обыкновенной (лат.Vaccinium vitis-idaéa) и их выжимок (таблица 2).

Дальнейшие исследования подтвердили применимость предлагаемого способа для других интенсивно окрашенных ягод. Результаты определения содержания антоцианов по предлагаемому способу сопоставили с результатами стандартного метода спектрофотомерии по ГОСТ 32709-2014 и рассчитали погрешность экспрессного способа определения (таблица 3).

Для методов экспрессного определения приемлемой погрешностью считают погрешность в пределах 30% [17, 18]. Максимальная погрешность определения суммы антоцианов заявляемым способом не превышает 12%. Несмотря на то, что экспрессный метод подразумевает меньшую точность определения, чем инструментальные методы, тем не менее, он приемлем и обоснован для выявления фальсификации исследуемой продукции и установления ее качества, в том числе, во внелабораторных условиях.

Предлагаемый экспрессный способ количественной оценки суммарного содержания антоцианов позволяет исключить применение сложного аналитического оборудования, проводить анализ, как в лабораторных, так и во внелабораторных условиях и не требует высокой квалификации персонала.

Возможность промышленной применимости предлагаемого способа экспрессного определения суммарного содержания антоцианов подтверждена Актом по результатам производственных испытаний, проведенных в условиях лаборатории предприятия ООО «КИТ ПЛЮС» (г. Бийск) - крупнейшего производителя сухих и густых водорастворимых растительных экстрактов из плодов, ягод и лекарственных растений предгорья Горного Алтая и Алтайского края. Кроме того, предлагаемый способ экспрессного определения суммарного содержания антоцианов будет включен в программу курса «Химия вкуса, цвета и аромата», реализуемого в Бийском технологическом институте (филиале) ФГБОУ ВО «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова» для магистрантов направления подготовки 19.04.02 Продукты питания из растительного сырья.

Источники информации

1. Кульченко, Я.Ю. Влияние состава антоцианового комплекса на окраску экстрактов при повышенных значениях рН [Текст] / Я.Ю. Кульченко, Л.А. Дейнека // Научные ведомости. Серия Естественные науки. - 2017. - №11 (260). Вып. 39. - С. 79-83.

2. Gould, К. Anthocyanins: Biosynthesis, Functions and Applications [Text] / K. Gould, K.M. Davies, Ch. Winefield (and ed.). - Kindle Edition, 2009. - 355 p.

3. Torskangerpoll, K. Colour stability of anthocyanins in aqueous solutions at various pH values [Text] / K. Torskangerpoll, M. Andersen // Food Chemistry. - 2005. - №89 (3). - P. 427-440.

4. Wrolstad, R.E. Tracking color and pigment changes in anthocyanin products [Text] / Ronald E Wrolstad, Robert W. Durst, Jungmin Lee // Trends in Food Science & Technology. - 2005. - №16(9). - P. 423-428. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2005.03.019.

5. Бутенко, Л.И. Иследования антоцианового комплекса ягод, прошедших криообработку [Текст] / Л.И. Бутенко, Ж.В. Подгорная // Успехи современного естествознания. - 2016. - №11. - С. 14-17.

6. Fischer, U.A. Thermal stability of anthocyanins and colourless phenolics in pomegranate (Punica granatum L.) juices and model solutions [Text] / U.A. Fischer, R. Carle, D.R. Kammerer // Food Chemistry. - 2013. - №138(2-3). - P. 1800-1809. doi:10.1016/j.foodchem.2012.10.072.

7. Türkyılmaz, M. Kinetics of anthocyanin degradation and polymeric colour formation in black carrot juice concentrates during storage [Text] / M. Türkyılmaz, M. Özkan // International Journal of Food Science & Technology. - 2012. - №47 (11). - P. 2273-2281. doi:10.1111/j.1365-2621.2012.03098.x.

8. Карбовская, P.B. Идентификация антоцианов при помощи ВЭЖХ, как метод подтверждения аутентичности фруктово-ягодного сырья и готовой продукции [Текст] / Р.В. Карбовская, И.И. Борис // Журнал Хроматографiчного товариства. - 2008. - Т. VIII -№3,4.-С. 13-33.

9. Veliodlu, S. Chemical Characterization of pomegranate juice, Quality Control, Scientific and Technical Research Council of Turkey; Determination of Phenolic Compounds in Pomegranate Juice by Using HPLC (N. Artik) [Text] / S. Veliodlu, C. Unal // Quality Control. - 1997. - №8. - C. 307-310.

10. Gonçalves, B. Effect of ripeness and postharvest storage on the evolution of colour and anthocyanins in cherries (Prunus avium L.) [Text] / B. Gonçalves, A.P. Silva, J. Moutinho-Pereira, E. Bacelar, T. Rosa, A.S. Meyer // Food Chemistry. - 2007. - №103 (3). P. 976-984. doi:10.1016/j.foodchem.2006.08.039.

11. Patent 107247025A CN IPC G01N 21/25 Method for determining anthocyanin content of black rice by utilizing color parameter indexes [Text] / Fang Changyun; Hu Xianqiao; Hu Zhanqiang; Lu Lin; Shao Yafang; Sun Chengxiao; Yu Yonghong; Zhu Zhiwei (China); priorities 2017.07.24 № CN 201710608018 A; publication 2017.10.13.

12. Patent 105241822 A CN IPC G01N 21/25 Measurement method of content of anthocyanin in leaves of peony on the basis of hyperspectrum [Text] / Chang Qingrui; Liu Xiuying; Ma Wenjun; Song Rongjie; Wang Li; Xiong Jianli; Yan Lin (China); priorities 2015.08.28 №CN 201510543672 A; publication 2016.01.13.

13. Lovibond® - измерение цветности. - Текст: электронный // URL: http://www.nevaline.com.ru/media/2018_Lovibond_Oils_Fats_nevaline_web.pdf. (дата обращения 04.04.2020).

14. Ломова Т.С. Цветометрическое количественное определение антоциановых пигментов в спиртовых и водных растворах [Текст] // Пиво и напитки. - 2008. - №1. - С. 42-44.

15. ОФС.1.2.1.0006.15 Степень окраски жидкостей. - Текст: электронный // URL: https://pharmacopoeia.ru/ofs-l-2-l-0006-15-stepen-okraski-zhidkostej/. (дата обращения 07.04.2020).

16. ГОСТ 32709-2014 Продукция соковая. Методы определения антоцианинов [Текст]. - М.: ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 2014. - 17 с.

17. РМГ 61-2010 ГСИ Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки [Текст]. - М.: ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 2013. - 53 с.

18. Калинкина, С.П. Визуальные и цветометрические экспресс-способы суммарного определения дубильных веществ в растительном сырье [Текст] / С.П. Калинкина, А.А. Казакова, П.Т. Суханов, А.Н. Ильин // Вестник ВГУИТ. - 2016. - №2 (68). - С. 223-229.