Способ получения комплекса биофлавоноидов из обезжиренного облепихового шрота

Изобретение относится к фармацевтической, пищевой и перерабатывающей промышленности, в частности, к способам получения комплекса биофлавоноидов из облепихового шрота.

В настоящее время безотходная переработка плодоовощной продукции (в том числе плодов облепихи) является мировой тенденцией, ориентирующей производителей на технологии глубокой переработки растительного сырья, в том числе методами биотехнологии, с получением комплекса ценных биологически активных веществ, пищевых ингредиентов и добавок. Для отечественных производителей фармацевтической и пищевой продукции это особенно актуально в свете сложившихся экономических отношений и санкционной политики ряда стран.

В этом плане научный интерес и практическую значимость представляет обезжиренный шрот - крупнотоннажный отход переработки плодов облепихи, ежегодный объем которого только в Алтайском крае составляет порядка 200 т [1].

Плоды облепихи крушиновидной (Hippophae rhamnoides) содержат значительное количество витаминов А, С, Е, каротиноидов, органических кислот, сахаров, а также фитостерины, микроэлементы, фосфолипиды и др. [2].

Несомненный интерес представляют Р-витаминные вещества облепихи, которые повышают ценность плодов как поливитаминного средства. По данным аналитических исследований полифенольный комплекс плодов облепихи представлен флавонолами, лейкоантоцианами, катехинами и дубильными веществами - производными галловой кислоты. Из суммарного количества флавоноидов на долю катехинов приходится в среднем 42-45%, лейкоантоцианов - 38-40%, флавонолов - 16-20%, из них рутин - 1,55-3,65%, кверцетин - 2,90%, изорманетин - 0,37-14,70%, кемпферол - 0,43-5,46%, мирицетин - 2,71-16,20% [3].

Облепиха характеризуется стабильно высоким плодоношением в условиях Сибири, что обусловило круглогодичную переработку ее плодов предприятиями фармацевтической и пищевой промышленности в трех основных направлениях: получение масла и масляных экстрактов; получение сока прямым отжимом; получение сухих и густых экстрактов с дальнейшим использованием полученных продуктов предприятиями отраслей. Например, в производстве мороженого [4], молочных [5] и кисломолочных [6, 7] продуктов, кулинарных изделий [8] и т.д.

Известны способы получения из облепихового сырья биологически активных веществ (БАВ), пищевых порошков, композиций и экстрактов: «Способ получения БАВ из облепихового сырья» (Патент РФ 2125459); «Nourishing powder containing sea buckthorn flavones and production process thereof» (Patent CN 107536036 A); «Sea-buckthorn VP (vitamin P) nutritional composition as well as preparation method and application thereof» (Patent CN 108851071 A); «Method for preparing active extract of sea buckthorn» (CN WO 2017185289 A1) и биологически активных добавок к пище (БАД): «Способ производства биологически активной добавки из облепихового сырья» (Патент РФ 2218031); «Способ получения биологически активной добавки к пище на основе семян облепихи» (Патент РФ 2620006), в том числе из плодов облепихи: «Способ получения биологически активных веществ из плодов облепихи» (АС 1207473 А СССР); «Способ получения биологически активных веществ из облепихи» (АС 1752396 А1 СССР). Известна Pharmaceutical composition for preventing or treating stress-related disease comprising extract of Sea buckthorn leaves» (Patent KR 20180108997 А) и др.

Облепиховый шрот, образующийся после извлечения облепихового масла из сухого жома облепихи и состоящий из частично дробленых семян и плодовых оболочек, представляет собой вторичное плодово-ягодное сырье, обладающее высокой биологической ценностью, благодаря содержанию пищевых волокон - 59,1%; витаминов, мг/100 г: B₁ - 0,40; В₂ - 0,25, РР - 1,90; С - 22,5; Р - 2414,30; минеральных веществ в сумме более 353-363 мг/г; в облепиховом шроте содержится 18 аминокислот, из которых почти половина незаменимые (лизин, треонин, валин, метионин, триптофан, изолейцин, лейцин, фенилаланин). Из заменимых протеиногенных аминокислот значительная доля приходится на глутаминовую, аспаргиновую кислоты и аргинин [9]. Наиболее ценными компонентами облепихового шрота являются биофлавоноиды - класс природных фенольных соединений, отличающихся структурным разнообразием, высокой и разносторонней биологической активностью (в первую очередь Р-витаминной и связанным с ней антиоксидантным потенциалом) при отсутствии токсичности.

Данный факт позволяет рассматривать облепиховый шрот как перспективное сырье для получения лекарственных средств, поскольку его экстракты обладают высокой физиологической активностью и терапевтическим потенциалом, что подтверждено рядом патентов на изобретения. Так, известен «Способ получения средства, обладающего гиполипидемическим и противоатеросклеротическим действием» (Патент РФ 2011383); известно «Средство, обладающее гипохолестеринемическим, гиполипидемическим и желчегонным действием» (Патент РФ 2394587); известен «Способ получения средства, обладающего гиполипидемическим и противоатеросклеротическим действием» (Патент РФ 2011383) [10].

В качестве пищевого ингредиента облепиховый шрот используется при производстве широкого перечня продуктов питания. Так, известно использование облепихового шрота в производстве хлебобулочных изделий: «Способ производства хлеба» (Патент РФ 2043720); «Способ производства хлеба» (Патент РФ 2264104); «Сдоба с облепиховым шротом» (Патент РФ 2535732); макаронных изделий: «Макаронные изделия «Здоровье» с облепиховым шротом» (Патент РФ 2548188); мучных кондитерских изделий: «Способ производства вафель» (Патент РФ 2266655), «Способ производства галет повышенной пищевой ценности» (Патент РФ 2601806), «Пряники с облепиховым шротом» (Патент РФ 2535731) и полуфабрикатов для их производства: «Способ производства песочного полуфабриката» (Патент РФ 2395970), «Бисквитный полуфабрикат с облепиховым шротом» (Патент РФ 2532034), «Пищевая композиция для производства сдобного печенья» (Патент РФ 2616804), «Композиция для производства сахарного печенья» (Патент РФ 2625570); сахаристых кондитерских изделий: «Состав для приготовления драже и способ приготовления драже» (Патент РФ 2101974) и др.

К сожалению, до настоящего времени способов получения биофлавоноидов из облепихового шрота как отхода пищевой и перерабатывающей промышленности или фармацевтического производства в доступных источниках не представлено, тогда как известны способы получения флавоновых соединений и суммарных флавоноидов из лекарственно-технического растительного сырья, в том числе из листьев облепихи «Method for extracting flavone compounds from sea-buckthorn leaves» (Patent CN 108272837 А); из ветвей и листьев «Extraction method of total flavonoids in branches and leaves of sea buckthorn» (Patent CN 107595902 A).

Известен «Способ холодной водной экстракции флавоноидов из лекарственного растительного сырья» (Патент РФ 2453322) [11], в котором при наложении электрического поля напряжением 5 В и частотой 10⁵ Гц при перемешивании в течение 30-60 мин. Недостатками данного способа являются использование в качестве экстрагента дистиллированной воды, в которой гидрофобные биофлавоноиды облепихового шрота плохо растворимы, особенно в холодной, а гликозиды частично гидролизуются, кроме того, наряду с биофлавоноидами, водой извлекаются балластные полярные вещества, в том числе простые сахара, слизи, дубильные и пектиновые вещества, ухудшающие качество экстракта, а их дальнейшее отделение и очистка трудоемки [12, 13].

Известен «Способ получения суммы флавоноидов, обладающей радиозащитным действием» (Патент РФ 2152794) [14] экстракцией в течение 2 ч на кипящей водяной бане травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) очищенной водой при гидромодуле 1:6,6, с последующей очисткой отвара от сопутствующих веществ на хроматографической колонке с полиамидным сорбентом и элюированием суммы флавоноидов этанолом, который затем отгоняют, а остаток высушивают. Недостатками данного способа являются многостадийность процесса, трудоемкость очистки водного извлечения методом препаративной колоночной хроматографии и длительный контакт сырья с горячей водой, что приводит к разрушению нативной структуры лабильных биофлавноидов.

Известен «Способ получения суммы флавоноидов, обладающих Р-витаминной активностью» [15] из надземной части горца Вейриха (Polygonum weyrichii), заключающийся в трехкратной экстракции измельченного сырья 86%-ым этиловым спиртом при нагревании смеси паром в течение 30 мин, с последующим удалением растворителя и хроматографированием водного концентрата на колонке с полиамидным сорбентом этанолом 80-96%-ой концентрации. Недостатком данного способа являются многостадийность процесса, использование острого водяного пара в течение 30 мин, что интенсифицирует гидролиз БАВ растительного сырья (распад гликозидных и сложноэфирных связей), трудоемкость очистки водного извлечения методом препаративной колоночной хроматографии.

Перечисленные способы получения суммы флавоноидов касаются травы и листьев лекарственно-технического сырья, имеющего морфолого-анатомические особенности и отличный от шрота химический состав, поэтому в качестве аналогов не рассматривались.

Таким образом, разработка высокоэффективного, малозатратного и неразрушающего полезные свойства способа извлечения комплекса биофлавоноидов из обезжиренного облепихового шрота является перспективной и практически значимой.

Задача, на реализацию которой направлено предлагаемое техническое решение, - разработка эффективного способа получения комплекса биофлавоноидов из обезжиренного облепихового шрота при сохранении их нативной структуры. Основной стадией процесса является непрерывная экстракция комплекса биофлавоноидов этиловым спиртом в аппарате Сокслета, обеспечивающая максимальное извлечение полифенольных соединений из обезжиренного облепихового шрота минимальным количеством растворителя, объем которого ограничивается размером патрона экстрактора. Данный эффект достигается экстракцией облепихового шрота за счет многократного использования небольшого объема растворителя, при этом концентрация этилового спирта не влияет на эффективность процесса и составляет от 86% до 96%.

По варианту 1 способ получения комплекса биофлавоноидов из обезжиренного облепихового шрота включает экстракцию биофлавоноидов этиловым спиртом концентрацией от 86% до 96% в аппарате Сокслета и промывку вязкой сиропообразной массы вакуум-концентрата водой в соотношении 1:3. В результате происходит растворение гидрофильных балластных веществ углеводной природы, что, затем, обеспечивает образование кристаллического осадка комплекса биофлавоноидов, который отфильтровывают и высушивают.

По варианту 2 способ получения комплекса биофлавоноидов из обезжиренного облепихового шрота включает предварительную обработку шрота ферментным препаратом и экстракцию биофлавоноидов этиловым спиртом концентрацией от 86% до 96% в аппарате Сокслета. Предварительную обработку шрота проводят мультиэнзимной композицией, состоящей из смеси ферментных препаратов Брюзайм BGX и Ультрафло XL в соотношении 1:1, обеспечивающей расщепление некрахмалистых полисахаридов (ксиланы, целлюлоза, гемицеллюлоза, β-глюканы, олигосахариды и др.) и ослабление связей между компонентами шрота, что приводит к разрушению капиллярно-пористой структуры сырья и способствует проникновению экстрагента в капилляры частиц сырья, подготавливая сырье к экстракции и ускоряя, затем, процесс извлечения комплекса биофлавоноидов.

Некрахмалистые полисахариды, являясь компонентами растительных клеточных стенок, придают им прочность и обуславливают жесткость структуры. Применение ферментов, расщепляющих целлюлозу и гемицеллюлозу, неизбежно вызовет их деструкцию, приведет к необратимым нарушениям целостности клеточной стенки, ее дестабилизации и, как следствие, увеличению выхода экстрактивных веществ. Кроме того, гидролиз полисахаридов сопровождается высвобождением связанных с ними фенольных веществ. Поэтому определяющее значение при реализации предлагаемого способа имеет выбор ферментных препаратов, под действием которых растительная ткань размягчается, клеточная проницаемость возрастает, выход экстракта увеличивается, за счет этого способ получения комплекса биофлавоноидов реализуется с максимальной эффективностью.

С учетом данных химического состава обезжиренного облепихового шрота наиболее эффективны ферментные препараты целлюлолитического и глюканолитического действия: Брюзайм BGX (штамм продуцент - Trichoderma longibrachiatum) и Ультрафло XL (штамм продуцент - Humicola insolens). Эти ферментные препараты характеризуются наличием в их составе активных компонентов целлюлолитической системы (комплекса эндо- и экзоферментов) и содержат набор гемицеллюлаз, в том числе, активную ксиланазу, пентозаназу, арабаназу и β-глюканазу, гидролизующих слизи. Для более полной и глубокой конверсии полисахаридов облепихового шрота ферментные препараты используются в составе мультиэнзимной композиции, что объясняется синергетическим эффектом, который проявляется во взаимном усилении их действия, увеличении скорости гидролитического расщепления растительных полисахаридов, выражающийся в интенсификации процесса разрушения клеточной стенки и облегчении последующей экстракции комплекса биофлавоноидов из разрушенных клеток.

По варианту 1 сырье, обезжиренный облепиховый шрот, 30 г помещают в гильзу аппарата Сокслета, а в приемную колбу заливают 240 мл 85-96%-го этанола. Процесс непрерывной экстракции проводят в течение 6 часов. Экстракт подают в выпарной аппарат и отгоняют этанол при небольшом разряжении 10-30 мм рт. ст., вакуум-концентрат охлаждают и разбавляют водой в соотношении 1:3, выпавший осадок суммы биофлавоноидов отфильтровывают и высушивают при температуре 50-60°С. Выход целевого продукта - 3,0%. Комплекс биофлавоноидов получают в виде порошка желто-коричневого цвета, основными компонентами которого являются флавоноидный гликозид - рутин и флавонолы - кверцетин, кемпферол, изорамнетин. Подлинность подтверждена методом Фолина-Чокальтеу.

По варианту 2 сырье, обезжиренный облепиховый шрот, 30 г смешивают с 600 мл воды, нагревают до 40°С и вносят, при перемешивании, 0,04% к массе перерабатываемого шрота мультиэнзимной композиции, состоящей из смеси ферментных препаратов Брюзайм BGX и Ультрафло XL в соотношении 1:1, затем массу нагревают до температуры 50-55°С и выдерживают при этой температуре 1,5 часа. По окончании гидролиза, твердые частицы шрота отделяют от гидролизата фильтрованием на воронке Бюхнера «досуха» и направляют на экстракцию в аппарат Сокслета, в приемную колбу которого помещают 240 мл 85-96%-го этанола. Процесс непрерывной экстракции проводят в течение 4 часов, после чего экстракт подают в выпарной аппарат и отгоняют этанол при небольшом разряжении 10-30 мм рт. ст., вакуум-концентрат охлаждают, выпавший осадок биофлавоноидов отфильтровывают и высушивают при температуре 50-60°С. Выход целевого продукта - 3,4%. Комплекс биофлавоноидов получают в виде порошка желтого цвета, основными компонентами которого являются флавоноидный гликозид - рутин и флавонолы - кверцетин, кемпферол, изорамнетин. Подлинность подтверждена методом Фолина-Чокальтеу.

Анализ качественного и количественного состава комплекса биофлавоноидов, полученных по предлагаемому способу, провели методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с фотометрическим детектированием на приборе «Waters 2695 Alliance», с последующей компьютерной обработкой результатов. Условия хроматографического анализа для определения кверцетина, кемпферола, изорамнетина: октадецилсиликагель, Symmetry С 18, размер колонки 250 × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали ацетонитрил - раствор трифторуксусной кислоты рН=2,6 (40:60), скорость подвижной фазы 1,0 см³/мин. Детектирование: УФ, λ=365 нм; объем вводимой пробы: 10 мм³.

Условия хроматографического анализа для определения рутина: октадецилсиликагель, Symmetry С 18, размер колонки 250 × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм. Скорость подачи элюента 1,0 см³/мин. Детектирование: УФ, λ=360 нм; объем вводимой пробы: 10 мм³, подвижная фаза: трихлоруксусная кислота, рН=2,5-70%, ацетонитрил - 30%.

Расчет содержания индикаторных компонентов проводили по градуировочному графику, построенному в координатах S (площадь пика) - С (концентрация), г/100 г. Методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в составе комплекса биофлавоноидов облепихового шрота обнаружены рутин, кверцетин, кемпферол, изорамнетин, содержание которых представлено в таблице 1.

Таким образом, заявляемый способ получения комплекса биофлавоноидов из облепихового шрота позволяет сократить продолжительность стадии очистки концентрата комплекса биофлавоноидов от балластных веществ (простых сахаров, слизей, растворимых пектиновых веществ и др.) до 60 мин (вместо 15 часов), снизить производственные затраты за счет исключения стадии регенерации дорогостоящего адсорбента (силикагель или полиамидные смолы) для препаративной колоночной хроматографии и сохранить нативную структуру комплекса биофлавоноидов за счет снижения вероятности гидролиза флавоноидных гликозидов.

Упрощение технологии по варианту 1 заключается в замене трудоемкого и дорогостоящего метода препаративной колоночной хроматографии на стадии очистки концентрированного экстракта от балластных веществ на промывку водой с последующим отделением комплекса биофлавоноидов облепихового шрота фильтрованием. Кроме того, установлено, что проведение предварительной обработки обезжиренного облепихового шрота, по варианту 2, мультиэнзимной композицией в течение 1,5 часов способствует увеличению выхода комплекса биофлавоноидов на 13%.

В настоящее время в лаборатории синтеза и выделения природных и биологически активных веществ Бийского технологического института (филиал) ФГБОУ ВО «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова» успешно прошли испытания по реализации предложенного способа получения комплекса биофлавоноидов из облепихового шрота, а также подписано соглашение по апробации предлагаемого технического решения в условиях действующего производства ЗАО «Алтайвитамины» (г. Бийск), профилем которого является производство лекарственных препаратов, в том числе из плодов облепихи.

Источники информации

1. Официальный сайт министерства сельского хозяйства Алтайского края: [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.altagro22.ru/news/uborka-urozhaya/predpriyatiya-promyshlennogo-sadovodstva-kraya-vedut-uborku-oblepikhi/. (16.03.2019).

2. Koshelev, Yu.A. Sea Bukthorn: monograph / Yu.A. Koshelev, L.D. Ageeva, E.S. Batashov, V.P. Sevodin, N.I. Kuleshova. - Biysk: Publishing house of Polzunov Altai State Technical (Printedby CJSC «Altayvitaminy»), 2015. - 401 p.

3. Аверьянова, Е.В. Биологическая ценность облепихи как основа ее комплексной безотходной переработки / Е.В. Аверьянова // Современная наука и инновации. - 2018. - №3 (23). - С. 129-139.

4. Бобченко, В.И. Влияние продуктов переработки плодов облепихи на формирование свойств молочной основы мороженого / В.И. Бобченко [и др.] // Известия вузов. Пищевая технология. - 2012. - №5-6. - С. 60-62.

5. Остроумов, Л.А. Технология переработки черной смородины и облепихи с целью их использования в комбинированных молочных продуктах / Л.А. Остроумов, С.Р. Царегородцева, А.Ю. Просеков // Известия вузов. Пищевая технология. - 2001. - №5-6. - С. 40-42.

6. Патент 2216976 РФ Способ производства йогурта с облепихой / М.П. Могильный, А.Б. Бижев (Россия); заявл. 06.12.2001 №2001132952/13; опубл. 27.11.2003. Бюл. №33.

7. Дудикова, Г.Н. Функциональные кисломолочные напитки с экстрактами черной смородины и облепихи / Г.Н. Дудикова, А.В. Чижаева // Рациональное питание, пищевые добавки и биостимуляторы. - 2016. - №1. - С. 59-64; URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=35716 (дата обращения: 01.05.2019).

8. Кольтюгина, О.В. Получение и использование сухих плодов облепихи в качестве комбинированной пищевой добавки / О.В. Кольтюгина, Е.Ю. Филимонова, М.П. Щетинин // Ползуновский альманах. - 2005. - №1. - С. 41-49.

9. Никулина, Е.О. Облепиховый шрот как функциональный ингредиент для создания продуктов функционального назначения / Е.О. Никулина, Г.В. Иванова, О.Я. Кольман // Вестник КрасГАУ. - 2015. - №10. - С. 98-105.

10. Патент 2011383 Россия МПК А61K 35/78 (1990.01) Способ получения средства, обладающего гиполипидемическим и противоатеросклеротическим действием [Текст] / Э.Т. Оганесян, А.В. Симонян, Ю.К. Василенко, В.А. Хан, Г.И. Щукин, Ю.Г. Пшуков, Е.П. Парфентьева, А.В. Кузнецов, С.Х. Муцуева, Л.Д. Агеева (Россия); заявл. 04.06.1991 №91 4942485; конвекционный приоритет 04.06.1991 SU 91 4942485.

11. Патент 2453322 Россия МПК А61K 36/00 (2006.01) B01D 11/02 (2006.01) Способ холодной водной экстракции флавоноидов из лекарственного растительного сырья [Текст] / Н.Н. Федоровский, А.И. Марахова, А.А. Сорокина (Россия); заявл. 03.12.2010; опубл. 20.06.2012; Бюл. №17. - 3 с.

12. Сунцова, Л.П. Механохимическое получение и исследование водорастворимых композиций на основе флавоноидов - генистеина, дигидрокверцетина, рутина / Л.П. Сунцова, Е.С. Метелева, А.В. Душкин // Фундаментальные исследования. - 2014. - №11-10. - С. 2174-2179.

13. Липковская, Н.А. Зависимость растворимости природных флавоноидов в воде от концентрации мирамистина, поливинилпирролидона и сывороточного альбумина человека / Н.А. Липковская, В.Н. Барвинченко, Т.В. Федянина // Журнал физической химии. - 2014. - Т. 88. - №5. - С. 882-886.

14. Патент 2152794 Россия МПК А61K 35/78 (2000.01) А61Р 39/06 (2000.01) Способ получения суммы флавоноидов, обладающей радиозащитным действием [Текст] / М.Н. Архипова (Россия); заявл. 03.03.1999; опубл. 20.07.2000; Бюл. №20. - 5 с.

15. Патент BY (11) 5575 Республика Беларусь МПК А61K 35/78 Способ получения суммы флавоноидов, обладающих Р-витаминной активностью [Текст] / А.С. Захаревский, З.П. Кузнецова, В.М. Царенков, В.А. Стельмах, А.Л. Левашкевич, М.В. Гаврилов; А.И. Дидоренко, А.С. Богдан, A.M. Жуков, А.Д. Мурашко, Л.А. Мелентович (Беларусь); заявл. 20.07.1998 №а 19980688; опубл. 30.12.2003.