Результат интеллектуальной деятельности: ЭМУЛЬСИОННЫЙ СОСТАВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к эмульсионному составу пептидов и способу получения такого препарата. Более конкретно, настоящее изобретение относится к эмульсионному составу типа вода-в-масле (w/o), содержащему пептидные эпитопы CTL и масляный адъювант, и к способу получения такого препарата.

[Уровень техники]

[0002]

Привлекающий внимание в последние годы метод лечения рака с использованием пептидных вакцин основан на том, что Т-клеточные рецепторы (TCR) эпитоп-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) распознают главный комплекс гистосовместимости (MHC) на поверхности раковых клеток, представляющих вводимые антигенные пептиды, и CTL уничтожают раковые клетки. MHC человека называют «лейкоцитарным антигеном человека (HLA)», и, как известно, типы HLA чрезвычайно разнообразны.

[0003]

Эффективные противораковые пептиды различаются в зависимости от типов HLA у людей, которым вводят пептиды. Соответственно, типы HLA, мишенью которых является пептидная вакцина против рака, ограничены. Были опубликованы данные о пептиде, имеющем 4 связанных эпитопа CTL, содержащем различные типы пептидных эпитопов CTL, способных индуцировать CTL одного или нескольких типов HLA, выбранных из супертипов HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26 и HLA-A3 (патентная литература 1).

[0004]

Между тем известно, что масляные адъюванты усиливают эффект пептидных вакцин против рака. При создании пептидного состава, особенно в форме пептидных противораковых вакцин, с использованием масляного адъюванта, обычной практикой является приготовление эмульсионного состава типа вода-в-масле (w/o). Поскольку в эмульсионном составе со временем могут возникать проблемы, такие как расслоение или агрегация, предпочтительно приготавливать эмульсию в момент использования. Таким образом, были предложены способ и устройство, используемые для получения такой эмульсии (патентная литература 2 и патентная литература 3).

[Литература предшествующего уровня техники]

[Патентная литература]

[0005]

[Патентная литература 1] WO 2015/060235

[Патентная литература 2] WO 2007/083763

[Патентная литература 3] Патент JP № 5629882

[Краткое изложение сущности изобретения]

[Цели, которые должны быть достигнуты изобретением]

[0006]

Способ получения эмульсионного состава пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, описанного в WO 2015/060235, раскрыт в этой публикации. Однако раскрытие касается получения эмульсионного состава из одного типа пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, и WO 2015/060235 не раскрывает какой-либо состав эмульсии, содержащий 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, согласно настоящему изобретению. Следовательно, первая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить эмульсионный состав w/o, который стабильно содержит 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL.

[0007]

При приготовлении эмульсионного состава, содержащего 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, по настоящему изобретению в соответствии со стандартным способом получения эмульсии, процедура получения занимает много времени, приготовление может закончиться неудачей, и у работников возникнут сложности в клинических условиях, например, в больницах, где эмульсионные составы должны быть приготовлены в момент использования, и они не сталкивались с такими проблемами. Авторы настоящего изобретения приготовили эмульсионный состав, содержащий 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, по настоящему изобретению, в соответствии со стандартным способом получения эмульсии, и обнаружили эти проблемы. Соответственно, вторая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ эффективного получения эмульсионного состава w/o, описанного выше.

[Средства для достижения целей]

[0008]

Автор настоящего изобретения провел направленные исследования для достижения вышеуказанных целей. В результате изобретатель обнаружил, что эмульсионный состав может быть эффективно приготовлен за короткий период времени путем поэтапного смешивания водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, с масляной фазой, содержащей масляный адъювант. Таким образом, изобретателю удалось получить композицию эмульсии w/o, стабильно содержащую 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, что привело к завершению настоящего изобретения.

[0009]

Настоящее изобретение относится к пп. [1] по [13] ниже.

[1] Эмульсионный состав вода-в-масле (w/o), содержащий 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, каждый из которых имеет 4 пептидных эпитопа CTL, связанных через линкеры, в водной фазе.

[2] Эмульсионный состав вода-в-масле по п. [1], который содержит 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, и масляный адъювант.

[3] Эмульсионный состав вода-в-масле по п. [1] или [2], который получают путем смешивания водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, и масляной фазы, содержащей масляный адъювант, и эмульгирования смеси, при этом водная фаза, содержащая пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, представляет собой раствор, содержащий 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL: пептид, представленный формулой (I); пептид, представленный формулой (II); и пептид, представленный формулой (III):

A-(L)-B-(L)-C-(L)-PEP2 (I);

D-(L)-E-(L)-F-(L)-PEP4 (II); и

G-(L)-H-(L)-I-(L)-PEP10 (III),

в формулах (I), (II) и (III),

(L) представляет собой линкер;

PEP2 представляет собой пептидный эпитоп CTL, представленный SEQ ID NO: 2;

PEP4 представляет собой пептидный эпитоп CTL, представленный SEQ ID NO: 4;

PEP10 представляет собой пептидный эпитоп CTL, представленный SEQ ID NO: 10;

A, B, C, D, E, F, G, H и I, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из пептидного эпитопа CTL, представленного SEQ ID NO: 1 (PEP1), пептидного эпитопа CTL, представленного SEQ ID NO: 5 (PEP5), пептидного эпитопа CTL, представленного SEQ ID NO: 6 (PEP6), пептидного эпитопа CTL, представленного SEQ ID NO: 7 (PEP7), пептидного эпитопа CTL, представленного SEQ ID NO: 8 (PEP8), пептидного эпитопа CTL, представленного SEQ ID NO: 9 (PEP9), пептидного эпитопа CTL, представленного SEQ ID NO: 13 (PEP13), пептидного эпитопа CTL, представленного SEQ ID NO: 15 (PEP15), и пептидного эпитопа CTL, представленного SEQ ID NO: 18 (PEP18) (за исключением комбинации из A, представляющего PEP7, и B, представляющего PEP8); и

пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, представленные формулами (I), (II) и (III), каждый может иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот.

[4] Эмульсионный состав по п. [3], где в формулах (I), (II) и (III) (L) представляет собой линкер; A, B и C, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из PEP7, PEP8 и PEP13 (за исключением комбинации из A, представляющего PEP7, и B, представляющего PEP8); D, E и F, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из PEP5, PEP6 и PEP9; и G, H и I, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из PEP1, PEP15 и PEP18, и пептид, представленный формулой (I), может иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот.

[5] Эмульсионный состав по п. [3] или [4], где пептид, представленный формулой (I), выбирают из группы, состоящей из:

PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2;

PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2; и

PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2,

пептид, представленный формулой (II), выбирают из группы, состоящей из:

PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4; и

PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4 и

пептид, представленный формулой (III), выбирают из группы, состоящей из:

PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10; и

PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10 и

пептид, представленный формулой (I), может иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот на N-конце.

[6] Эмульсионный состав по любому из пп. [3]-[5], где в формулах (I), (II) и (III) (L) представляет собой димер аргинина; и пептидная последовательность, состоящая из гидрофильных аминокислот, представляет собой тетрамер аргинина.

[7] Эмульсионный состав по любому из пп. [3]-[6], где 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, представленных формулами (I), (II) и (III), представляют собой RRRR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2 (SEQ ID NO: 19), PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 (SEQ ID NO: 25) и PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10 (SEQ ID NO: 33).

[8] Способ получения эмульсионного состава по любому из пп. [1]-[7], включающий стадии (i) и (ii):

(i) стадию введения части водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, в масляную фазу, содержащую масляный адъювант, для получения смеси; и

(ii) стадию, позволяющую смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами, соединенными через соединительное устройство,

где стадия (i) и стадия (ii) повторяются для получения эмульсионного состава, включающего общее количество масляной фазы и водной фазы.

[9] Способ по п. [8], где количество части водной фазы составляет от 1/10 до 1/2 по объему относительно количества масляной фазы, содержащей масляный адъювант.

[10] Устройство, используемое для получения эмульсионного состава вода-в-масле, содержащего пептиды, которое состоит из:

второго шприца 2;

соединительного устройства 5, соединенного со вторым шприцем 2;

трехходового крана 4, соединенного с соединительным устройством 5; и

первого шприца 1 и третьего шприца 3, дополнительно соединенных с трехходовым краном 4,

при этом устройство позволяет получать эмульсионный состав вода-в-масле путем добавления водной фазы, находящейся в третьем шприце 3, к масляной фазе, находящейся в первом шприце 1 или втором шприце 2, и позволяя полученной смеси совершать возвратно-поступательное движение между первым шприцем 1 и вторым шприцем 2 через соединительное устройство 5.

[11] Устройство по п. [10], где объемы первого, второго и третьего шприцев составляют каждый 3 мл или меньше.

[12] Устройство по п. [10] или [11], где внутренний диаметр соединительного устройства 5, через которое проходит смесь, находится в диапазоне от 0,8 до 1,7 мм.

[13] Набор, используемый для получения эмульсии w/o, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, который включает пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, каждый из которых содержит 4 пептидных эпитопа CTL, связанных через линкеры, масляный адъювант и устройство по любому из пп. [10]-[12].

[0010]

Настоящее изобретение также относится к следующим аспектам.

[14] Способ лечения опухоли у пациента, включающий введение пациенту эмульсионного состава вода-в-масле (w/o) по любому из пп. [1]-[7].

[15] Эмульсионный состав вода-в-масле (w/o) по любому из пп. [1]-[7] для применения при лечении опухоли.

[16] Использование раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, при производстве эмульсионного состава вода-в-масле (w/o) по любому из пп. [1]-[7].

[17] Устройство по любому из пп. [10]-[12] или набор по п. [13], который используется для получения эмульсионного состава вода-в-масле (w/o) для лечения опухоли в момент использования.

[18] Устройство по любому из пп. [10]-[12] или набор по п. [13], где эмульсионный состав вода-в-масле (w/o) представляет собой состав по любому из пп. [1]-[7].

[19] Способ лечения опухоли у пациента, включающий:

(a) приготовление эмульсионного состава по любому из пп. [1]-[7] путем выполнения стадии (i) и стадии (ii):

(i) стадию введения части водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, в масляную фазу, содержащую масляный адъювант, для получения смеси; и

(ii) стадию, позволяющую смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами, соединенными через соединительное устройство, и

повторение стадии (i) и стадии (ii) для получения эмульсионного состава, включающего общее количество масляной фазы и водной фазы; и

(b) введение полученного эмульсионного состава пациенту с опухолью.

Это описание включает часть или все содержание, раскрытое в описании и/или чертежах заявки на патент Японии № 2018-207779, которая является приоритетным документом настоящей заявки.

Эффекты изобретения

[0011]

Согласно способу настоящего изобретения пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, смешивают с масляным адъювантом поэтапно, так что стабильный эмульсионный состав w/o может быть эффективно получен в течение короткого периода времени.

[Краткое описание чертежей]

[0012]

На фиг.1 схематично показано устройство, которое может быть подходящим образом использовано для получения эмульсионного состава согласно настоящему изобретению, в котором жидкость может перемещаться между первым шприцем 1, соединительным устройством 5 и вторым шприцем 2, но не может перемещаться в третий шприц 3 или из него. Стрелка указывает направление движения жидкости.

На фиг.2 схематично показано устройство, которое можно подходящим образом использовать для получения эмульсионного состава согласно настоящему изобретению, в котором жидкость может перемещаться между первым шприцем 1 и третьим шприцем 3, но не может перемещаться во второй шприц 2 или из него и соединительное устройство 5. Стрелка указывает направление движения жидкости.

На фиг.3 показана корреляция между количеством возвратно-поступательных движений в шприцах во время основного эмульгирования, когда эмульсионный состав готовится способом разведенного получения (A: 0 повторов; B: 10 повторов; C: 20 повторов: D: 30 повторов; E: 60 повторов) и размер частиц полученных эмульсий.

На фиг.4 показана корреляция между числом возвратно-поступательных движений в шприцах во время основного эмульгирования, когда эмульсии приготовлена способом получения эмульсии с использованием трехходового крана, и размером частиц полученных эмульсий.

На фиг.5 показана однородность размера частиц эмульсионного состава w/o, полученного способом по настоящему изобретению.

[Варианты осуществления изобретения]

[0013]

<Эмульсионный состав вода-в-масле (w/o)>

Настоящее изобретение относится к эмульсионному составу типа вода-в-масле (w/o), включающему 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, каждый из которых содержит 4 пептидных эпитопа CTL, связанных через линкеры, в водной фазе. Более конкретно, настоящее изобретение относится к эмульсионному составу w/o, содержащему 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, каждый из которых содержит 4 пептидных эпитопа CTL, связанных через линкеры, и масляный адъювант.

[0014]

В настоящем изобретении «пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL» означает пептид в виде единой молекулы, содержащей 4 пептида, каждый из которых выбирают из пептидных эпитопов CTL, полученных из одинаковых и/или разных молекул опухолевых антигенов, линейно связанных через линкеры.

[0015]

В настоящем изобретении эмульсионный состав может быть получен путем смешивания раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, с масляным адъювантом и эмульгирования полученной смеси. Эмульсионный состав по настоящему изобретению может использоваться как стабильный эмульсионный состав w/o.

[0016]

Примеры известных пептидных эпитопов CTL, полученных из молекул опухолевых антигенов, включают следующие пептиды:

KLVERLGAA (SEQ ID NO: 1; именуется в настоящем документе «PEP1», например, WO 200/11044);

ASLDSDPWV (SEQ ID NO: 2; именуется в настоящем документе «PEP2», например, WO 2002/010369);

ALVEFEDVL (SEQ ID NO: 3; именуется в настоящем документе «PEP3», например, WO 2002/010369);

LLQAEAPRL (SEQ ID NO: 4; именуется в настоящем документе «PEP4», например, WO 2000/12701);

DYSARWNEI (SEQ ID NO: 5; именуется в настоящем документе «PEP5», например, JP H11-318455 A);

VYDYNCHVDL (SEQ ID NO: 6; именуется в настоящем документе «PEP6», например, WO 2000/12701);

LYAWEPSFL (SEQ ID NO: 7; именуется в настоящем документе «PEP7», например, JP 2003-000270 A);

DYLRSVLEDF (SEQ ID NO: 8; именуется в настоящем документе «PEP8», например, WO 2001/011044);

QIRPIFSNR (SEQ ID NO: 9; именуется в настоящем документе «PEP9», например, WO 2008/007711);

ILEQSGEWWK (SEQ ID NO: 10; именуется в настоящем документе «PEP10», например, WO 2009/022652);

VIQNLERGYR (SEQ ID NO: 11; именуется в настоящем документе «PEP11», например, WO 2009/022652);

KLKHYGPGWV (SEQ ID NO: 12; именуется в настоящем документе «PEP12», например, WO 1999/067288);

RLQEWCSVI (SEQ ID NO: 13; именуется в настоящем документе «PEP13», например, WO 2002/010369);

ILGELREKV (SEQ ID NO: 14; именуется в настоящем документе «PEP14», например, WO 2002/010369);

DYVREHKDNI (SEQ ID NO: 15; именуется в настоящем документе «PEP15», например, WO 2005/071075);

HYTNASDGL (SEQ ID NO: 16; именуется в настоящем документе «PEP16», например, WO 2001/011044);

NYSVRYRPGL (SEQ ID NO: 17; именуется в настоящем документе «PEP17», например, JP 2003-000270 A); а также

RYLTQETNKV (SEQ ID NO: 18; именуется в настоящем документе «PEP18», например, WO 2005/116056).

[0017]

В таблице 1 представлена информация о белках, из которых происходят пептидные эпитопы CTL от PEP1 до PEP18. Опубликовано, что эти белки экспрессируются на высоком уровне в опухолевой ткани.

[0018]

[Таблица 1]

[0019]

Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно используемый в настоящем изобретении, представляет собой пептид, содержащий 4 типа пептидных эпитопов CTL, выбранных из конкретных 13 типов пептидных эпитопов CTL: пептида «PEP1», представленного SEQ ID NO: 1, пептида «PEP2», представленного SEQ ID NO: 2, пептида «PEP4», представленного SEQ ID NO: 4, пептида «PEP5», представленного SEQ ID NO: 5, пептида «PEP6», представленного SEQ ID NO: 6, пептида «PEP7», представленного SEQ ID NO: 7, пептида «PEP8», представленного SEQ ID NO: 8, пептида «PEP9», представленного SEQ ID NO: 9, пептида «PEP10», представленного SEQ ID NO: 10, пептида «PEP13», представленного SEQ ID NO: 13, пептида «PEP15», представленного SEQ ID NO: 15, пептида «PEP17», представленного SEQ ID NO: 17, и пептида «PEP18», представленного SEQ ID NO: 18, линейно связанных через линкеры. Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, может индуцировать и/или активировать три или более CTL, специфичных к соответствующим пептидным эпитопам CTL. Пептиды не могут быть напрямую оценены относительно эпитоп-пептид-специфической индукции CTL. Возникновение эпитоп-пептид-специфической индукции CTL можно определить с помощью эксперимента по расщеплению с иммунопротеасомами (например, WO 2015/060235).

[0020]

В настоящем изобретении пептид, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую замену, вставку, делецию и/или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 или PEP18, и обладающий способностью индуцировать CTL и/или способностью индуцировать продукцию иммуноглобулина, которая эквивалентна или более высокая, чем у исходного пептида, можно использовать в качестве «пептидного эпитопа CTL». Термин «множество», используемый в настоящем документе, относится к 2 или 3, и, предпочтительно, к 2. Примером такого пептида является пептид, полученный заменой аминокислотами, имеющими свойства, аналогичные свойствам исходной аминокислоты (т.е. пептид, полученный заменой консервативной аминокислотой).

[0021]

Является ли представляющий интерес пептид «пептидом, обладающим способностью индуцировать CTL и/или способностью индуцировать продукцию иммуноглобулина, которая эквивалентна или более высокая, чем у исходного пептида», можно определить в соответствии, например, со способом, раскрытым в WO 2015/060235. Согласно способу, раскрытому в WO 2015/060235, способность индуцировать CTL оценивается с использованием в качестве индикатора количества клеток, продуцирующих IFN-β, в лунках, содержащих: клетки, полученные от мыши, которой тестируемый пептид, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую замену, вставку, делецию и/или добавление одной или множества аминокислот, был введен заранее; антигенпредставляющие клетки, полученные от мыши той же линии, и тестируемый пептид. Когда результат оценки эквивалентен или превышает значение Δ исходного пептида (положительный: 10≤Δ<100; умеренно положительный: 100≤Δ<200; строго положительный: 200≤Δ), то представляющий интерес пептид может быть описан, как имеющий способность индуцировать CTL на эквивалентном или более высоком уровне, чем исходный пептид. Когда исходный пептид оценивается как «положительный», и пептид, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую замену, вставку, делецию и/или добавление одной или нескольких аминокислот, также оценивается как «положительный», способность индуцировать CTL считается эквивалентной. Способность индуцировать продукцию иммуноглобулинов оценивают с использованием в качестве индикатора титр антител IgG, специфичных к CTL-эпитопу, в сыворотке мыши, которой вводили тестируемый пептид. Когда увеличение титра полученных антител IgG (кратность) эквивалентно или выше увеличения у исходного пептида (2<кратность<10, 10<кратность<100, 100<кратность), то представляющий интерес пептид может быть описан, как имеющий способность индуцировать продукцию иммуноглобулина на эквивалентном или более высоком уровне, чем исходный пептид. Когда результат измерения для исходного пептида находится в диапазоне «2<кратность<10», и результат измерения пептида, имеющего аминокислотную последовательность, имеющую замену, вставку, делецию и/или добавление одной или множество аминокислот, также находится в диапазоне «2<кратность<10», способность индуцировать продукцию иммуноглобулинов считается эквивалентной.

[0022]

В настоящем изобретении можно использовать любой линкер при условии, что он расщепляется при введении пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, в организм, и что связанные пептидные эпитопы CTL могут быть отделены друг от друга. Их примеры включают сложноэфирную связь, эфирную связь, амидную связь, сахарную цепь, полиэтиленгликольный линкер и аминокислотный линкер. Примеры аминокислотных последовательностей, используемых в качестве аминокислотных линкеров, включают димер аргинина (RR), тример аргинина (RRR), тетрамер аргинина (RRRR), димер лизина (KK), тример лизина (KKK), тетрамер лизина (KKKK), димер глицина (GG), тример глицина (GGG), тетрамер глицина (GGGG), пентамер глицина (GGGGG), гексамер глицина (GGGGGG), аланин-аланин-тирозин (AAY), изолейцин-лейцин-аланин (ILA) и аргинин-валин-лизин-аргинин (RVKR), причем димер (RR) или тример (RRR) аргинина являются предпочтительными, а димер аргинина (RR) более предпочтительным. Линкеры, используемые для пептида из связанных эпитопов известны в данной области, и специалист в данной области может использовать адекватно выбранный линкер.

[0023]

Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, который предпочтительно используется в настоящем изобретении, может дополнительно иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот. Пептидная последовательность, состоящая из гидрофильных аминокислот, может быть добавлена на N-конце и/или C-конце пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, и, предпочтительно, ее добавляют на N-конец. Такая пептидная последовательность может содержать от 1 до 15, предпочтительно, от 2 до 10 и, более предпочтительно, от 3 до 5 гидрофильных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аргинина, гистидина, лизина, треонина, тирозина, серина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Примеры таких пептидных последовательностей, состоящих из гидрофильных аминокислот, включают тример аргинина (RRR), тетрамер аргинина (RRRR), тример лизина (KKK), тетрамер лизина (KKKK), тример гистидина (HHH) и тетрамер гистидина (HHHH), причем тример аргинина (RRR) или тетрамер (RRRR) являются предпочтительными, а тетрамер аргинина (RRRR) является более предпочтительным.

[0024]

Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно используемый в настоящем изобретении, представляет собой пептид, содержащий 4 пептида, каждый из которых выбран из группы, состоящей из: пептида «PEP1», представленного SEQ ID NO: 1, пептида «PEP2», представленного SEQ ID NO: 2, пептида «PEP4», представленного SEQ ID NO: 4, пептида «PEP5», представленного SEQ ID NO: 5, пептида «PEP6», представленного SEQ ID NO: 6, пептида «PEP7», представленного SEQ ID NO: 7, пептида «PEP8», представленного SEQ ID NO: 8, пептида «PEP9», представленного SEQ ID NO: 9, пептида «PEP10», представленного SEQ ID NO: 10, пептида «PEP13», представленного SEQ ID NO: 13, пептида «PEP15», представленного SEQ ID NO: 15, пептида «PEP17», представленного SEQ ID NO: 17, и пептида «PEP18», представленного SEQ ID NO: 18, связанных через линкеры; который может иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот, и признак, выбранный из (1)-(3) ниже:

(1) пептид содержит PEP2 на С-конце, за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных через линкер в таком порядке от N-конца;

(2) пептид содержит PEP4 на С-конце; и

(3) пептид содержит PEP10 на С-конце.

[0025]

Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, который предпочтительно используется в настоящем изобретении, представляет собой пептид, содержащий 4 уникальных пептида, выбранных из группы, состоящей из: пептида «PEP1», представленного SEQ ID NO: 1, пептида «PEP2», представленного SEQ ID NO: 2, пептида «PEP4», представленного SEQ ID NO: 4, пептида «PEP5», представленного SEQ ID NO: 5, пептида «PEP6», представленного SEQ ID NO: 6, пептида «PEP7», представленного SEQ ID NO: 7, пептида «PEP8», представленного SEQ ID NO: 8, пептида «PEP9», представленного SEQ ID NO: 9, пептида «PEP10», представленного SEQ ID NO: 10, пептида «PEP13», представленного SEQ ID NO: 13, пептида «PEP15», представленного SEQ ID NO: 15, пептида «PEP17», представленного SEQ ID NO: 17, и пептида «PEP18», представленного SEQ ID NO: 18, связанных через линкеры; который могут иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот, и который имеет признак, выбранный из (1)-(3) ниже:

(1) пептид содержит 3 пептидных эпитопа CTL, выбранных из PEP1, PEP7, PEP8 и PEP13, и содержит PEP2 на С-конце, за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных через линкер в таком порядке от N-конца;

(2) пептид содержит 3 пептидных эпитопа CTL: PEP5, PEP6 и PEP9, и содержит PEP4 на С-конце; и

(3) пептид содержит 3 пептидных эпитопа CTL, выбранных из PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 и PEP18, и содержит PEP10 на С-конце.

[0026]

Более предпочтительно, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно используемый в настоящем изобретении, включает последовательность, выбранную из следующих последовательностей, которые могут иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот, где «-(L)-» представляет собой линкер:

PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2;

PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2;

PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10;

PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10; и

PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10.

[0027]

В пептиде, имеющем 4 связанных эпитопа CTL, который предпочтительно используется в настоящем изобретении, более предпочтительно, линкер, представленный (L) в приведенной выше последовательности, представляет собой аминокислотный линкер, и пептид может иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот.

[0028]

В пептиде, имеющем 4 связанных эпитопа CTL, который предпочтительно используется в настоящем изобретении, более предпочтительно, линкер, представленный (L) в приведенной выше последовательности, представляет собой димер или тример аргинина, содержащий 2 или 3 остатка аргинина, связанных друг с другом, и пептид может иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот.

[0029]

В пептиде, имеющем 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно используемом в настоящем изобретении, более предпочтительно, линкер, представленный (L) в приведенной выше последовательности, представляет собой димер или тример аргинина, содержащий 2 или 3 остатка аргинина, связанных друг с другом, и пептид может иметь пептидную последовательность, состоящую из тримера или тетрамера аргинина, содержащего 3 или 4 связанных остатка аргинина, на N-конце в качестве гидрофильных аминокислот.

[0030]

Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно используемый в настоящем изобретении, может быть синтезирован, например, в соответствии со способом, раскрытым в WO 2015/060235.

[0031]

В настоящем изобретении раствор пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, используемый для получения эмульсионного состава, содержит 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL.

[0032]

Когда эмульсионный состав содержит 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL в настоящем изобретении, предпочтительно, 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, состоят из пептида, представленного формулой (I), пептида, представленного формулой (II) и пептида, представленного формулой (III):

A-(L)-B-(L)-C-(L)-PEP2 (I);

D-(L)-E-(L)-F-(L)-PEP4 (II); и

G-(L)-H-(L)-I-(L)-PEP10 (III),

где (L) представляет собой линкер; и A, B, C, D, E, F, G, H и I, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из PEP1, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP13, PEP15 и PEP18 (за исключением комбинации из A, представляющего PEP7, и B, представляющего PEP8); и

каждый пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, может иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот.

[0033]

3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, которые более предпочтительно используются в настоящем изобретении, состоят из пептида, представленного формулой (I), пептида, представленного формулой (II), и пептида, представленного формулой (III), где (L) представляет собой линкер,

пептид, представленный формулой (I), выбирают из группы, состоящей из следующего:

PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2;

PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2; и

PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2,

пептид, представленный формулой (II), выбирают из группы, состоящей из следующего:

PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4; и

PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4 и

пептид, представленный формулой (III), выбирают из группы, состоящей из следующего:

PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10; и

PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10.

Пептид, представленный формулой (I), представляет собой пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, которые могут иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот на N-конце и/или C-конце.

[0034]

3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, которые более предпочтительно используются в настоящем изобретении, состоят из пептида, представленного формулой (I), пептида, представленного формулой (II), и пептида, представленного формулой (III), где (L) представляет собой линкер,

пептид, представленный формулой (I), выбирают из группы, состоящей из следующего:

PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2;

PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2; и

PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2,

пептид, представленный формулой (II), выбирают из группы, состоящей из следующего:

PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4; и

PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4 и

пептид, представленный формулой (III), выбирают из группы, состоящей из следующего:

PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10; и

PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10, и

где пептид, представленный формулой (I), имеет в качестве пептидной последовательности, состоящей из гидрофильных аминокислот, тример или тетрамер аргинина на N-конце.

[0035]

Более предпочтительная комбинация 3 типов пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, используемых в настоящем изобретении, состоит из RRRR-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2, PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4 и PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10, где (L) представляет собой линкер.

[0036]

Наиболее предпочтительная комбинация 3 типов пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, используемых в настоящем изобретении, состоит из RRRR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2 (SEQ ID NO: 19), PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 (SEQ ID NO: 25) и PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10 (SEQ ID NO: 33).

[0037]

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, состоят из:

пептида, представленного формулой (I'): A-RR-B-RR-C-RR-PEP2;

пептида, представленного формулой (II'): D-RR-E-RR-F-RR-PEP4; и

пептида, представленного формулой (III'): G-RR-H-RR-I-RR-PEP10,

где RR представляет собой димер аргинина; и A, B, C, D, E, F, G, H и I, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из PEP1, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP13, PEP15 и PEP18 (за исключением комбинации из A, представляющего PEP7, и B, представляющего PEP8), и

один из пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, представленных формулами (I'), (II') или (III'), имеет тетрамер аргинина на N-конце.

[0038]

3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, которые более предпочтительно использовать в настоящем изобретении, состоят из пептида, представленного формулой (I') выше, пептида, представленного формулой (II') выше, и пептида, представленного формулой (III') выше,

пептид, представленный формулой (I'), выбирают из группы, состоящей из следующего:

RRRR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2 (SEQ ID NO: 19);

RRRR-PEP8-RR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP2 (SEQ ID NO: 20);

RRRR-PEP8-RR-PEP13-RR-PEP7-RR-PEP2 (SEQ ID NO: 21);

RRRR-PEP13-RR-PEP7-RR-PEP8-RR-PEP2 (SEQ ID NO: 22); и

RRRR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP7-RR-PEP2 (SEQ ID NO: 23),

пептид, представленный формулой (II'), выбирают из группы, состоящей из следующего:

PEP5-RR-PEP6-RR-PEP9-RR-PEP4 (SEQ ID NO: 24);

PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 (SEQ ID NO: 25);

PEP6-RR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP4 (SEQ ID NO: 26);

PEP6-RR-PEP9-RR-PEP5-RR-PEP4 (SEQ ID NO: 27);

PEP9-RR-PEP5-RR-PEP6-RR-PEP4 (SEQ ID NO: 28); и

PEP9-RR-PEP6-RR-PEP5-RR-PEP4 (SEQ ID NO: 29), и

пептид, представленный формулой (III'), выбирают из группы, состоящей из следующего:

PEP1-RR-PEP15-RR-PEP18-RR-PEP10 (SEQ ID NO: 30);

PEP1-RR-PEP18-RR-PEP15-RR-PEP10 (SEQ ID NO: 31);

PEP15-RR-PEP1-RR-PEP18-RR-PEP10 (SEQ ID NO: 32);

PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10 (SEQ ID NO: 33);

PEP18-RR-PEP1-RR-PEP15-RR-PEP10 (SEQ ID NO: 34); и

PEP18-RR-PEP15-RR-PEP1-RR-PEP10 (SEQ ID NO: 35),

где RR представляет собой димер аргинина; и RRRR представляет собой тетрамер аргинина.

[0039]

В настоящем изобретении водная фаза, содержащая пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, может представлять собой раствор, содержащий 3 типа лиофилизированных пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, растворенных солюбилизатором. При лиофилизации пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, можно добавлять трегалозу или другие эксципиенты. Таким образом, водная фаза, содержащая пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, может содержать трегалозу или другие эксципиенты. В качестве раствора можно использовать раствор для инъекций. Примеры включают растворитель для инъекций и физиологический раствор, причем растворитель для инъекций является предпочтительным. Концентрация 3 типов пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, в водной фазе в целом составляет, предпочтительно, от 3 до 27 мг/мл, более предпочтительно, от 6 до 18 мг/мл, еще более предпочтительно, от 7 до 12 мг/мл и, еще более предпочтительно, 9 мг/мл.

[0040]

Эмульсионный состав вода-в-масле (w/o), содержащий пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению в водной фазе, содержит всего в отношении 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно, от 3 до 27 мг, более предпочтительно, от 6 до 18 мг, еще более предпочтительно, от 7 до 12 мг и, еще более предпочтительно, 9 мг на дозу.

[0041]

Средний размер частиц эмульсии типа вода-в-масле (w/o), содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению в водной фазе, предпочтительно, составляет от 1 до 3 мкм. Более предпочтительно, средний размер частиц составляет от 1 до 3 мкм, предпочтительно, чтобы 90% или более, более предпочтительно, 95% или более и, еще более предпочтительно, 99% или более частиц в эмульсионном составе имели диапазон размеров частиц от 1 до 3 мкм.

[0042]

Вязкость эмульсионного состава типа вода-в-масле (w/o), содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению в водной фазе, особо не ограничивается и предпочтительно составляет от 200 до 400 мПа∙с.

[0043]

В настоящем изобретении масляный адъювант особо не ограничивается при условии, что он образует эмульсию типа «вода/масло» при смешивании с водной фазой и эмульгировании, и что это масляный иммуноадъювант, который можно вводить в форме эмульсии и усиливать иммунный ответ. Примеры масляных адъювантов включают адъювант, состоящий из масляного компонента, и адъювант, содержащий масляный компонент и поверхностно-активное вещество. Примеры масляных адъювантов, предпочтительно используемых в настоящем изобретении, включают жидкий парафин, ланолин, сквален, неполный адъювант Фрейнда, полный адъювант Фрейнда, NH₂ (Cancer Sci., 101 (10): 2110-2114, 2010), Montanide ISA 720 VG и Montanide ISA 51 VG. В настоящем изобретении особенно предпочтительным масляным адъювантом является Montanide ISA 51 VG, который доступен, например, от SEPPIC.

[0044]

Масляный адъювант можно использовать отдельно в качестве масляной фазы для получения эмульсии или можно использовать в форме смеси с другими масляными компонентами и/или поверхностно-активным веществом, чтобы служить масляной фазой. Например, вышеупомянутый Montanide ISA 51 VG можно использовать отдельно в качестве масляной фазы для получения эмульсионного состава w/o.

[0045]

При приготовлении эмульсии w/o антиген, растворенный в водной фазе, может оставаться в месте введения в течение длительного периода времени. Кроме того, антиген защищен масляной фазой, так что он может быть защищен от ферментативной деградации. Кроме того, антиген, заключенный в каплю воды данного размера или больше, с большей вероятностью будет фагоцитирован иммуноцитом, чем антиген сам по себе, и его иммуногенность может быть повышена. Такие свойства не могут быть достигнуты с эмульсией типа "масло в воде", и поэтому очень важно приготовить противораковую вакцину по настоящему изобретению в форме эмульсии вода-в-масле.

[0046]

При приготовлении эмульсионного состава по настоящему изобретению количество масляной фазы, содержащей масляный адъювант, предпочтительно составляет от 0,5 до 2 по объему от количества и, более предпочтительно, эквивалентно количеству водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL.

[0047]

<Способ получения эмульсии вода-в-масле>

Настоящее изобретение также относится к способу получения эмульсионного состава по настоящему изобретению, включающему стадии (i) и (ii):

(i) стадию введения части водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, в масляную фазу, содержащую масляный адъювант, для получения смеси; и

(ii) стадию, позволяющую смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами, соединенными через соединительное устройство,

где стадия (i) и стадия (ii) повторяются для получения эмульсионного состава, включающего общее количество масляной фазы и водной фазы.

[0048]

В настоящем изобретении количество «части» предпочтительно составляет от 1/10 до 1/2 по объему, более предпочтительно, от 1/10 до 2/5 по объему, еще более предпочтительно, от 1/10 до 1/5 по объему и, наиболее предпочтительно, 1/5 по объему относительно количества масляной фазы, содержащей масляный адъювант. Когда количество масляного адъюванта составляет 1 мл, например, «часть» «водной фазы, включающей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL», предпочтительно составляет от 0,1 до 0,4 мл, более предпочтительно, от 0,1 до 0,2 мл и, наиболее предпочтительно, 0,2 мл.

[0049]

Используемый в настоящем документе термин «основное эмульгирование» относится к операции эмульгирования, которая проводится после смешивания общего количества масляной фазы и общего количества водной фазы. Термин «предварительное эмульгирование» относится к операции эмульгирования, которая проводится в каждом случае смешивания части водной фазы с общим количеством масляной фазы. Операция эмульгирования, которая выполняется после заключительной операции такого смешивания водной фазы с общим количеством масляной фазы, рассматривается как «основное эмульгирование», поскольку общее количество масляной фазы было смешивается с общим количеством водной фазы.

[0050]

Эмульсионный состав по настоящему изобретению может быть получен способом, раскрытым, например, в WO 2007/083763. Однако согласно общепринятой стандартной методике получения эмульсии предварительное эмульгирование можно проводить только встряхиванием шприца. Соответственно, наиболее предпочтительно, чтобы эмульсионный состав по настоящему изобретению был приготовлен с использованием устройства по настоящему изобретению в соответствии со способом по настоящему изобретению, описанным ниже.

[0051]

В частности, эмульсионный состав по настоящему изобретению может быть приготовлен, позволяя смеси масляной фазы, содержащей масляный адъювант, и водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, взаимодействовать между 2 шприцами, соединенными через соединительное устройство с узким каналом (например, имеющим внутренний диаметр: 0,8-1,7 мм) для эмульгирования смеси (включая предварительное эмульгирование и основное эмульгирование). Примером такого соединительного устройства является соединительное устройство GP (Nipro Corporation).

[0052]

При выполнении преэмульгирования и основного эмульгирования в настоящем изобретении смесь масляной фазы, содержащей масляный адъювант, и водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, могут взаимодействовать между шприцами, соединенными через соединительное устройство, например 10 раз или больше, 20 раз или больше, 30 раз или больше, 40 раз или больше, 50 раз или больше или 60 раз. С точки зрения эффективности работы число возвратно-поступательных движений во время предварительного эмульгирования, предпочтительно, составляет от 10 до 20, и, более предпочтительно, 10. Число возвратно-поступательных движений во время основного эмульгирования, предпочтительно, составляет от 10 до 20.

[0053]

В настоящем изобретении способ получения эмульсионного состава w/o, содержащего пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, включает следующие стадии:

(i) стадию введения части водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, в масляную фазу, содержащую масляный адъювант, для получения смеси; и

(ii) стадию, позволяющую смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами, соединенными через соединительное устройство.

[0054]

Например, описанный выше способ включает следующие стадии (i) и (ii):

(i) стадию введения части водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, в масляную фазу, содержащую масляный адъювант, для получения смеси; и

(ii) стадию, позволяющую смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами, соединенными через соединительное устройство,

где стадия (i) и стадия (ii) повторяются для получения эмульсионного состава, включающего общее количество масляной фазы и водной фазы.

[0055]

В таком случае количество части водной фазы может составлять, предпочтительно, от 1/10 до 1/2 по объему, более предпочтительно, от 1/10 до 2/5 по объему, еще более предпочтительно от 1/10 до 1/5 по объему и, наиболее предпочтительно, по объему относительно количества масляной фазы, содержащей масляный адъювант.

[0056]

Стадия (i) и стадия (ii) могут повторяться от 2 до 10 раз, предпочтительно, от 3 до 7 раз и, более предпочтительно, 5 раз.

[0057]

Способ получения эмульсионного состава w/o, содержащего пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно, включает следующие стадии (i) и (ii):

(i) стадию введения части водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, в масляную фазу, содержащую масляный адъювант, поэтапно в количестве, составляющем 1/5 по объему от масляной фазы, и повторение такого введения в общем 5 раз для получения смеси; и

(ii) стадию, позволяющую смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами, соединенными через соединительное устройство, в каждом случае введения.

[0058]

Способ получения эмульсионного состава w/o, содержащего пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, более предпочтительно, включает следующие стадии (i)-(iv):

(i) стадию введения водной фазы, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, в масляную фазу, содержащую масляный адъювант, в количестве 1/5 по объему от масляной фазы, для получения смеси;

(ii) стадию, позволяющую смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами, соединенными через соединительное устройство, 10 или более раз после введения;

(iii) стадию повторения стадии (i) и стадии (ii) еще 4 раза; и

(iv) стадию, позволяющую смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами, соединенными через соединительное устройство, 10 или более раз.

[0059]

Способ получения эмульсионного состава w/o, содержащего пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, более предпочтительно, включает следующие стадии (i)-(iv):

(i) стадию введения раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, в Montanide ISA 51 VG в количестве, составляющем 1/5 по объему от количества Montanide ISA 51 VG, для получения смеси;

(ii) стадию, позволяющую смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами, соединенными через соединительное устройство, 10 или более раз после введения;

(iii) стадию повторения стадии (i) и стадии (ii) еще 4 раза; и

(iv) стадию, позволяющую смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами, соединенными через соединительное устройство, 10 или более раз.

[0060]

Способ получения эмульсионного состава пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно, включает дополнительную стадию подтверждения типа полученной эмульсии с помощью капельного теста. В настоящем изобретении капельный тест включает падение капли полученной эмульсии на поверхность воды, чтобы подтвердить, диспергируется ли упавшая капля эмульсии или нет. Когда эмульсия не сразу диспергируется в воде в капельном тесте, приготовленная эмульсия может быть определена как «эмульсия вода-в-масле (w/o)». Когда эмульсия немедленно диспергируется в воде, приготовленную эмульсию можно определить как «эмульсию масло-в-воде (o/w))». В настоящем изобретении необходимо получить эмульсию w/o.

[0061]

<Устройство>

В настоящем изобретении устройство, которое может быть предпочтительно использовано для получения эмульсионного состава пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, включает, например, трехходовой кран, 2 шприца и соединительное устройство, соединенное с трехходовым краном, и шприцы подсоединены к соединительному устройству, который соединено с трехходовым краном.

[0062]

Как описано выше, эмульсионный состав должен быть приготовлен на момент использования использования, и массовое производство не подходит из-за того, что его нужно вводить в небольшом количестве. Таким образом, эмульсионный состав, предпочтительно, готовят с использованием шприца объемом в несколько мл, такого как шприц для инъекций. В прошлом был известен способ получения такого эмульсионного состава, включающий использование устройства, содержащего 2 шприца, соединенных друг с другом через соединительное устройство (WO 2007/083763; патент Японии № 5629882).

[0063]

Эмульсионный состав по настоящему изобретению может быть приготовлен с использованием обычного устройства, как описано выше. Однако при использовании обычного устройства предварительное эмульгирование может быть выполнено только встряхиванием шприца, и на результаты предварительного эмульгирования может легко повлиять способ или сила встряхивания. Соответственно, исходя только из времени, трудно определить, было ли выполнено достаточное встряхивание для предварительного эмульгирования. Кроме того, было ли проведено достаточное предварительное эмульгирование или нет, определяется человеком, который приготовил эмульсию, на основе его/ее субъективного мнения. Соответственно, при приготовлении эмульсии разными людьми будут наблюдаться различия, а также различия будут наблюдаться при каждом случае получения одним и тем же человеком.

[0064]

Кроме того, при использовании обычного устройства процедура получения занимает много времени, приготовление стабильной эмульсии w/o может не получиться, и у работников возникнут сложности в клинических условиях, например, в больницах, где эмульсионные составы должны быть приготовлены в момент использования. Такие недостатки желательно устранить.

С этой целью авторы настоящего изобретения обнаружили, что способ настоящего изобретения может быть легко реализован путем подключения через трехходовой кран третьего шприца к 2 шприцам, соединенным друг с другом, для получения эмульсионного состава в момент использования.

[0065]

Устройство, предпочтительно используемое в способе настоящего изобретения, включает, как показано на фиг.1, первый шприц 1, второй шприц 2, соединенный с первым шприцем 1 через соединительное устройство 5, и третий шприц 3, дополнительно соединенный с первым шприцем 1 и вторым шприцем 2 через трехходовой кран 4.

[0066]

В частности, настоящее изобретение относится к устройству, используемому для получения эмульсионного состава w/o, содержащего пептиды, которое состоит из:

второго шприца 2;

соединительного устройства 5, соединенного со вторым шприцем 2;

трехходового крана 4, соединенного с соединительным устройством 5; и

первого шприца 1 и третьего шприца 3, дополнительно соединенных с трехходовым краном 4,

при этом устройство позволяет получать эмульсионный состав w/o путем добавления водной фазы, находящейся в третьем шприце 3, к масляной фазе, находящейся в первом шприце 1 или втором шприце 2, и позволяя полученной смеси перемещаться между первым шприцем 1 и вторым шприцем 2 через соединительное устройство 5.

[0067]

Хотя объемы первого, второго и третьего шприцев особо не ограничиваются, например, каждый объем предпочтительно доводят до 3 мл или меньше с точки зрения простоты работы во время получения. Как описано выше, эмульсионный состав w/o по настоящему изобретению обычно приготавливают в момент использования. Таким образом, его количество, которое необходимо приготовить перед введением, невелико, и необходимость в массовом производстве незначительна.

В устройстве по настоящему изобретению внутренний диаметр соединительного устройства 5, через который проходит смесь, предпочтительно составляет от 0,8 до 1,7 мм.

[0068]

Способ получения с использованием такого устройства может давать эффекты, описанные ниже.

(1) Согласно обычному способу получения эмульсии, предварительное эмульгирование выполняли встряхиванием шприца, и, таким образом, условия смешивания водной фазы с масляной фазой, вероятно, варьировались между примерами получения. В соответствии с настоящим изобретением, напротив, эмульсия может проходить через соединительное устройство с узким внутренним диаметром во время предварительного эмульгирования в дополнение к времени основного эмульгирования, которое обеспечивает усилие сдвига, и изменение условий смешивания водной фазы с масляной фазой становится небольшим между случаями получения.

(2) каналы для жидкости могут переключаться с помощью введения трехходового запорного крана, водная фаза разделяется на части, каждая часть отдельно вводится в масляную фазу, реализуется условие повышенного содержания масла, и может производиться предварительное эмульгирование с помощью возвратно-поступательного движения поршня шприца.

[0069]

Площадь поперечного сечения (пунктирная линия B на фиг.1 и 2) внутри цилиндра шприца, который может использоваться для устройства по настоящему изобретению, предпочтительно, в 2-150 раз и, более предпочтительно, в 2-50 раз больше площади поперечного сечения (пунктирная линия A на фиг. 1 и 2) канала для жидкости в соединительном устройстве. Площадь поперечного сечения внутри цилиндра шприца должна быть по меньшей мере в 2 раза больше, чем площадь поперечного сечения канала для жидкости в соединительном устройстве, в противном случае эффекты, описанные выше, могут не проявиться на должном уровне. Площадь поперечного сечения внутри цилиндра шприца не должна превышать более чем в 150 раз площадь поперечного сечения канала для жидкости в соединительном устройстве, в противном случае на шприц, устройство и т.п. может быть приложено чрезмерное напряжение.

[0070]

Более конкретно, площадь поперечного сечения внутри цилиндра шприца может составлять приблизительно от 50 до 500 мм², а площадь поперечного сечения канала для жидкости в соединительном устройстве может составлять приблизительно от 0,5 до 30 мм². Хотя форма поперечного сечения цилиндра шприца или соединительного устройства особо не ограничивается, предпочтительна круглая, овальная или приблизительно круглая многоугольная форма, чтобы предотвратить поверхностное напряжение, причем круглая форма особенно предпочтительна. Термин «площадь поперечного сечения», используемый в настоящем документе, относится к площади поперечного сечения внутри цилиндра шприца или площади поперечного сечения самой узкой области канала для жидкости, сформированного в соединительном устройстве.

[0071]

Соединительное устройство, используемое в настоящем изобретении, должно находиться в тесном контакте со шприцем на его кончике. Как показано на фиг. 1 и 2, соответственно, наконечник 6 соединительного устройства может иметь поперечное сечение, конусообразно увеличивающееся от канала для жидкости в середине.

[0072]

Когда поперечное сечение канала для жидкости соединителя шприца выполнено круглым, внутренний диаметр канала для жидкости составляет, предпочтительно, от 0,8 до 1,7 мм и, более предпочтительно, от 0,9 до 1,5 мм. Когда толщина канала для жидкости неоднородна, внутренний диаметр самой узкой области считается внутренним диаметром канала для жидкости. Длина канала для жидкости в соединительном устройстве предпочтительно составляет от 10 до 15 мм. Примером такого соединительного устройства является соединительное устройство GP (Nipro Corporation).

[0073]

Медицинские работники могут управлять устройством вручную, например, перед введением эмульсионного состава. В качестве альтернативы, устройство может представлять собой автоматизированное устройство, которое сконструировано в соответствии с технологией в данной области техники, как описано, например, в патенте Японии № 5629882, чтобы содержать фиксирующий механизм, фиксирующий первый, второй и третий шприцы, первый, второй и третий толкающие механизмы, толкающие поршни первого, второго и третьего шприцев, соответственно, и механизм управления, управляющий такими толкающими механизмами.

[0074]

Другой аспект настоящего изобретения может относиться к набору, используемому для получения эмульсии w/o, содержащей пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, которая содержит пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, каждый из которых содержит 4 пептидных эпитопа CTL, связанных через линкеры, масляный адъювант и аппарат, описанный выше.

[0075]

Опухоли-мишени, подлежащие лечению у пациента, которому вводят эмульсионный состав по настоящему изобретению, особо не ограничены при условии, что противоопухолевые эффекты могут быть усилены. Опухоли-мишени, предпочтительно, представляют собой опухоли, в отношении которых пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, оказывают противоопухолевое действие, и, более предпочтительно, Lck-, WHSC2-, SART2-, SART3-, MRP3-, UBE2V-, EGFR- или PTHrP-положительные злокачественные опухоли.

[0076]

Конкретные примеры опухолей-мишеней, подлежащих лечению с использованием эмульсионного состава по настоящему изобретению, включают опухоль мозга, рак головы и шеи, рак пищеварительной системы (например, рак пищевода, рак желудка, рак двенадцатиперстной кишки, рак печени, рак желчных протоков. (например, рак желчного пузыря и рак желчных протоков), рак поджелудочной железы, рак тонкого кишечника, рак толстого кишечника (например, колоректальный рак, рак толстой кишки и рак прямой кишки) и стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта), рак легких (например, немелкоклеточный рак легких и мелкоклеточный рак легких), рак груди, рак яичников, рак матки (например, рак шейки матки и рак тела матки), рак почек, уротелиальный рак (например, рак мочевого пузыря, рак почечной лоханки и мочеточника), рак простаты, рак кожи и рак с неизвестной первичной формой. Рак включает первичный рак и рак, метастазирующий в другие органы (например, в печень). С точки зрения противоопухолевого действия предпочтительными мишенями являются рак головы и шеи, рак пищеварительной системы, рак легких, рак почек, уротелиальный рак и рак кожи, более предпочтительными мишенями являются рак пищеварительной системы, рак легких, уротелиальный рак и рак кожи, и особенно предпочтительными мишенями являются рак легких и уротелиальный рак. Противоопухолевый агент по настоящему изобретению может использоваться для послеоперационной адъювантной химиотерапии, проводимой для предотвращения рецидивов после хирургической резекции опухоли, или предоперационной адъювантной химиотерапии, проводимой перед хирургической резекцией опухоли.

[0077]

В настоящем изобретении эмульсионный состав w/o, содержащий пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, может включать фармацевтические носители, при необходимости, в дополнение к пептидам, имеющим 4 связанных эпитопа CTL, в качестве действующих ингредиентов, и может вводиться в форме инъекции.

[0078]

Примеры фармацевтических носителей включают различные типы носителей, которые обычно используются для лекарственных средств, такие как эксципиент, растворитель, солюбилизатор, суспендирующий агент, изотонический агент, модификатор pH, буфер, стабилизатор и смягчающее средство. При необходимости также могут использоваться добавки, такие как консервант, антиоксидант, краситель и ароматизатор.

[0079]

Примеры эксципиентов включают лактозу, сахарозу, D-маннит и трегалозу.

[0080]

Примеры растворителей включают воду, пропиленгликоль и физиологический раствор.

[0081]

Примеры солюбилизаторов включают полиэтиленгликоль, этанол, αα-циклодекстрин, макрогол 400 и полисорбат 80.

[0082]

Примером суспендирующего агента является касторовое масло, гидрированное полиоксиэтиленом.

[0083]

Примеры изотонических агентов включают хлорид натрия, глицерин и хлорид калия.

[0084]

Примеры модификаторов pH включают цитрат натрия, гидроксид натрия и соляную кислоту.

[0085]

Примеры буферов включают гидрофосфат динатрия и дигидрофосфат натрия.

[0086]

Примеры антиоксидантов включают сульфит натрия, аскорбиновую кислоту, природный витамин Е и метионин.

[0087]

Эмульсионный состав по настоящему изобретению вводят в форме инъекции, предпочтительно, внутривенно. Количество каждого типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, которые должны быть включены в стандартную дозированную форму, составляет, предпочтительно, от 1 до 9 мг, более предпочтительно, от 2 до 4,5 мг и, наиболее предпочтительно, 3 мг.

[0088]

Суточная доза каждого типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, в лекарственной форме, описанной выше, варьируется в зависимости от симптомов, веса тела, возраста, пола и других параметров пациента, и ее нельзя указать в общем. Суточная доза составляет, предпочтительно, от 1 до 27 мг на человека, более предпочтительно, от 2 до 12 мг на человека и, еще более предпочтительно, от 3 до 9 мг на человека. Введение предпочтительно проводить один или два или три раза в день.

[0089]

Схема введения пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, может быть адекватно определена в соответствии с типом рака, стадией заболевания и другими состояниями.

Введение предпочтительно планировать таким образом, чтобы оно включало цикл общей продолжительностью 21 день, в котором стадия одного введения в неделю повторяется 3 раза (один раз в день в день 1, день 8 и день 15). После третьего цикла введение предпочтительно планировать таким образом, чтобы оно включало цикл общей продолжительностью 21 день, в котором введение лекарственного средства в день 1 сопровождается перерывом на 20 дней (однократное введение раз в 3 недели).

[Примеры]

[0090]

Далее настоящее изобретение описывается более подробно со ссылкой на примеры. Следует отметить, что нижеследующие примеры включают использование устройства определенной конструкции, и что настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

[0091]

В нижеследующих примерах раствор пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, содержит в качестве пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, три типа пептидов, состоящих из пептида, представленного SEQ ID NO: 19, пептида, представленного SEQ ID NO: 25, и пептида, представленного SEQ ID NO: 33, каждый в количестве 3 мг/мл, если не указано иное.

[0092]

[Пример 1: исследование числа разделенных смешиваний водной фазы с масляной фазой во время предварительного эмульгирования]

Эмульсия w/o была приготовлена с использованием соединительного устройства GP (внутренний диаметр: 1,0 мм; длина канала для жидкости: 15 мм, Nipro Corporation) в соответствии со стандартным методом получения эмульсии, описанным в инструкциях к соединительному устройству GP.

[0093]

В частности, были приготовлены шприцы, каждый из которых был заполнен 1 мл раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, и Montanide ISA 51 VG (SEPPIC) (шприцы Injekt, 2 мл, Luer Lock, B. Braun), и шприцы были соединены друг с другом через соединительное устройство GP, предотвращая попадание воздуха. Общее количество раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL (водная фаза), вводили в шприц, содержащий Montanide ISA 51 VG (масляная фаза) (без разделения), и шприцы энергично встряхивали в течение приблизительно 5-10 минут, выполняя предварительное эмульгирование. Преэмульгирование прекращали, когда в растворе не наблюдали никаких капель прозрачной воды или капель масла и получали гомогенную мутную жидкость белого цвета.

[0094]

После этого было выполнено основное эмульгирование для получения эмульсии w/o путем попеременного толкания поршней шприца, чтобы смесь могла совершать возвратно-поступательное движение между шприцами 60 раз. Приготовление эмульсии выполняли 5 раз, и степень полученной эмульсии w/o определяли капельным тестом. Когда полученная эмульсия сразу не диспергировалась в воде, тестируемую эмульсию оценивали как «эмульсию вода-в-масле(w/o)». Когда приготовленная эмульсия сразу диспергировалась в воде, тестируемую эмульсию оценивали как «эмульсия масло-в-воде (o/w)».

[0095]

Как показано в таблице 2, было обнаружено, что степень образования эмульсии w/o, содержащей раствор пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, полученного стандартным методом получения эмульсии, составляет 0%, и было обнаружено, что очень трудно приготовить эмульсию w/o, содержащую раствор пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, стандартным способом получения эмульсии.

[0096]

Для решения проблем, описанных выше, был исследован способ, в котором раствор пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL (водная фаза), был разделен и смешан с Montanide ISA 51 VG (масляная фаза) (способ разделенного получения). В стандартном способе получения эмульсии, в частности, раствор пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL (водная фаза), делили на 3 или 5 частей, части вводили отдельно в шприц, содержащий Montanide ISA 51 VG (масляная фаза), и шприц энергично встряхивали для выполнения предварительного эмульгирования. Преэмульгирование прекращали, когда в жидкости не наблюдали никаких капель прозрачной воды или капель масла и получали гомогенную мутную жидкость белого цвета (шприц энергично встряхивали в течение приблизительно 5-10 минут на одну операцию предварительного эмульгирования).

[0097]

После этого было выполнено основное эмульгирование для получения эмульсии w/o путем попеременного толкания поршней шприца, чтобы смесь могла совершать возвратно-поступательное движение между шприцами 60 раз. Приготовление эмульсии выполняли 5 раз по отдельности, и скорость получения эмульсии w/o определяли капельным тестом.

[0098]

[Таблица 2]

[0099]

Как показано в таблице 2, степень получения эмульсии w/o была увеличена путем деления раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL (водная фаза), на 3 части во время преэмульгирования, а степень получения эмульсии w/o была значительно увеличена путем деления раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL (водная фаза), на 5 частей по сравнению со случаем, в котором раствор не делили. Было обнаружено, что предпочтительным является, чтобы водная фаза была разделена на большее количество частей и вводилась в масляную фазу для получения эмульсии вода/масло; то есть эмульсию w/o можно приготовить в условиях повышенного содержания масла.

[0100]

[Пример 2: приготовление эмульсии путем разделенного введения раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL]

В способе разделения раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, на 5 частей и их раздельного введения в масляную фазу, описанном в примере 1, число людей и число попыток получения эмульсий были увеличены, и была исследована степень получения эмульсии w/o. Чтобы уменьшить вариабельность между примерами предварительного эмульгирования, шприцы энергично встряхивали с использованием YS-8D (Yayoi Co., Ltd.) для предварительного эмульгирования. Когда предварительное эмульгирование выполнялось вручную большим количеством людей, как показано в таблице 3, степень получения эмульсии w/o составила 74%. Напротив, когда предварительное эмульгирование выполняли с использованием машины, было обнаружено, что степень получения эмульсии w/o составила 63%. Причина, по которой эмульсия w/o не могла быть получена с определенной степенью успеха, когда количество людей и количество попыток для получения эмульсий были увеличены, рассматривается следующим образом. А именно, энергичное встряхивание шприцев во время предварительного эмульгирования должно быть прекращено, когда «будет получена однородная белая мутная жидкость», и решение должно быть принято на основе субъективного мнения человека, который приготовил эмульсию. Таким образом, считается, что получаемая эмульсия варьирует в зависимости от способа или силы встряхивания шприцев человеком, который приготовил эмульсию.

[0101]

[Таблица 3]

[0102]

[Пример 3: приготовление эмульсии с использованием трехходового крана]

Как описано в примере 1, было обнаружено, что предварительное эмульгирование предпочтительно проводить в условиях повышенного содержания масла. Согласно стандартному методу получения эмульсии или простому методу разделенного получения, предварительное эмульгирование может быть выполнено только встряхиванием шприцев даже в условиях повышенного содержания масла. Таким образом, на результаты легко может повлиять способ или сила встряхивания, как описано выше. Когда предварительное эмульгирование выполнялось автоматически с использованием машины в способе разделенного получения, доля полученной эмульсии w/o составляла приблизительно 60%. Это указывает на то, что желательно дальнейшее улучшение.

Для того чтобы решить проблемы, описанные выше, и увеличить степень получения эмульсии w/o, был разработан способ получения эмульсии, связанный с использованием трехходового запорного крана.

[0103]

Для способа получения эмульсии, включающего использование трехходового крана, были подготовлены пустой первый шприц 1, второй шприц 2, заполненный 1 мл Montanide ISA 51 VG, и третий шприц 3, заполненный 1 мл раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL (Injekt Syringes, 2 мл, Luer Lock, B. Braun). Используемое устройство включает пустой первый шприц 1, соединенный в горизонтальном направлении с трехходовым краном 4 (TS-TR2K, Terumo Corporation), второй шприц 2, наполненный Montanide ISA 51 VG, непосредственно соединенный в горизонтальном направлении с трехходовым краном 4 через соединительное устройство 5 (соединительное устройство GP, Nipro Corporation), чтобы позволить Montanide ISA 51 VG мигрировать из второго шприца 2 в первый шприц 1, а третий шприц 3 заполнен раствором пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, соединенный в вертикальном направлении с трехходовым краном 4, как показано на фиг. 1.

[0104]

При предварительном эмульгировании кран трехходового крана 4 работал так, как показано на фиг.2, чтобы позволить жидкости перемещаться между первым шприцем 1 и третьим шприцем 3, и 0,2 мл раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, находящегося в третьем шприце 3, вводили в первый шприц 1, наполненный Montanide ISA 51 VG.

[0105]

Затем кран приводился в действие для реализации условий, показанных на фиг. 1, чтобы позволить жидкости перемещаться между первым шприцем 1 и вторым шприцем 2, поршень первого шприца 1 и поршень второго шприца 2 поочередно вводили в соответствующий шприц, и смеси из 0,2 мл раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, и 1 мл Montanide ISA 51 VG позволяли совершать возвратно-поступательное движение в горизонтальном направлении между первым шприцем 1 и вторым шприцем 2 через соединительное устройство 5 (предварительное эмульгирование). При предварительном эмульгировании смеси позволяли 20 раз перемещаться между шприцами.

[0106]

Описанную выше операцию повторяли еще 3 раза, вводя каждый раз по 0,2 мл раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, в первый шприц 1 из третьего шприца 3. Раствор пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL (по 0,2 мл каждый раз), вводили в первый шприц 1 из третьего шприца 3, эту операцию повторяли 5 раз, и смеси раствора пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, и 1 мл Montanide ISA 51 VG давали возможность совершать 60 раз возвратно-поступательные движения в горизонтальном направлении между первым шприцем 1 и вторым шприцем 2 через соединительное устройство 5 (основное эмульгирование). Была ли получена эмульсия w/o, определялось капельным тестом. Полученная эмульсия является эмульсией типа «вода-в-масле (w/o)» по капельному тесту.

[0107]

[Пример 4: проверка числа возвратно-поступательных движений шприцев при преэмульгировании]

Чтобы дополнительно оптимизировать способ получения эмульсии с использованием трехходового крана, было исследовано количество перемешиваний, которые необходимо выполнить при предварительном эмульгировании. Способ получения эмульсии с использованием трехходового крана выполняли с использованием устройства, которое использовалось в примере 3, таким же образом, как и в примере 3, за исключением количества возвратно-поступательных движений между шприцами во время предварительного эмульгирования.

[0108]

В способе, описанном выше, эмульсию готовили, позволяя смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами 10, 15 или 20 раз за одну операцию предварительного эмульгирования.

[0109]

Когда смеси давали возможность совершать возвратно-поступательное движение между шприцами от 10 до 20 раз во время предварительного эмульгирования, эмульсия сразу не диспергировалась в воде, и поэтому была получена эмульсия типа w/o. Результаты демонстрируют, что эффективность работы может быть улучшена, если позволить смеси совершать возвратно-поступательное движение между шприцами с использованием трехходового крана во время предварительного эмульгирования, по сравнению с предварительным эмульгированием, выполняемым путем энергичного встряхивания шприцев при стандартном методе получения эмульсии.

[0110]

[Пример 5: проверка числа возвратно-поступательных движений шприцев при основном эмульгировании]

Проверяли количество возвратно-поступательных движений между шприцами, которые необходимо повторить при основном эмульгировании после предварительного эмульгирования, как это было выполнено в примере 4, в котором смеси давали возможность совершать возвратно-поступательное движение 10 раз. В частности, смеси давали возможность совершать возвратно-поступательное движение между шприцами 10, 20 или 30 раз при основном эмульгировании и исследовали образование эмульсии. Для сравнения исследовали количество возвратно-поступательных движений между шприцами, которые должны быть повторены при основном эмульгировании в способе разделенного получения (число разделенных перемешиваний при предварительном эмульгировании, выполненных в примере 1, составляло 5).

Получение эмульсии w/o определялось капельным тестом. Размеры частиц эмульсий, приготовленных путем смешивания заданное количество раз, измеряли с использованием анализатора распределения частиц по размерам во влажном/сухом состоянии LS 13 320 (Beckman Coulter) (способ лазерной дифракции).

[0111]

Условия измерения показаны ниже.

Используемый модуль: универсальный жидкостный модуль (измерение диаметра влажных частиц)

Среда диспергирования: минеральное масло, светло-белое

Показатель преломления дисперсионной среды: 1,45

Ультразвуковая дисперсия: нет

Способ получения образца: каплю эмульсии сначала диспергировали в 10 мл минерального масла светло-белого цвета.

[0112]

Согласно способу получения эмульсии с использованием трехходового крана, была получена эмульсия w/o, сразу не диспергирующаяся в воде, независимо от количества возвратно-поступательных движений между шприцами во время основного эмульгирования. В соответствии со способом разделенного получения капельный тест проводили только тогда, когда смеси позволяли совершать возвратно-поступательное движение между шприцами 60 раз при основном эмульгировании, и было подтверждено, что была получена эмульсия w/o.

[0113]

Как показано на фиг. 3, изменение размеров частиц полученных эмульсий наблюдалось, когда количество возвратно-поступательных движений между шприцами составляло 20 или меньше при основном эмульгировании в соответствии со способом разделенного получения. Напротив, было обнаружено, что однородный и приблизительно одинаковый размер частиц может быть достигнут, когда смеси дают возможность совершать возвратно-поступательное движение между шприцами 30 раз или более. Согласно способу получения эмульсии с использованием трехходового крана, как показано на фиг. 4, однородный и приблизительно одинаковый размер частиц был достигнут, когда число возвратно-поступательных движений составляло 10 или более.

[0114]

[Пример 6: исследование воспроизводимости способа получения эмульсии с использованием трехходового крана]

Согласно способу получения эмульсии с использованием трехходового крана в примере 5, эмульсия была приготовлена в условиях, в которых количество возвратно-поступательных движений между шприцами было установлено 20 во время основного эмульгирования, были измерены размер частиц и вязкость полученной эмульсии, и была исследована воспроизводимость при попытках получения.

[0115]

Размер частиц измеряли таким же образом, как в примере 5, а вязкость измеряли в условиях, описанных ниже.

Используемый аппарат: вискозиметр типа E (TOKYO KEIKI In.)

Конус: 1°34'

Количество пробы: приблизительно 1 мл

Температура измерения: 30°C

Число оборотов: 10 об/мин

[0116]

Как показано на фиг. 5, размер частиц эмульсий, полученных в 3 случаях получения, был однородным и приблизительно одинаковым, и размер частиц находился в диапазоне от 1 до 3 мкм. Как показано в таблице 4, также не наблюдалось значительного изменения вязкости эмульсий, полученных в 3 попытках получения.

[0117]

[Таблица 4]

[0118]

[Пример 7: способ получения эмульсии с использованием трехходового крана]

В условиях примера 6 количество людей и количество примеров получения эмульсий были увеличены, и была исследована степень получения эмульсий w/o. Как показано в таблице 5, было обнаружено, что количество полученных эмульсий w/o составило 98%.

[0119]

[Таблица 5]

[0120]

Приведенные выше результаты демонстрируют, что было очень трудно получить эмульсионный состав w/o, содержащий 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, по настоящему изобретению, стандартным способом получения эмульсии. В отличие от этого, эмульсия w/o была получена, когда раствор пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL (водная фаза), был разделен на части, и части поочередно вводили в масляную фазу, содержащую масляный адъювант, при смешивании водной фазы с масляной фазой (т.е. способ разделенного получения). Согласно способу получения эмульсии с использованием трехходового крана, кроме того, эмульсия w/o была получена с более высокой частотой. Кроме того, по сравнению со стандартным способом получения эмульсии или стандартным способом разделенного получения эмульсия w/o может быть получена с меньшими усилиями за более короткий период времени.

[Описание цифровых ссылок]

[0121]

1: Первый шприц

2: Второй шприц

3: Третий шприц

4: Трехходовой кран

5: Соединительное устройство

6: Наконечник соединительного устройства

Все цитируемые в настоящем документе публикации, патенты и заявки на патенты полностью включены в настоящий документ путем ссылки.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD.

<120> ЭМУЛЬСИОННЫЙ СОСТАВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

<130> PH-8112-PCT

<150> JP 2018-207779

<151> 2018-11-02

<160> 35

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala Ala

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ala Leu Val Glu Phe Glu Asp Val Leu

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 6

Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 7

Leu Tyr Ala Trp Glu Pro Ser Phe Leu

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 8

Asp Tyr Leu Arg Ser Val Leu Glu Asp Phe

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 9

Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 10

Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 11

Val Ile Gln Asn Leu Glu Arg Gly Tyr Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 12

Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp Val

1 5 10

<210> 13

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 13

Arg Leu Gln Glu Trp Cys Ser Val Ile

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 14

Ile Leu Gly Glu Leu Arg Glu Lys Val

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 15

Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile

1 5 10

<210> 16

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 16

His Tyr Thr Asn Ala Ser Asp Gly Leu

1 5

<210> 17

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 17

Asn Tyr Ser Val Arg Tyr Arg Pro Gly Leu

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 18

Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val

1 5 10

<210> 19

<211> 47

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 19

Arg Arg Arg Arg Leu Tyr Ala Trp Glu Pro Ser Phe Leu Arg Arg Arg

1 5 10 15

Leu Gln Glu Trp Cys Ser Val Ile Arg Arg Asp Tyr Leu Arg Ser Val

20 25 30

Leu Glu Asp Phe Arg Arg Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val

35 40 45

<210> 20

<211> 47

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 20

Arg Arg Arg Arg Asp Tyr Leu Arg Ser Val Leu Glu Asp Phe Arg Arg

1 5 10 15

Leu Tyr Ala Trp Glu Pro Ser Phe Leu Arg Arg Arg Leu Gln Glu Trp

20 25 30

Cys Ser Val Ile Arg Arg Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val

35 40 45

<210> 21

<211> 47

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 21

Arg Arg Arg Arg Asp Tyr Leu Arg Ser Val Leu Glu Asp Phe Arg Arg

1 5 10 15

Arg Leu Gln Glu Trp Cys Ser Val Ile Arg Arg Leu Tyr Ala Trp Glu

20 25 30

Pro Ser Phe Leu Arg Arg Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val

35 40 45

<210> 22

<211> 47

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 22

Arg Arg Arg Arg Arg Leu Gln Glu Trp Cys Ser Val Ile Arg Arg Leu

1 5 10 15

Tyr Ala Trp Glu Pro Ser Phe Leu Arg Arg Asp Tyr Leu Arg Ser Val

20 25 30

Leu Glu Asp Phe Arg Arg Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val

35 40 45

<210> 23

<211> 47

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 23

Arg Arg Arg Arg Arg Leu Gln Glu Trp Cys Ser Val Ile Arg Arg Asp

1 5 10 15

Tyr Leu Arg Ser Val Leu Glu Asp Phe Arg Arg Leu Tyr Ala Trp Glu

20 25 30

Pro Ser Phe Leu Arg Arg Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val

35 40 45

<210> 24

<211> 43

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 24

Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn

1 5 10 15

Cys His Val Asp Leu Arg Arg Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg

20 25 30

Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu

35 40

<210> 25

<211> 43

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 25

Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile Arg Arg Gln Ile Arg Pro Ile

1 5 10 15

Phe Ser Asn Arg Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu

20 25 30

Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu

35 40

<210> 26

<211> 43

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 26

Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu Arg Arg Asp Tyr Ser Ala

1 5 10 15

Arg Trp Asn Glu Ile Arg Arg Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg

20 25 30

Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu

35 40

<210> 27

<211> 43

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 27

Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu Arg Arg Gln Ile Arg Pro

1 5 10 15

Ile Phe Ser Asn Arg Arg Arg Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile

20 25 30

Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu

35 40

<210> 28

<211> 43

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 28

Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg Arg Arg Asp Tyr Ser Ala Arg

1 5 10 15

Trp Asn Glu Ile Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu

20 25 30

Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu

35 40

<210> 29

<211> 43

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 29

Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn

1 5 10 15

Cys His Val Asp Leu Arg Arg Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile

20 25 30

Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu

35 40

<210> 30

<211> 45

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 30

Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala Ala Arg Arg Asp Tyr Val Arg Glu

1 5 10 15

His Lys Asp Asn Ile Arg Arg Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys

20 25 30

Val Arg Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys

35 40 45

<210> 31

<211> 45

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 31

Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala Ala Arg Arg Arg Tyr Leu Thr Gln

1 5 10 15

Glu Thr Asn Lys Val Arg Arg Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn

20 25 30

Ile Arg Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys

35 40 45

<210> 32

<211> 45

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 32

Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Arg Arg Lys Leu Val Glu

1 5 10 15

Arg Leu Gly Ala Ala Arg Arg Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys

20 25 30

Val Arg Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys

35 40 45

<210> 33

<211> 45

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 33

Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Arg Arg Arg Tyr Leu Thr

1 5 10 15

Gln Glu Thr Asn Lys Val Arg Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala

20 25 30

Ala Arg Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys

35 40 45

<210> 34

<211> 45

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 34

Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val Arg Arg Lys Leu Val Glu

1 5 10 15

Arg Leu Gly Ala Ala Arg Arg Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn

20 25 30

Ile Arg Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys

35 40 45

<210> 35

<211> 45

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 35

Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val Arg Arg Asp Tyr Val Arg

1 5 10 15

Glu His Lys Asp Asn Ile Arg Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala

20 25 30

Ala Arg Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys

35 40 45

<---