Результат интеллектуальной деятельности: Искусственный ген, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецептор-связующего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_SC2, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2

Изобретение относится к искусственному гену, кодирующему бицистронную структуру, образованную последовательностями рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, P2A-пептидом и гликопротеином G вируса везикулярного стоматита, рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей экспрессию указанного искусственного гена и рекомбинантному штамму вируса везикулярного стоматита, экспрессирующему антигены коронавируса SARS-CoV-2, индуцирующему специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2 и используемому для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и может быть использовано в биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине.

Известно решение по патенту (US, 20190062785 A1, МПК A61K 39/215, A61K 39/205; C12N15/86, опубл. 28.02.2019 г.), где описана вакцина на основе рекомбинантного вируса бешенства, которая обеспечивает защиту против бешенства и тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV). Транскрипционная кассета локализована в межгенном регионе N и P, что гарантирует высокий уровень экспрессии трансгена за счет особенностей организации генома рабдовирусов. В патенте раскрыты основные существующие подходы дизайна целевых коронавирусных иммуногенов/антигенов, такие как полноразмерный гликопротеин S, вариант с усеченным цитоплазматическим доменом (Δ19), а также рецептор-связывающий домен RBD с трансмембранным регионом и цитоплазматическим доменом вируса бешенства.

Однако использование данного вектора осложнено остаточной нейровирулентностью и возможными побочными эффектами. В тоже время использование функционального гликопротеина S коронавирусов в качестве иммуногена может привести к созданию рекомбинантного вируса бешенства, обладающего двойной тропностью за счет экспонированных вирусных гликопротеинов. Недостатком данного решения также является использование антигенов вируса SARS-CoV, что, вероятно, не позволит сформировать противовирусный иммунитет против нового коронавируса SARS-CoV-2.

Известно иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С'-конце гена (RU, 2720614, МПК A61K39/215; A61P31/12, опубл. 12.05.2020 г.), или последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1, или их комбинации.

Однако показано, что использование векторов на основе циркулирующих в человеческой популяции агентов (аденовирусы, герпесвирусы, респираторно-синцитиальный вирус и т.д.) может быть осложнено наличием специфического иммунитета против вируса «дикого типа», в результате чего не будет происходить достаточного продуктивного инфицирования клеток рекомбинантным вирусом, и как следствие, не будет эффективно обеспечена экспрессия целевого трансгена.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является решение по патенту (CN, 111088283 A, МПК A61K 39/215; A61P 31/14; C12N 15/86; опубл. 01.05.2020 г.), где предложены вирусные векторы на основе аттенуированного вируса везикулярного стоматита, в котором химерный ген гетерологичного антигена локализован между генами G и L. В патенте также раскрываются классические подходы дизайна целевых коронавирусных иммуногенов/антигенов (кодон-оптимизация, полноразмерный S (Spike), RBD). В патенте раскрывается подход получения химерных поверхностных гликопротеинов вируса везикулярного стоматита, с целью индукции иммунитета на коронавирусный компонент.

Недостатком данного решения является дизайн иммуногенов в виде N- и C-концевых слитых белков, что может сказаться на фолдинге коронавирусных антигенных компонентов и инфекционном титре рекомбинантного вируса. Предлагаемая строгая локализация трансгена в геноме вируса (между генами G и L, фактически 5-ая транскрипционная кассета, начиная с 3'-конца генома), не позволяет в полной мере контролировать транскрипционный уровень трансгена. Также нерешенным остается вопрос стабильности целевых трансгенов в составе РНК-содержащих вирусов, что может повлечь снижение иммуногенных/антигенных свойств и/или изменение тропизма и вирулентных свойств рекомбинантных вирусов.

Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке новых рекомбинантных вакцин от коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2).

Раскрытие изобретения

Целью заявленного изобретения является создание рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, обеспечивающего экспрессию антигенов коронавируса SARS-CoV-2, и индуцирующего специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2.

Техническим результатом является улучшение фолдинга и повышение инфекционного титра рекомбинантного вируса, стабильности целевого трансгена, и иммуногенных/антигенных свойств заявляемого рекомбинантного вируса.

Указанный технический результат достигается созданием искусственного гена, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, кодирующего искусственный белок-иммуноген, представляющий собой бицистронную структуру, состоящую из последовательностей рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, гетерологического сигнального пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, линкера, P2A-пептида для расщепления полипротеина во время трансляции, и гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1), предотвращающей альтернативную инициацию трансляции, представленных в SEQ ID NO: 1 длиной 2355 п.н.

Указанный технический результат достигается также созданием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, используемой для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, имеющей молекулярную массу 8,85⋅10⁶ дальтон, размер 14309 п.н. и содержащей в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2 целевой ген по п. 1, кодирующий искусственный белок-иммуноген RBD гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и находящийся под контролем вирусного промотора, обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих и состоящая из следующих фрагментов:

- ORI - (ORI, origin of replication) точка начала репликации плазмидного вектора pUC (координаты 13483- 14071 п.н.);

- AmpR - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику ампициллину (координаты 12452-13312 п.н.);

- T7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага T7, необходимая для транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 166-183 п.н.);

- T7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага T7, необходимая для терминации транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 12224-12330 п.н.);

- HDV-Rbz - нуклеотидная последовательность рибозима HDV, которая после транскрибирования отщепляется с формированием аутентичной 3'-концевой некодирующей последовательности (координаты 12137-12219 п.н.);

- N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты 247-1515 п.н.);

- P - открытая рамка считывания гена P (фосфопротеин) (координаты 1579-2376 п.н.);

- L - открытая рамка считывания гена L (РНК-зависимая РНК-полимераза) (координаты 5708-12037 п.н.);

- VSV-G - открытая рамка считывания гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1) (координаты 3322-4032 п.н.);

- P2A - 2A-пептид тешовируса-1, обеспечивающий расщепление полипротеина на этапе трансляции (координаты 4033-4089 п.н.);

- Signal peptide - сигнальный пептид гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, обеспечивающий эффективный внутриклеточный транспорт синтезируемого полипротеина (координаты 3268-3321 п.н.);

- Spike protein - фрагмент гена S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 3322-4032 п.н.);

- Receptor-binding domain (RBD) - рецептор-связывающий домен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 3334-4002 п.н.).

Указанный технический результат достигается также созданием штамма rVSV-Stbl_RBD_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, полученный с использованием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2 по п. 2, обеспечивающего независимый синтез коронавирусного антигена (рецептор-связывающего домена гликопротеина S SARS-CoV-2) и белка G вируса везикулярного стоматита, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и депонированного в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под № V-984.

Существенными отличиями от прототипа, обеспечивающими достижение технического результата, являются:

1. Оптимизация искусственного гена посредством нормализации кодонного состава и исключение из последовательности элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии и стабильности мРНК;

2. Использование гетерологичного сигнального пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, необходимого для эффективного внутриклеточного транспорта синтезируемого полипротеина;

3. Использование P2A-пептида для формирования бицистронной структуры для независимого синтеза и фолдинга коронавирусного антигена (рецептор-связывающий домен гликопротеина S SARS-CoV-2) и необходимого для репродукции вируса гликопротеина G вируса везикулярного стоматита;

4. Внесение мутации M(1)>P(1) в открытую рамку считывания гликопротеина G в составе искусственного гена, необходимой для предотвращения альтернативной инициализации трансляции необходимого для репродукции вируса гликопротеина.

Осуществление изобретения

Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами. На фиг. 1 приведена схема клонирования нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих конструкционные варианты гликопротеина S и RBD в плазмидном векторе для обратной генетики вируса везикулярного стоматита pStem-rVSV_P2A_G. На фиг. 2 изображена схема конструкции рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, используемой для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2.

На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1) искусственного гена, кодирующего искусственный белок-иммуноген рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, линкером и P2A-пептидом для расщепления полипротеина во время трансляции, гликопротеином G с мутацией M(1)>P(1).

На фиг. 4 приведена аминокислотная последовательность секретируемого рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью, линкером и P2A-пептидом, обеспечивающим независимый синтез коронавирусного антигена и белка G вируса везикулярного стоматита (SEQ ID NO: 2).

На фиг. 5 приведена иммуногистохимия монослоя культуры клеток Vero E6: А - интактный; Б - инфицированный SARS CoV-2 штамм nCoV/Victoria/1/2020.

Дизайн искусственного гена и получение рекомбинантной плазмиды. Первым этапом создания рекомбинантного вируса везикулярного стоматита для создания вакцины стал дизайн целевого антигена/иммуногена. Согласно литературным данным, наиболее перспективными вирусными компонентами, для индукции протективного иммунитета, являются поверхностный трансмембранный гликопротеин S (Spike), а также нуклеопротеин N.

В ходе проведенного биоинформатического анализа опубликованных полногеномных нуклеотидных последовательностей вируса SARS-CoV-2 (референс последовательность GenBank: NC_045512.2), а также фрагментарных нуклеотидных последовательностей, кодирующих гликопротеин S, подтверждена относительная стабильность аминокислотных последовательностей целевых антигенов.

Важно отметить, что нативный вирусный гликопротеин S представлен трансмембранным триммером, с сигналами удержания в ER/Гольджи в C-концевом фрагменте белка. С использованием онлайн инструментов SignalIP-5.0 и TMHMM был локализован эктодомен гликопротеина S, по гомологии с гликопротеином S SARS-CoV выделен рецептор-связывающий домен (RBD), с фланкирующими регионами, необходимыми для корректного фолдинга домена. Согласно литературным данным, иммунизация животных рекомбинантным белком RBD родственных коронавирусов (SARS-CoV, MERS-CoV и др.), или конструкциями, обеспечивающими его экспрессию, приводит к индукции специфических вируснейтрализующих антител.

Следовательно, экспрессия эктодомена гликопротеина S, либо рецептор-связывающего домена (RBD) посредством рекомбинантного вируса в составе вакцины будет индуцировать синтез вирусспецифических антител к SARS-CoV-2. В изобретении предложена оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2. Оптимизация синтетических конструкций, кодирующих полноразмерный гликопротеин S SARS-CoV, а также рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S была проведена посредством нормализации кодонного состава и исключения из последовательностей элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии или стабильность мРНК. Нуклеотидные последовательности искусственных генов были химически синтезированы и использованы для получения рекомбинантных конструкций для обратной генетики репликационно-компетентного вируса везикулярного стоматита.

Вирус везикулярного стоматита использован в качестве вектора в силу безопасности, широкого клеточного тропизма, а также из-за отсутствия предсуществующего иммунитета у большинства людей, что является необходимым требованием для проведения эффективной иммунизации. Показано, что использование векторов на основе других циркулирующих в человеческой популяции агентов (аденовирусы, герпесвирусы, респираторно-синцитиальный вирус и т.д.) может быть осложнено наличием специфического иммунитета против вируса «дикого типа», в результате чего не будет происходить продуктивного инфицирования клеток рекомбинантным вирусом и, как следствие, не будет обеспечена экспрессия целевого трансгена. Важным свойством, позволяющим рекомендовать рабдовирусы в качестве вакцинных вирусных векторов, является высокий титр накопления в перевиваемых культурах клеток (до 10¹⁰ ТЦД₅₀/мл), а также относительно низкие иммунизирующие дозы (10⁵ - 10⁷ ТЦД₅₀). Показано также, что рекомбинантные вирусы везикулярного стоматита, экспрессирующие гликопротеины гетерологичных вирусов (Эбола, Марбург, Ласса и т.д.) обеспечивают формирование протективного иммунитета в отношении широкого круга инфекционных заболеваний.

Изобретение также представляет собой штамм рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащий оптимизированную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1) искусственного гена, кодирующего искусственный белок-иммуноген рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, линкером и P2A-пептидом для расщепления полипротеина во время трансляции, гликопротеином G с мутацией M(1)>P(1), благодаря чему достигается независимый синтез антигена SARS-CoV-2 и поверхностного белка слияния.

Способ индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2, предусматривает:

1) 1-, 2- или 3-кратное введение в организм человека или животного одного, двух или более иммуногенных композиций на основе заявляемого штамма рекомбинантного вируса везикулярного стоматита.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Получение конструкционного варианта гликопротеина S RBD вируса SARS-CoV-2.

Прототипом для дизайна синтетической конструкции вариантов гликопротеина S, выступала аминокислотная последовательность, кодируемая геном S (Spike), представленным в депонированной полногеномной последовательности вируса SARS-CoV-2 (GenBank: NC_045512). Химерный синтетический иммуноген представляет собой секретируемый рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью, линкером и P2A-пептидом, обеспечивающим независимый синтез коронавирусного антигена и белка вируса везикулярного стоматита G (SEQ ID NO: 2). При экспрессии данного варианта в эукариотических клетках происходит синтез и необходимые посттрансляционные модификации RBD гликопротеина S, после чего коронавирусный антиген транспортируется в межклеточное пространство, что обеспечивает индукцию иммунного ответа, в том числе, на конформационные антигенные детерминанты. P2A-пептид обеспечивает отщепление коронавирусного антигена на этапе трансляции, с последующим независимым синтезом и фолдингом белка G, необходимого для репродукции вируса. Данная стратегия обеспечивает более высокую стабильность целевого трансгена за счет того, что возникновение любых мутаций, приводящих к сдвигу рамки считывания (инсерции, делеции, инверсии и т.д.), исключает возможность синтеза необходимого для полноценного репродуктивного цикла вирусного белка, находящегося после P2A-пептида.

Пример 2. Получение генетической конструкции.

Для получения генетической конструкции гликопротеина S и RBD был рассчитан оптимизированный искусственный ген с нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 1, фиг. 3). Оптимизация гена была направлена на нормализацию кодонного состава искусственного гена и исключения из последовательностей элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии или стабильность мРНК.

Нуклеотидные последовательности генов были получены методом химического синтеза ЗАО «Биокад» и ЗАО «Евроген».

Для получения рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, с формированием бицистронной структуры трансгенов с гликопротеином G посредством саморасщепляющегося P2A-пептида (для стабилизации трансгенов в составе рекомбинантных вирусов), нуклеотидные последовательности генов, кодирующих конструкционные варианты гликопротеина S и RBD, были клонированы в плазмидном векторе для обратной генетики вируса везикулярного стоматита pStem-rVSV_P2A_G. Схема клонирования приведена на фиг. 1. Направленное клонирование проведено по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикций NheI и SmaI, располагающихся в полилинкере транскрипционной кассеты гена G в геномной кДНК последовательности. Для этого 2 мкг плазмидной ДНК pStem-rVSV_P2A_G гидролизовали эндонуклеазой рестрикции SmaI (NEB) в буфере CutSmart при 25°C 1 час, после чего вносили 10 е.а. рестриктазы NheI (NEB) и 2 е.а. рекомбинантной щелочной фосфатазы креветок (rSAP) (NEB), необходимой для предотвращения «самолигирования» вектора, с инкубацией при 37°C 1 час. Продукты гидролиза разделяли методом электрофореза, фрагменты ДНК, соответствующие гидролизованному вектору (~13500 п.н.), выделяли из агарозного геля с использованием коммерческого набора QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Нуклеотидную вставку, кодирующую целевой трансген, возможно подготовить посредством постановки гидролиза клонировочной плазмиды, амплификацией нуклеотидных последовательностей в LAMP или ПЦР, либо любым другим методом, доступным исследователю. Клонирование может быть проведено любым из существующих методов (лигирование, метод Гибсона, гомологической рекомбинации и др.), при этом в целевом трансгене должен присутствовать старт-кодон (ATG) в оптимальном фланкирующем контексте (консенсусная последовательность Козак; GCCACC) и не должна нарушаться рамка считывания гликопротеина G. На фиг. 1 представлена схема «тупого-липкого» клонирования трансгена, с формированием единой рамки считывания. Для этого 1 мкг гидролизованного вектора pStem-rVSV_P2A_G/SmaI+NheI смешивали с гидролизованным по NheI фрагментом ДНК трансгена в эквимолярном соотношении, добавляли реакционный буфер и T4 ДНК лигазу. После инкубации при 20°C 1 час, лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E.coli. Скрининг клонов-трансформантов проводили с использованием методов ПЦР и рестрикционного анализа рекомбинантных плазмид.

Корректность нуклеотидных последовательностей плазмидных конструкций подтверждена секвенированием по Сэнгеру. Получена генетическая конструкция, кодирующая нуклеотидную последовательность конструкционного варианта антигена SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1, фиг. 3).

Рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2 имеет молекулярную массу 8,85⋅10⁶ дальтон, размер 14309 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2 целевой искусственный ген по п. 1, кодирующий искусственный белок-иммуноген RBD гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (фиг. 4) длиной 784 а.к.о. и находящийся под контролем вирусного промотора, обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих и состоящая из следующих фрагментов:

- ORI - (ORI, origin of replication) точка начала репликации плазмидного вектора pUC (координаты 13483- 14071 п.н.);

- AmpR - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику ампициллину (координаты 12452- 13312 п.н.);

- T7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага T7, необходимая для транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 166-183 п.н.);

- T7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага T7, необходимая для терминации транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 12224-12330 п.н.);

- HDV-Rbz - нуклеотидная последовательность рибозима HDV, которая после транскрибирования отщепляется с формированием аутентичной 3'-концевой некодирующей последовательности (координаты 12137-12219 п.н.);

- N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты 247-1515 п.н.);

- P - открытая рамка считывания гена P (фосфопротеин) (координаты 1579-2376 п.н.);

- L - открытая рамка считывания гена L (РНК-зависимая РНК-полимераза) (координаты 5708-12037 п.н.);

- VSV-G - открытая рамка считывания гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1) (координаты 3322-4032 п.н.);

- P2A - 2A-пептид тешовируса-1, обеспечивающий расщепление полипротеина на этапе трансляции (координаты 4033-4089 п.н.);

- Signal peptide - сигнальный пептид гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, обеспечивающий эффективный внутриклеточный транспорт синтезируемого полипротеина (координаты 3268-3321 п.н.);

- Spike protein - фрагмент гена S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 3322-4032 п.н.);

- Receptor-binding domain (RBD) - рецептор-связывающий домен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 3334-4002 п.н.).

Пример 3. Получение репликационно-компетентного штамма rVSV-Stbl_RBD_SC2 вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антиген SARS-CoV-2.

Выделение плазмидной ДНК генетической конструкции для обратной генетики вируса везикулярного стоматита, кодирующего антигены SARS-CoV-2, выполнено с использованием коммерческого набора QIAGEN Plasmid Maxi Kit, согласно инструкции производителя.

Получение репликационно-компетентного вируса везикулярного стоматита проведено с использованием методов обратной генетики в перевиваемой линии клеток Vero и/или 4647 (коллекция культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора). Для этого монослой клеточной культуры (конфлюентность 90%) трансфецировали с использованием липофектамина 3000 (Thermo Scientific, США) полученной генетической плазмидной конструкцией pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2 совместно с хелперными плазмидами pStem-vN, pStem-vP, pStem-vL обеспечивающими экспрессию белковой репликативной машинерии вируса везикулярного стоматита (N, P и L), а также ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7. Количество плазмидной конструкции составило pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2 (конструкционный вариант) - 2 мкг. Через сутки производили смену питательной среды на поддерживающую с 2% фетальной сыворотки крови, с последующим культивированием 48-72 часа в CO₂-инкубаторе (5% CO₂; 37°C; влажная атмосфера). При оптической микроскопии по истечению срока культивирования отмечали полную деструкцию монослоя клеток. Вируссодержащую культуральную жидкость рекомбинантного вируса собирали, осветляли посредством центрифугирования (10 мин при 10 тыс об/мин), аликвотировали и хранили до использования при минус 80°C.

Штамм идентифицирован в ФБУН ГНЦ ВБ Вектор» Роспотребнадзора в апреле 2020 г. и депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-984.

Инфекционную активность рекомбинантного вируса везикулярного стоматита оценивали при постановках классических вирусологических методов титрования в чувствительную культурах клеток Vero и/или 4647, с выражением в 50 % тканевых цитопатических дозах (ТЦД₅₀), либо в бляшкообразующих единицах (БОЕ). При изучении культуральных свойств установлено, что полученный рекомбинантный вирус сохранил основные свойства исходного штамма вируса везикулярного стоматита (клеточная чувствительность, характер цитопатического действия, оптимальные параметры культивирования и др.).

Титр накопления в культуре клеток Vero рекомбинантного штамма вируса везикулярного стоматита, кодирующий нуклеотидную последовательность антигена SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 15) составил - 7,80 ± 0,19 lg ТЦД₅₀/см³. Титр накопления в культуре клеток 4647 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, кодирующий нуклеотидную последовательность антигена SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 15) составил - 9,25 ± 0,2 lg ТЦД₅₀/см³.

Пример 4. Подтверждение наличия гена Stbl_RBD, кодирующего антигены SARS-CoV-2, в составе генома заявляемого штамма rVSV-Stbl_RBD_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита.

Подтверждение наличия и экспрессии искусственного гена Stbl_RBD, кодирующего антиген (рецептор-связывающий домен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2), проводили в полимеразной цепной реакции совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Выделение РНК из образцов культуральных сред, полученных после инфицирования монослоя клеток Vero рекомбинантным вирусом везикулярного стоматита, проводили с использованием набора реагентов «Рибо-преп» (Интерлабсервис, Россия) согласно инструкции производителя. Для оценки экспрессии и наличия трансгенов использовали специфические олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие открытые рамки считывания химерных генов:

F-Sig_NheI (5'-ACAAAGCTAGCCACCATGAAGGCAATACTAGTAGTTC TG-3') и R-vG_SbfI (5'- TTTTGCCCTGCAGGAGTGCGGCCGCTTAC-3'), а также F-NCR (5'-ACGAAGACAAACAAACCATTATTATCATTAAAAGGC-3') и R-VSV_1_seq (5'-TTGTGTTCTGCCCACTCTGT-3').

Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием набора реагентов «обратная транскриптаза RNAscribe RT» (Биолабмикс, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Амплификацию фрагментов кДНК вируса везикулярного стоматита проводили с Phusion-полимеразы (NEB, США) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты амплификации анализировали посредством электрофоретического разделения в агарозном геле и последующего окрашивания гелей рабочим раствором этидия бромида (0,5 мкг/мл). Корректность открытых рамок считывания трансгенов подтверждали секвенированием по Сэнгеру элюированных из агарозного геля целевых ампликонов.

Наличие и функциональная активность гена G, кодирующего поверхностный гликопротеин вируса везикулярного стоматита подтверждается секвенированием ампликонов трансгена по Сэнгеру, а также репродукцией рекомбинантного вируса в пермиссивных клеточных линиях (Vero, 4647, BHK-21/13 и т.д.) с культуральными свойствами, аналогичными «дикому типу» ВВС.

Пример 5. Исследование и использование штамма rVSV-Stbl_RBD_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антиген (RBD SARS_CoV-2) коронавируса SARS-CoV-2, и индуцирующего специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2.

Композиции могут включать приемлемые адъюванты, стабилизаторы, наполнители и заявляемый штамм рекомбинантного везикулярного стоматита, экспрессирующего антигены коронавируса SARS-CoV-2. Индукция специфического иммунного ответа к антигенам SARS-CoV-2 обеспечивается путем введения в организм человека или животного иммуногенных композиций на основе заявляемого штамма rVSV-Stbl_RBD_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антигены коронавируса SARS-CoV-2, любым из известных способов (внутримышечно, внутривенно, подкожно, интраназально и др.).

Изучение иммуногенных свойств заявляемого штамма rVSV-Stbl_RBD_SC2, проводили посредством однократной внутримышечной иммунизации мышей и хорьков рекомбинантным вирусом везикулярного стоматита, экспрессирующим антигены коронавируса SARS-CoV-2, в дозе 2x10⁷ БОЕ. Однократная иммунизация данной дозы оправдана результатами предыдущих исследований в Центре, при разработке вакцинных препаратов против ООВИ, а также актуальными публикациями, при разработке кандидатных вакцинных препаратов на данной платформе.

Иммуногенные свойства оценивали по титру вирусспецифических антител в твердофазном иммуноферментном анализе с использованием инактивированного природного культурального антигена SARS-CoV-2. Для выявления комплекса «антиген-антитело» использовали конъюгаты антивидовые, либо протеин G.

Таблица 1.

В таблице 1 приведены титры вирусспецифических антител в сыворотках крови лабораторных мышей после иммунизации рекомбинантным вирусом везикулярного стоматита, кодирующий рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью, P2A-пептид и гликопротеин G (SEQ ID NO: 1).

Показано, что на 28 сутки после иммунизации титр вирусспецифических антител в сыворотках крови лабораторных мышей в группе «rVSV-Stbl_RBD_SC2» составил не менее 1:200.

В таблице 2 представлены титры вирусспецифических антител в сыворотках крови хорьков после иммунизации рекомбинантным штаммом вируса везикулярного стоматита, кодирующего рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью, P2A-пептид и гликопротеин G (SEQ ID NO: 1).

Таблица 2.

Показано, что на 28 сутки после иммунизации титр вирусспецифических антител в сыворотках крови хорьков в группе «штамм rVSV-Stbl_RBD_SC2» составил не менее 1:400.

Для детального изучения иммуногенных свойств штамма rVSV-Stbl_RBD_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, кодирующего рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c гетерологической сигнальной последовательностью, P2A-пептид и гликопротеин G (SEQ ID NO: 1) проводили иммунизацию приматов (3 шт), хомяков (4 шт) и хорьков (4шт).

Оценка специфического противовирусного гуморального иммунитета была проведена в реакции нейтрализации против коронавируса SARS CoV-2 штамм nCoV/Victoria/1/2020 (ЦПД₅₀), а также в реакции подавления (ингибирования) фокусообразования. В качестве положительного контроля выступала сыворотка крови человека, переболевшего COVID-19.

Реакцию подавления (ингибирования) фокусообразования проводили согласно разработанному протоколу в культуре клеток Vero E6 против 100 фокусообразующий единиц (ФОЕ) SARS CoV-2 штамм nCoV/Victoria/1/2020, каждое разведение нанесено в лунки 96-луночного культурального планшета.

Из лунок планшета удаляют ростовую среду, монослой клеток Vero E6 промывают два раза поддерживающей средой. Готовят 2-кратные разведения иммунных и интактных сывороток крови, затем вносят рабочую дозу вируса (100 ФОЕ), с последующей инкубацией в течение 1 часа. Весь объем переносят в соответствующие лунки планшета с монослоем клеток, инкубируют 60 мин в CO₂-инкубаторе при температуре 37°C, после чего пробу из лунок удаляют, и планшет 1 раз промывают поддерживающей средой. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл поддерживающей среды. После 16-18 часов инкубации питательную среду из лунок удаляют и добавляют по 200 мкл охлажденного до -20°C ацетона (80 % ацетона и 20 % воды). Фиксация занимает 25-30 мин, после чего ацетон удаляют, а планшет подсушивают.

Готовят разведение моноклонального антитела человека к нуклеопротеину N SARS-CoV-2 (AHA006/Anti-N protein SARS-CoV-2 mAb(IgG)/Sanyou Biopharmaceuticals/Human) в ФСБР (фосфатно-солевой буферный раствор) в рабочем разведении 1:8000, раствор по 50 мкл добавляют в каждую лунку. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа, после чего лунки промывают ФСБР 3 раза и наносят аффинно очищенные антитела кролика против IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена, в разведении 1:1000. Через 60 мин инкубации лунки промывают 3 раза ФСБР, после чего вносят раствор хромогенного субстрата AEC (3-amino-9-ethylcarbazole, Sigma). Через 30 мин инкубации при комнатной температуре в темном месте субстратный раствор удаляют, планшет промывают 1 раз ФСБР. Подсчет инфицированных клеток проводят посредством световой микроскопии по окрашиванию в красно-коричневый цвет (фиг. 5). Вируснейтрализующим титром считается наибольшее разведение сыворотки крови, при котором количество ФОЕ меньше на 50% по сравнению со средним значением ФОЕ в контрольных лунках с рабочим разведением вируса.

Таблица 3 - Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови иммунизированных животных

Установлено, что титр вируснейтрализующих антител в реакции подавления ФОЕ у всех иммунизированных приматов и хорьков составил не менее 1:2560, у хомяков - не менее 1:640 (таблица 3). Таким образом, введение иммуногенной композиции на основе штамма rVSV-Stbl_RBD_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антигены коронавируса SARS-CoV-2, индуцирует синтез вирусспецифических и вируснейтрализующих антител.

Иммуногенная композиция на основе заявляемого штамма rVSV-Stbl_RBD_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антигены коронавируса SARS-CoV-2, может рассматриваться в качестве кандидатного вакцинного препарата для защиты людей и животных от коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2).

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

<120> Искусственный ген, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецептор-связывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_SC2, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2

<160> SEQ ID NO 2

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 2355

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность искусственного гена, кодирующего искусственный белок-иммуноген, представляющий собой бицистронную структуру, состоящую из последовательностей рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, гетерологического сигнального пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, линкера, P2A-пептида для расщепления полипротеина во время трансляции, и гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1), предотвращающей альтернативную инициацию трансляции.

<400> 1

ATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATACATTTGCAACCGCAAACGCA 51

GATACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCC 102

AATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTC 153

GCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGAC 204

TACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGC 255

GTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGAC 306

AGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACA 357

GGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGT 408

GTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTAC 459

AATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGG 510

GACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTG 561

GAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACA 612

AATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTG 663

CTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTG 714

AAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACAGGCGGG 765

GCCACCAACTTCAGCCTCCTTAAACAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCT 816

GGCCCCAAGTGCCTTTTGTACTTAACCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGC 867

AAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTT 918

CCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTGGCATAAT 969

GACTTAATAGGCACAGCCTTACAAGTCAAAATGCCCAAGAGTCACAAGGCT 1020

ATTCAAGCAGACGGTTGGATGTGTCATGCTTCCAAATGGGTCACTACTTGT 1071

GATTTCCGCTGGTATGGACCGAAGTATATAACACATTCCATCCGATCCTTC 1122

ACTCCATCTGTAGAACAATGCAAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGA 1173

ACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATATGCAACTGTG 1224

ACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCACCATGTGCTGGTT 1275

GATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCACAGTTCATCAACGGAAAATGC 1326

AGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGAC 1377

TATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATTCTAACCTCATTTCCATGGACATCACC 1428

TTCTTCTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAGGGCACAGGG 1479

TTCAGAAGTAACTACTTTGCTTATGAAACTGGAGGCAAGGCCTGCAAAATG 1530

CAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAG 1581

ATGGCTGATAAGGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAA 1632

GGGTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTAATT 1683

CAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGC 1734

AAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGATCTCAGCTATCTTGCT 1785

CCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTA 1836

AAATACTTTGAGACCAGATACATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTC 1887

TCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACTGTGG 1938

GATGACTGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTG 1989

AGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGACATGGTATG 2040

TTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCT 2091

CACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTT 2142

GGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTC 2193

AGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATC 2244

ATTGGATATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAC 2295

AAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTT 2346

GGAAAGTAA 2355

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 784

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность секретируемого рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 2 c гетерологической сигнальной последовательностью, линкером и P2A-пептидом, обеспечивающим независимый синтез коронавирусного антигена и белка G вируса везикулярного стоматита

<400> 2

MKAILVVLLYTFATANADTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRK 60

RISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTG 120

KIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAG 180

STPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKN 240

KCVNFNFNGLTGTGGATNFSLLKQAGDVEENPGPKCLLYLTFLFIGVNCKFTIVFPHNQK 300

GNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFR 360

WYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTP 420

HHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSE 480

DGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFP 540

ECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPG 600

TGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPN 660

GVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLS 720

KNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMN 780

RLGK* 784

<---