Результат интеллектуальной деятельности: НОВАЯ КОМБИНАЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится, отчасти, к фармацевтической композиции, содержащей антагонист PD-1 и антагонист M-CSF. Настоящую комбинацию вводят независимо или раздельно, в количестве, которое является терапевтически эффективным для лечения злокачественного новообразования. Изобретение дополнительно относится к применению такой комбинации для производства лекарственного средства; применению такой комбинации в качестве лекарственного препарата; набору частей, содержащих такую комбинацию; и способу лечения, включающему комбинацию.

Предшествующий уровень техники

Необходимы более эффективные способы лечения злокачественных солидных опухолей. Иммунотерапии, которые нацелены на контрольные точки иммунного ответа, в настоящее время являются перспективными в качестве основных средств при терапии злокачественных новообразований. Антитела, ингибирующие цитотоксический белок, ассоциированный с Т-лимфоцитами типа 4 (CTLA-4), и белок программируемой смерти типа 1 (PD-1), также известные как ингибиторы контрольных точек иммунного ответа, продемонстрировали эффективность у некоторых пациентов со злокачественным новообразованием. Пациенты и типы опухолей имели сильно варьирующие ответы, с наивысшими степенями ответа, наблюдаемыми при прогрессирующей меланоме. Наблюдали как иммунологическую толерантность к ингибированию контрольных точек, а также первоначальный ответ, с последующим прогрессированием, указывающим на присутствие первичной резистентности и индуцированной терапией приобретенной резистентности. Для пациентов с меланомой, заболевание которых прогрессирует на ингибиторах контрольных точек иммунного ответа CTLA-4, PD-1 или PD-L1, необходимы другие варианты лечения, которые могут стабилизировать или обратить прогрессирование заболевания.

Одним видом злокачественного новообразования, который может иметь благоприятный ответ от лечения с использованием антитела, ингибирующего контрольную точку, является рак молочной железы, наиболее часто встречающийся вид рака среди женщин во всем мире, с учтенными 1,38 миллиона новых случаев в 2008 г., и он также является наиболее частой причиной смерти от рака у женщин с 458000 смертными случаями. Трижды негативный рак молочной железы (TNBC) приходится на приблизительно 15% впервые диагностированных злокачественных новообразований молочной железы, но вследствие его агрессивной природы сообщается о диспропорциональном количестве (25%) случаев TNBC при терапии метастатических форм рака. TNBC характеризуется отсутствием экспрессии рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR) и отсутствием сверхэкспрессии рецептора человеческого эпидермального фактора роста 2 типа (HER2).

Клиническое течение болезни для TNBC ассоциировано с высокой вероятностью отдаленных метастазов, особенно, в легком и мозге. В настоящее время не существует каких-либо целенаправленных терапий для этого подтипа рака молочной железы, и единственным вариантом лечения является химиотерапия. Даже несмотря на то, что в некоторых исследованиях предполагают, что TNBC является в высокой степени хемочувствительным заболеванием, прогноз все еще остается неблагоприятным с более коротким интервалом без заболевания после первоначальной терапии и более агрессивным клиническим течением болезни при терапии метастатических форм рака. Большинство пациентов получают антрациклины и таксаны при вспомогательном лечении, и никакого дополнительного стандартного лечения не существует для пациентов с метастатическим TNBC. Однако появившиеся данные позволяют предположить, что соли платины (т.е., цисплатин и карбоплатин) являются высокоактивными при раннем и прогрессирующем TNBC, и, следовательно, широко применяются в клинических условиях. Медиана выживаемости для метастатического TNBC составляет приблизительно 1 год, что делает TNBC заболеванием с высокой степенью неудовлетворенной медицинской потребности. Дополнительные виды злокачественных новообразований с высокой степенью неудовлетворенных потребностей пациентов также включают пациентов со злокачественным новообразованием поджелудочной железы (особенно пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы) или карциномой эндометрия. Существует потребность в разработке новых комбинационных терапий, которые могут применяться для лечения злокачественных новообразований.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение направлено, отчасти, на комбинацию антагониста макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) и антагониста белка программируемой смерти типа 1 (PD-1), которая может обеспечить преимущественный эффект для лечения злокачественного новообразования. Комбинацию антагониста M-CSF и антагониста PD-1 применяют при лечении злокачественного новообразования, включающего трижды негативный рак молочной железы (TNBC), рак кожи, рак яичника злокачественные новообразования поджелудочной железы, глиобластому (GBM), рак легких, почечно-клеточную карциному, диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), мезотелиому, рак эндометрия и назофарингеальную карциному (NPC), или злокачественного новообразования, которое стало резистентным или рефрактерным к терапии с использованием PD-1 или PD-L1, такого как TNBC или меланома.

В одном другом аспекте, изобретение включает фармацевтическую комбинацию, описанную выше, для применения при лечении злокачественного новообразования, включающего трижды негативный рак молочной железы (TNBC), рак кожи, рак яичника злокачественные новообразования поджелудочной железы, глиобластому (GBM), рак легких, почечно-клеточную карциному, диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), мезотелиому и назофарингеальную карциному (NPC), или злокачественного новообразования, которое стало резистентным, рецидивирующим или рефрактерным к другим терапиям, особенно, к терапии с использованием PD-1 или PD-L1, такого как TNBC или меланома. Комбинация согласно изобретению может применяться для лечения рака легких, включающего немелкоклеточный рак легких и плоскоклеточный рак легких. Фармацевтическая комбинация, описанная в настоящем документе, включает количество, которое является терапевтически эффективным. Злокачественные новообразования молочной железы включают позитивный к эндокринному рецептору (рецептору эстрогена или прогестерона) рак, HER2-позитивный рак, трижды негативный (не позитивный к рецепторам эстрогена, прогестерона или HER2) рак или трижды позитивный (позитивный к рецепторам эстрогена, рецепторам прогестерона и HER2) рак, и комбинация согласно настоящему изобретению является особенно применимой против трижды негативного рака молочной железы. Злокачественные новообразования поджелудочной железы принадлежат в основном к типу аденокарциномы или карциномы, которые представляют собой экзокринные злокачественные новообразования. Экзокринные злокачественные новообразования поджелудочной железы включают аденокарциному поджелудочной железы, ацинарно-клеточную карциному поджелудочной железы, цистаденокарциномы, панкреатобластомные аденосквамозные карциномы, перстневидно-клеточные карциномы, гепатоидные карциномы, коллоидные карциномы, недифференцированные карциномы, недифференцированные карциномы с остеокласт-подобными гигантскими клетками, солидную псевдопапиллярную опухоль и слизеобразующие кистозные новообразования поджелудочной железы.

В одном варианте осуществления, фармацевтическая комбинация, описанная в настоящем документе, включает количество, которое является терапевтически эффективным для лечения рака молочной железы, такого как позитивный к эндокринному рецептору (рецептору эстрогена или прогестерона), HER2-позитивный, трижды негативный (не позитивный к рецепторам эстрогена, прогестерона или HER2) или трижды позитивный (позитивный к рецепторам эстрогена, рецепторам прогестерона и HER2). В одном другом варианте осуществления, фармацевтическая комбинация, описанная в настоящем документе, включает количество, которое является терапевтически эффективным для лечения рака яичника. В еще одном другом варианте осуществления, фармацевтическая комбинация, описанная в настоящем документе, включает количество, которое является терапевтически эффективным для лечения меланомы, включая меланому. В еще одном другом варианте осуществления, фармацевтическая комбинация, описанная в настоящем документе, включает количество, которое является терапевтически эффективным для лечения рака поджелудочной железы. В еще одном другом варианте осуществления, фармацевтическая комбинация, описанная в настоящем документе, включает количество, которое является терапевтически эффективным для лечения рака легких, включающего немелкоклеточный рак легких и плоскоклеточный рак легких. В одном другом варианте осуществления, фармацевтическая комбинация, описанная в настоящем документе, включает количество, которое является терапевтически эффективным для лечения злокачественного новообразования, которое стало резистентным или рефрактерным к терапии с использованием PD-1 или PD-L1, такого как TNBC или меланома. В еще одном другом варианте осуществления, фармацевтическая комбинация, описанная в настоящем документе, включает количество, которое является терапевтически эффективным для лечения.

В одном другом аспекте, изобретение включает фармацевтическую комбинацию, описанную в настоящем документе, для применения при лечении злокачественного новообразования, такого как рак молочной железы, включающего трижды негативный рак молочной железы (TNBC), рак кожи, рак яичника, злокачественные новообразования поджелудочной железы, глиобластому (GBM), рак легких, почечно-клеточную карциному, диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), мезотелиому и назофарингеальную карциному (NPC), или злокачественного новообразования, которое стало резистентным или рефрактерным к терапии с использованием PD-1 или PD-L1, такого как TNBC или меланома.

В одном другом аспекте, изобретение включает применение фармацевтической комбинации, описанной в настоящем документе, для производства лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования, такого как рак молочной железы, включающего трижды негативный рак молочной железы (TNBC), рак кожи, рак яичника, злокачественные новообразования поджелудочной железы, глиобластому (GBM), рак легких, почечно-клеточную карциному, диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), мезотелиому и назофарингеальную карциному (NPC), или злокачественного новообразования, которое стало резистентным или рефрактерным к терапии с использованием PD-1 или PD-L1, такого как TNBC или меланома.

Краткое описание чертежей

ФИГ. 1 показывает данные Rnaseq и TCGA и внутренних баз данных, показывающие высокий уровень экспрессии суррогатного маркера для M2 макрофагов, CD163, внутри конкретных популяций пациентов, определяемых по наивысшему уровню экспрессии PD1 (прямоугольник).

Подробное описание изобретения

Существует потребность в новых комбинациях, которые могут применяться для лечения злокачественного новообразования. Настоящее изобретение направлено на комбинацию антагониста M-CSF, такого как молекула антитела против M-CSF, и антагониста PD-1, такого как молекула антитела против PD-1, которая может применяться для лечения злокачественных новообразований. Без ограничения какой-либо теорией полагают, что применение новой комбинации, раскрытой в настоящем документе, для лечения конкретного злокачественного новообразования, является преимущественным, так как она воздействует на иммунный ответ, восстанавливая противоопухолевый ответ Т-клеток, и расширяя эндогенный противоопухолевый ответ Т-клеток. Как показано на ФИГ. 1, после активации Т-клетки увеличивают экспрессию PD-1 на их поверхности, что позволяет им получать отрицательный сигнал, ингибируя посредством этого ответы Т-клеток. Опухолевые клетки используют преимущество этой системы посредством экспрессии партнеров связывания PD-1, такого как PD-L1, что преждевременно выключают ответы Т-клеток против опухоли. В настоящей комбинации, молекула антитела против PD1 распознает и связывает PD-1 на Т-клетках, предотвращая посредством этого опухолевые клетки от связывания с PD-1 и снижая активность Т-клеток. Молекула антитела против PD-1 связывается с Т-клетками, но не препятствует функции Т-клеток, таким образом, обеспечивая то, что Т-клетки сохраняют их воздействие по уничтожению опухоли. Антитело против M-CSF, в свою очередь, усиливает активность Т-клеток посредством воздействия на различные оси клетки. В месте локализации опухоли, опухолеассоциированные макрофаги (TAMS) секретируют цитокины для ингибирования выработки IL-2 и пролиферации Т-клеток паракринным образом. Применение антител против M-CSF высвобождает разрыв с компартментом Т-клеток посредством истощения M2-макрофагов, которые могут подавлять функцию Т-клеток и пролиферацию через выработку иммуномодуляторных цитокинов. Таким образом, полагают, что комбинация молекулы антитела против MSCF и молекулы антитела против PD1 восстанавливает функцию истощенных Т-клеток, которая была нарушена опухолевыми клетками и M2-макрофагами, приводя к преимущественному лечебному воздействию у пациентов с опухолями. Новые в настоящее время комбинации могут быть применимы при показаниях, где маркер PD-1 и CD163 (маркер макрофагов) экспрессируются или сверхэкспрессируются. Примеры злокачественных новообразований, где комбинация имеет преимущественное воздействие, включают рак яичника, рак молочной железы, например, TNBC, рак поджелудочной железы, меланому, рак легких, такой как немелкоклеточный рак легких и плоскоклеточный рак легких, назофарингеальную карциному (NPC), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), мезотелиому, почечно-клеточную карциному или глиобластому. Кроме того, настоящие комбинации являются применимыми для лечения злокачественных новообразований, которые являются резистентными или рефрактерными к лечению с использованием PD1/PDL-1, включающих меланому и трижды негативный рак молочной железы (TNBC).

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет, композиции, например, фармацевтические композиции, которые включают фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или стабилизатор, и молекулы антитела против PD-1, описанного в настоящем документе, и антитела против M-CSF, как описано в настоящем документе, и их применения для лечения злокачественного новообразования. В одном варианте осуществления, композиция, например, фармацевтическая композиция, включает комбинацию молекул антител против PD-1 и против M-CSF и одно или более средств, например, терапевтическое средство или молекулу другого антитела, как описано в настоящем документе.

Определения

Термин ʺБелок программируемой смерти типа 1ʺ или ʺPD-1ʺ включает изоформы у млекопитающих, например, человеческий PD-1, виды гомологов человеческого PD-1 и аналоги, содержащие по меньшей мере один общий эпитоп с PD-1. Аминокислотная последовательность PD-1, например, человеческого PD-1, является известной в данной области, например, Shinohara T et al. (1994) Genomics 23(3):704-6; Finger LR, et al. Gene (1997) 197(1-2):177-87.

Термин "совместно терапевтически эффективныеʺ означает, что антагонист PD-1, например, молекула антитела против PD-1 и антагонист M-CSF, например, молекула антитела против M-CSF, могут даваться одновременно (в одной дозированной форме или множестве дозированных форм) или раздельно (в хронологически шахматном порядке, особенно, специфичном к последовательности) при таких временных интервалах, которые являются предпочтительными, субъекту, особенно, человеку, подлежащему лечению, и все еще показывают (предпочтительно улучшенное или синергическое) взаимодействие. В одном варианте осуществления, комбинация при введении показывает улучшенный терапевтический ответ при сравнении с терапевтическим ответом при введении в виде монотерапии субъекту со злокачественным новообразованием.

Как применяют в настоящем описании, артикли "a" и "an" относятся к одному или более одного (например, к по меньшей мере одному) грамматическому объекту артикля.

Термин "или" применяют в настоящем описании для обозначения и применяют взаимозаменяемо с термином "и/или", если контекст явным образом не указывает на иное.

"Около" и "приблизительно" будут, как правило, означать приемлемую степень ошибки для измеренного количества данного природного объекта или точности измерений. Иллюстративные степени ошибки находятся в пределах 20 процентов (%), обычно, в пределах 10%, и более обычно, в пределах 5% от данного значения или интервала значений.

Композиции и способы согласно настоящему изобретению охватывают полипептиды и нуклеиновые кислоты, имеющие установленные последовательности, или последовательности идентичные им или сходные с ними по существу, например, последовательности, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или выше идентичные с установленной последовательностью. В контексте аминокислотной последовательности, термин "идентичная по существу" применяют в настоящем описании по отношению к первой аминокислотной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное число аминокислотных остатков, которые являются i) идентичными с аминокислотными остатками или ii) консервативными заменами выравненных аминокислотных остатков во второй аминокислотной последовательности, таким образом, что первая и вторая аминокислотные последовательности могут иметь общий структурный домен и/или общую функциональную активность. Например, аминокислотные последовательности, которые содержат общий структурный домен, имеющий по меньшей мере около 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности, с эталонной последовательностью, например, последовательностью, предоставленной в данном описании.

В контексте нуклеотидной последовательности, термин "идентичная по существу" применяют в настоящем описании по отношению к первой последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит достаточное или минимальное число нуклеотидов, которые являются идентичными с выравненными нуклеотидами во второй последовательности нуклеиновой кислоты, таким образом, что первая и вторая нуклеотидные последовательности кодируют полипептид, имеющий общую функциональную активность, или кодируют общий структурный полипептидный домен или общую функциональную полипептидную активность. Например, нуклеотидные последовательности, имеющие по меньшей мере около 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с эталонной последовательностью, например, последовательностью, предоставленной в данном описании.

Термин ʺфункциональный вариантʺ относится к полипептидам, которые имеют идентичную по существу аминокислотную последовательность с природной последовательностью, или кодируются идентичной по существу нуклеотидной последовательностью, и способны иметь одну или более активностей природной последовательности.

Термин "антигенсвязывающий участок" относится к части молекулы антитела, которая содержит детерминанты, которые образуют область контакта, которая связывается с полипептидом PD-1 или M-CSF или их эпитопом. По отношению к белкам (или миметикам белков), антигенсвязывающий участок типовым образом включает одну или несколько петель (из по меньшей мере четырех аминокислот или имитаторов аминокислот), которые образуют область контакта, которая связывается с полипептидом M-CSF или PD-1. Обычно, антигенсвязывающий участок молекулы антитела включает по меньшей мере одну или две CDR и/или гипервариабельные петли, или, более типично, по меньшей мере три, четыре, пять или шесть CDR и/или гипервариабельных петель.

Термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклональных антител", как применяют в настоящем описании, относится к получению молекул антител с единственным молекулярным составом. Композиция моноклональных антител проявляет единую специфичность связывания и аффинность для конкретного эпитопа. Моноклональные антитела могут быть получены гибридомной технологией или способами, в которых не применяется гибридомная технология (например, рекомбинантными способами).

ʺЭффективно человеческийʺ белок представляет собой белок, который не индуцирует ответ, нейтрализующий антитело, например, ответ человека против мышиного антитела (HAMA).

ʺКомбинацияʺ относится к лекарственным формам отдельных партнеров вместе с инструкциями или без инструкций по комбинированному применению или к комбинационным продуктам. Партнеры комбинации могут, таким образом, представлять собой полностью раздельные фармацевтические дозированные формы или фармацевтические композиции, которые также реализуются независимо друг от друга, и, где инструкции по их комбинированному применению обеспечиваются в оборудовании для упаковки, например в виде аннотации к лекарству или т.п., или в виде другой информации, например, предоставляемой терапевтам и медперсоналу (например, устные сообщения, сообщения в письменном виде или т.п.), для одновременного или последовательного применения для совместной активности.

ʺКомбинационный продуктʺ включает набор частей для комбинированного введения, где антитело против PD-1 и антитело против M-CSF могут вводиться независимо в одно и то же время или раздельно в пределах временных интервалов, особенно, где эти временные интервалы обеспечивают то, что партнеры комбинации показывают коллективный (= совместный), например улучшенный, усиленный или синергистический эффект. Термины ʺсовместное введениеʺ или ʺкомбинированное введениеʺ или т.п., как используются в данном описании, означают, что они охватывают введение выбранного партнера комбинации единичному субъекту, нуждающемуся в этом (например, пациенту), и предназначены для включения схем лечения, при которых средства не обязательным образом вводят посредством одинакового пути введения и/или в одно и то же время.

Термин ʺнефиксированная комбинацияʺ означает, что оба активных ингредиента вводят пациенту в виде раздельных субстанций либо одновременно, параллельно или последовательно без конкретных временных пределов, где такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух антител в организме пациента. Последнее также применимо к коктейльной терапии, например, введению трех или более активных ингредиентов. Термин ʺнефиксированная комбинацияʺ, таким образом, определяет, в особенности, ʺнабор частейʺ в том смысле, что партнеры комбинации (i) антитело против PD-1 и (ii) антитело против M-CSF, определенные в данном описании, могут быть дозированы независимо друг от друга или посредством применения различных фиксированных комбинаций с различаемыми количествами партнеров комбинации, т.е. одновременно или при различных временных отметках, где партнеры комбинации могут также применяться в виде полностью раздельных фармацевтических дозированных форм или фармацевтических лекарственных форм, которые также реализуют независимо друг от друга и с инструкциями по возможности их комбинированного применения или обеспечиваются в оборудовании для упаковки, например в виде аннотации к лекарству или т.п., или в виде другой информации, например, предоставляемой терапевтам и медперсоналу. Независимые лекарственные формы или части из набора частей могут затем, например, вводиться одновременно или хронологически в шахматном порядке, который имеет место при различных отметках времени и с равными или различными временными интервалами для любой части из набора частей. Очень предпочтительно, чтобы временные интервалы выбирались таким образом, чтобы воздействие на подвергаемое лечению заболевание при комбинированном применении частей было более сильным, чем воздействие, которое могло бы быть получено посредством применения лишь любого одного из партнеров комбинации (i) и (ii), таким образом, являющихся совместно активными. Отношение общих количеств партнера комбинации (i) к партнеру комбинации (ii), подлежащих введению в комбинированном препарате может варьироваться, например, в том порядке, чтобы удовлетворять потребностям субпопуляции пациентов, подлежащей лечению, или потребностям единственного пациента, различные потребности которого могут быть обусловлены возрастом, полом, массой тела и т.д. пациентов.

Фразы "парентеральное введение" и "вводимые парентерально", как применяют в настоящем описании, означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.

Термин "изолированное" как применяют в настоящем описании, относится к веществу, которое удаляют из его исходного или нативного окружения (например, природного окружения, если вещество является природным). Например, природный полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом животном, не является изолированным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный посредством человеческого вмешательства, из некоторых или всех совместно существующих веществ в природной системе, является изолированным. Такие полинуклеотиды могут быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут быть частью композиции, и все еще быть изолированными, если такой вектор или композиция не являются частью окружения, в котором его обнаруживают в природе.

Как применяют в настоящем описании, термин "молекула антитела" относится к белку, например, цепи иммуноглобулина или его фрагмента, содержащей по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Термин ʺмолекула антителаʺ включает, например, моноклональное антитело (включающее непроцессированное антитело, которое имеет Fc область иммуноглобулина). В варианте осуществления, молекула антитела содержит непроцессированное антитело, или непроцессированную цепь иммуноглобулина. В варианте осуществления, молекула антитела содержит антигенсвязывающий или функциональный фрагмент непроцессированного антитела или непроцессированную цепь иммуноглобулина. В одном другом примере, молекула антитела включает две последовательности вариабельного домена тяжелой (H) цепи и две последовательности вариабельного домена легкой (L) цепи, образуя, таким образом, два антигенсвязывающих участка, такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fc, Fd, Fd', Fv, одноцепочечные антитела (scFv, например), антитела с единственным вариабельным доменом, диатела (Dab) (бивалентные и биспецифические), и химерные (например, гуманизированные) антитела, которые могут продуцироваться посредством модификации цельных антител или антитела, синтезируемых de novo с использованием технологий рекомбинантных ДНК. Эти функциональные фрагменты антитела сохраняют способность селективно связываться с их соответствующим антигеном или рецептором. Антитела и фрагменты антител могут принадлежать к любому классу антител, включающему, но не ограниченному перечисленными, IgG, IgA, IgM, IgD и IgE, и любому подклассу (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) антител. Получение молекул антител может быть моноклональным или поликлональным. Молекула антитела может также представлять собой человеческое, гуманизированное, CDR-привитое или генерируемое in vitro антитело. Антитело может иметь константную цепь тяжелой цепи, выбранную из, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Антитело может также иметь легкую цепь, выбранную из, например, каппа или лямбда. Термин ʺиммуноглобулинʺ (Ig) в настоящем описании применяют взаимозаменяемо с термином ʺантителоʺ.

Примеры антигенсвязывающих фрагментов молекулы антитела включают: (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одиночного плеча антитела, (v) фрагмент диатела (dAb), который состоит из домена VH; (vi) верблюжий или верблюдизированный вариабельный домен; (vii) одноцепочечную Fv (scFv); (viii) однодоменное антитело. Эти фрагменты антитела получают, применяя общепринятые методы, известные квалифицированным специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу на предмет применимости таким же образом, как и интактные антитела. Термин ʺантителоʺ включает интактные молекулы, а также их функциональные фрагменты. Константные области антител могут быть изменены, например, подвергнуты мутации, чтобы модифицировать свойства антитела (например, для увеличения или уменьшения одного или нескольких из: связывания с Fc-рецептором, гликозилирования антитела, числа остатков цистеина, функции эффекторной клетки или функции комплемента).

Области VH и VL могут быть подразделены на области гипервариабельности, именуемые "области, определяющие комплементарность" (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, именуемыми "каркасные области" (FR или FW).

Степень каркасной области и CDR была точно определена рядом способов (см., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chotia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; и определением AbM, используемым в программном обеспечении моделирования антител Oxford Molecular's AbM. См., в целом, например, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg).

Термины ʺобласть, определяющая комплементарностьʺ и ʺCDRʺ, как применяют в настоящем описании, относяится к последовательностям аминокислот в вариабельных областях антитела, которые придают специфичность к антигену и аффинность связывания. Как правило, существуют три CDR в каждой вариабельной области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три CDR в каждой вариабельной области легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3).

Точные границы аминокислотной последовательности данной CDR могут быть определены с использованием любой из ряда хорошо известных схем, включающих схемы, описанные Kabat et al. (1991), ʺSequences of Proteins of Immunological Interest,ʺ 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации ʺКэбатʺ), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (схема нумерации ʺЧотиаʺ). Как применяют в настоящем описании, CDR, определенные согласно схеме номеров ʺЧотиаʺ также часто называют ʺгипервариабельные петли.ʺ

Например, по Кэбат, аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) нумеруются 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); а аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене легкой цепи (VL) нумеруются 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), и 89-97 (LCDR3). Согласно Чотиа, аминокислоты CDR в VH нумеруются 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2), и 95-102 (HCDR3); а аминокислотные остатки в VL нумеруются 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3). Посредством объединения определений CDR по Кэбат и Чотиа, CDR состоят из аминокислотных остатков 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в человеческой VH и аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в человеческой VL.

В целом, если не указано конкретно, молекулы антител против PD-1 могут включать любую комбинацию из одной или нескольких CDR по Кэбат и/или гипервариабельных петель по Чотиа, например, описанную в Таблице 2. В одном варианте осуществления, следующие определения применяют для молекул антител против PD-1, описанных в Таблице 2: HCDR1 согласно объединенным определением CDR по обоим Кэбат и Чотиа, и HCCDR 2-3 и LCCDR 1-3 согласно определению CDR по Кэбат. По всем определениям, каждая VH и VL типовым образом включает три CDR и четыре FR, расположенные от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

В варианте осуществления, молекула антитела представляет собой молекулу моноспецифического антитела и связывается с единственным эпитопом. Например, молекула моноспецифического антитела, имеющая множество последовательностей вариабельного домена иммуноглобулина, каждая из которых связывается с одним и тем же эпитопом.

В варианте осуществления молекула антитела представляет собой молекулу мультиспецифического антитела, например, она содержит множество последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина, где первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества имеет специфичность связывания для первого эпитопа, а вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества имеет специфичность связывания для второго эпитопа. В варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на одном и том же антигене, например, одном и том же белке (или одной и той же субъединице мультмерного белка). В варианте осуществления первый и второй эпитопы перекрываются. В варианте осуществления первый и второй эпитопы не перекрываются. В варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на различных антигенах, например, различных белках (или различных субъединицах мультимерного белка). В варианте осуществления молекула мультиспецифического антитела содержит последовательность третьего, четвертого или пятого вариабельного домена иммуноглобулина. В варианте осуществления, молекула мультиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела, молекулу триспецифического антитела, или молекулу тетраспецифического антитела.

В варианте осуществления молекула мультиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело имеет специфичность к не более чем двум антигенам. Молекула биспецифического антитела характеризуется первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, который имеет специфичность связывания для первого эпитопа, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, который имеет специфичность связывания для второго эпитопа. В варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на одном и том же антигене, например, одном и том же белке (или одной и той же субъединице мультимерного белка). В варианте осуществления первый и второй эпитопы перекрываются. В варианте осуществления первый и второй эпитопы не перекрываются. В варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на различных антигенах, например, различных белках (или различных субъединицах мультимерного белка). В варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые имеют специфичность связывания для первого эпитопа, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые имеют специфичность связывания для второго эпитопа. В варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит половинное антитело, имеющее специфичность связывания для первого эпитопа, и половинное антитело, имеющее специфичность связывания для второго эпитопа. В варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит половинное антитело или его фрагмент, имеющие специфичность связывания для первого эпитопа, и половинное антитело или его фрагмент, имеющие специфичность связывания для второго эпитопа. В варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит scFv или его фрагмент, имеющие специфичность связывания для первого эпитопа, и scFv, или его фрагмент, имеющие специфичность связывания для второго эпитопа. В варианте осуществления первый эпитоп расположен на PD-1, а второй эпитоп расположен на TIM-3, LAG-3, CEACAM (например, CEACAM-1 и/или CEACAM-5), PD-L1 или PD-L2.

Гуманизированное или CDR-привитое антитело будет иметь по меньшей мере одну или две, но обычно все три реципиентных CDR (тяжелых и/или легких цепей иммуноглобулина) замененных на донорную CDR. Антитело может быть заменено на по меньшей мере часть нечеловеческой CDR или только несколько из CDR могут быть заменены на нечеловеческие CDR. Необходимо только заменить количество CDR, требуемых для связывания гуманизированного антитела с PD-1. Предпочтительно, донором будет антитело грызуна, например, крысиное или мышиное антитело, а реципиентом будет человеческий каркас или человеческий консенсусный каркас. Обычно, иммуноглобулин, обеспечивающий CDR, именуют "донором", а иммуноглобулин, обеспечивающий каркас именуют "акцептором". В одном варианте осуществления, донорный иммуноглобулин не является человеческим (например, от грызунов). Акцепторный каркас является природным (например, человеческим) каркасом или консенсусным каркасом, или последовательностью на около 85% или выше, предпочтительно на 90%, 95%, 99% или выше идентичной с ним.

Как применяют в настоящем описании, термин "консенсусная последовательность" относится к последовательности, образованной из наиболее часто встречающихся аминокислот (или нуклеотидов) в семействе родственных последовательностей. В семействе белков, каждое положение в консенсусной последовательности занято аминокислотой, встречающейся наиболее часто в этом положении в семействе. Если две аминокислоты встречаются в равной степени часто, обе могут быть включены в консенсусную последовательность. "Консенсусный каркас" относится к каркасной области в консенсусной последовательности иммуноглобулина.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут включать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела или части антитела согласно изобретению. "Терапевтически эффективное количество" или ʺсовместно терапевтически эффективное количествоʺ относится к количеству, эффективному, при дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желательного терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество модифицированного антитела или фрагмента антитела могут варьировать в соответствии с факторами, такими как состояние заболевания, возраст, пол, и масса тела индивидуума, и способность антитела или части антитела вызывать желательный ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любые токсические или вредные воздействия модифицированного антитела или фрагмента антитела компенсируются терапевтически благоприятными эффектами. Терапевтически эффективная дозировка раскрытой комбинации предпочтительно ингибирует измеряемый параметр, например, скорость роста опухоли по меньшей мере на около 20%, более предпочтительно по меньшей мере на около 40%, даже более предпочтительно по меньшей мере на около 60%, и еще более предпочтительно по меньшей мере на около 80% относительно субъектов, не проходящих лечение. Способность комбинаций, раскрытых в настоящем описании ингибировать измеряемый параметр, например, злокачественное новообразование, могут оцениваться в клиническом испытании и оцениваться квалифицированным практиком.

"Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному, при дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желательного профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическую дозу применяют у субъектов до или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

Также в пределах объема изобретения находится набор, содержащий молекулу антитела против PD-1 и молекулу антитела против M-CSF, как описано в настоящем документе. Набор может включать один или более других элементов, включающих: инструкции по применению; другие реагенты, например, метку, терапевтическое средство, или средство, применимое для хелатообразования или иного сочетания антитела с меткой или терапевтическим средством, или радиопротекторную композицию; устройства или другие материалы для приготовления антитела для введения; фармацевтически приемлемые носители; и устройства или другие материалы для введения субъекту.

Список последовательностей

Заявка, рассматриваемая в данный момент, содержит Список Последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII, и полностью включен посредством ссылки в настоящее описание. Указанная копия ASCII, созданная 11 июля 2016 г., имеет название PAT057000_SL.txt и размер 55243 байтов.

Примеры антител-антагонистов макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF)

Различные формы M-CSF, как описано ниже, функционируют посредством связывания с его рецептором (M-CSFR) на целевых клетках. M-CSFR представляет собой трансмембранную молекулу с пятью внеклеточными иммуноглобулиноподобными доменами, трансмембранным доменом и внутриклеточным разомкнутым относящимся к Src доменом тирозинкиназы. M-CSFR кодируется протоонкогеном c-fms. Связывание M-CSF с внеклеточным доменом M-CSFR приводит к димеризации рецептора, которая активирует домен цитоплазматической киназы, приводя к аутофосфорилированию и фосфорилированию других клеточных белков (Hamilton J. A., J Leukoc Biol.,62(2):145-55 (1997); Hamilton J, A., Immuno Today., 18(7): 313-7(1997).

М-РНК непроцессированного человеческого M-CSF (также известного как колониестимулирующий фактор (CSF-1)) кодирует белок-предшественник их 554 аминокислот. Посредством альтернативного сплайсинга мРНК и дифференцированного посттрансляционного протеолитического процессинга, M-CSF может либо секретироваться в кровообращение в виде гликопротеина или хондроитинсульфата, содержащего протеогликан, или экспрессироваться в виде трансмембранного гликопротеина на поверхности M-CSF-продуцирующих клеток. Трехмерная структура бактериально экспрессированных аминоконцевых 150 аминокислот человеческого M-CSF, минимальной последовательности, требуемой для полной биологической активности in vitro, указывает на то, что этот белок является дисульфидно связанным димером, в котором каждый мономер состоит из четырех альфа-спиральных пучков и антипараллельного бета-листа (Pandit et al., Science 258: 1358-62 (1992)). Три отличающихся вида M-CSF продуцируются через альтернативный сплайсинг мРНК. Тремя полипептидными предшественниками являются M-CFSα из 256 аминокислот, M-CSFβ из 554 аминокислот и M-CSFγ из 438 аминокислот. M-CSFβ представляет собой секретируемый белок, который не встречается в мембраносвязанной форме. M-CSFα экспрессируется в виде интегрального мембранного белка, который медленно высвобождается под действием протеолитического расщепления. M-CSFα расщепляется по аминокислотам 191-197. Мембраносвязанная форма M-CSF может взаимодействовать с рецепторами на близлежащих клетках и, следовательно, опосредует специфические контакты между клетками. Термин "M-CSF" может также включать аминокислоты 36-438.

Были описаны антагонисты M-CSF. Антагонист M-CSF из комбинации может представлять собой малую молекулу, антитело или другой антигенсвязывающий белок, малую молекулу, нуклеиновую кислоту (такую как миРНК), или любую другую такую молекулу, которая препятствует активации и функции M-CSF.

В одном примере, антагонистом M-CSF является молекула антитела против M-CSF. Антитела против M-CSF, которые могут быть применимыми в настоящем изобретении, включают такие антитела против M-CSF, раскрытые в публикации Международной патентной заявки № WO 2005/068503, которая полностью раскрыта в настоящем описании посредством ссылки по причине описания антител против M-CSF. WO 2005/068503 раскрывает, например, антитела, которые связываются с такими же самыми эпитопами, что и антитела RX1, 5H4, MC1 и/или MC3, фармацевтические готовые формы, включающие специфические антитела против M-CSF, сконструированные с учетом требований эргономики™ версии вышеуказанных антител и способы получения фармацевтических лекарственных форм. Термин "антитело" применяется в самом широком смысле и включает полностью собранные антитела, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), фрагменты антител, которые могут связываться с антигеном (например, Fab', F'(ab)2, Fv, одноцепочечные антитела, диатела), и рекомбинантные пептиды, содержащие приведенные выше, при условии, что они проявляют желательную биологическую активность.

Другие антитела против M-CSF, которые могут быть применимыми в настоящем изобретении, включают такие антитела против M-CSF, раскрытые в международных публикациях № WO 2003/028752, US2009117103 и US2005059113, каждая из которых полностью раскрыта в настоящем описании посредством ссылки по причине описания молекул антител против M-CSF.

В одном варианте осуществления, молекула антитела, применимая в способах согласно изобретению, включает молекулу антитела, которая связывается с линейным эпитопом, представленным RFRDNTPN (SEQ ID NO: 42) или RFRDNTAN (SEQ ID NO: 43). Такое антитело является сконструированным с учетом требований эргономики антителом RX1 (H-RX1), раскрытым в WO 2005/068503. В одном другом варианте осуществления, антитело может являться молекулой антитела, которое связывается с линейным эпитопом, представленным ITFEFVDQE (SEQ ID NO: 44). Таким антителом является 5H4, раскрытое в WO 2005/068503.

В одном варианте осуществления, H-RX1 применяют в комбинации согласно изобретению. Тяжелые и легкие константные, вариабельные области, и области, определяющие комплементарность (CDR), антитела H-RX1 или его антигенсвязывающего фрагмента показаны в Таблице 1.

Таблица 1. H-RX1, антитело против M-CSF

В одном варианте осуществления, антитело-антагонист M-CSF представляет собой молекулу гуманизированного антитела, имеющего последовательность вариабельной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 1, и последовательность вариабельной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 2. В одном другом варианте осуществления, молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит домены CDR1, CDR2 и CDR3; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит домены CDR1, CDR2, и CDR3, где вариабельная область CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO:5; а вариабельная область CDR3 легкой цепи содержит аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8; и, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с M-CSF с аффинностью связывания, равной около 10^-7 M. Антитело или его фрагмент могут дополнительно включать вариабельную область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID No:4; и вариабельную область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO:7. Антитело или его фрагмент могут дополнительно включать вариабельную область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO:3; и вариабельную область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO:6.

В еще одном другом примере, гуманизированное антитело или сконструированное с учетом требований эргономики антитело или его фрагмент применимые в способах изобретения, связываются с человеческим M-CSF, где указанное антитело связывается с эпитопом M-CSF, который содержит по меньшей мере 4 смежных остатка RFRDNTPN (SEQ ID NO: 42) или RFRDNTAN (SEQ ID NO: 43), где указанное антитело имеет Kd аффинности (константу равновесия при диссоциации) по отношению к человеческому M-CSF, равную по меньшей мере 10^-7 M, где указанное антитело содержит все три CDR тяжелой цепи, как установлено выше.

Антитела, раскрытые в настоящем описании, могут представлять собой производные одноцепочечных антител, диател, доменных антител, нанотел и унител. Например, изобретение предоставляет изолированное моноклональное антитело (или его функциональный фрагмент), содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% является идентичной с аминокислотной последовательностью с SEQ ID NO: 1; вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% является идентичной с аминокислотной последовательностью с SEQ ID NO:2; антитело связывается с M-CSF (например, человеческим и/или обезьяньим M-CSF) и нейтрализует сигнальную активность M-CSF при сравнении с вариабельными областями, отображенными в последовательности, описанной выше.

В других вариантах осуществления, аминокислотные последовательности вариабельной тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной легкой цепи (VL) могут быть на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными с последовательностями, приведенными в Таблице 1 выше.

В некоторых вариантах осуществления, антитело согласно изобретению, имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где одна или несколько из этих последовательностей CDR имеют установленные аминокислотные последовательности на основе антител, описанных в настоящем документе, или их консервативных модификаций, и, где антитела сохраняют желательные функциональные свойства M-CSF-связывающих антител, описанные в Таблице 1.

Соответственно, изобретение предоставляет изолированное моноклональное антитело против M-CSF или его фрагмент, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где: аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 3, и ее консервативные модификации; аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 4 и ее консервативные модификации; аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 5 и ее консервативные модификации; аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи включает SEQ ID NO: 6 и ее консервативные модификации; аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи включает SEQ ID NO: 7 и ее консервативные модификации; аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи включает SEQ ID NO: 8 и ее консервативные модификации; молекула антитела специфически связывается с M-CSF, и нейтрализует активность M-CSF.

Антитела, применяемые в изобретении, могут представлять собой фрагмент антитела, которое связывается с M-CSF, выбранный из группы, состоящей из; Fab, F(ab₂)', F(ab)₂', scFv, VHH, VH, VL, dAbs. Способы получения антител против M-CSF описаны в WO 2005/068503.

Примеры антитела-антагониста PD-1

Молекулы PD-1, применимые в настоящем изобретении, могут представлять собой любые антагонисты PD-1. В одном примере, молекула антагониста PD-1, такая как молекула антитела против PD-1, может ингибировать, снижать или нейтрализовать одну или более активностей PD-1, что приводит к блокаде или снижению контрольной точки иммунного ответа. В одном варианте осуществления, молекула антагониста PD-1, такого как антитело против PD-1, приводит к одному или нескольким из: увеличения Т-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, увеличения опосредованной рецепторами T-клеток пролиферации, снижения иммунной эвазии злокачественными клетками, восстановления функции эффекторных клеток (например, одной или нескольких из пролиферации Т-клеток, секреции IFN-альфа или цитолитической функции), ингибирования функции регуляторных Т-клеток или воздействия на активность множества клеточных типов, таких как регуляторные Т-клетки, эффекторные Т-клетки и NK-клетки).

Молекулы PD-1, применимые в настоящем изобретении, показаны в Таблице 1, и описаны в публикации PCT PCT/US2015/012754, которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

В одном варианте осуществления, молекула антитела против PD-1 представляет собой гуманизированное антитело против PD-1 и включает вариабельный домен тяжелой цепи и константную область, вариабельный домен легкой цепи и константную область или обе из них, содержащие аминокислотную последовательность из BAP049-Клона-B или BAP049-Клона-E, как описано в Таблице 2, или кодируемые нуклеотидной последовательностью в Таблице 2. Молекула антитела против PD-1, необязательно, содержит лидерную последовательность из тяжелой цепи, легкой цепи или обеих, как показано в Таблице 3; или последовательность, идентичную с ней по существу.

В еще одном другом варианте осуществления, молекула антитела против PD-1 включает по меньшей мере одну, две, или три области, определяющих комплементарность (CDR) из вариабельной области тяжелой цепи антитела, описанного в настоящем документе, например, антитела, выбранного из любого из BAP049-Клона-B или BAP049-Клона-E, как описано в Таблице 2, или кодируемого нуклеотидной последовательностью в Таблице 2.

В варианте осуществления, например, варианте осуществления, содержащем вариабельную область, CDR (например, CDR по Чотиа или CDR по Кэбат), или другую последовательность, на которую ссылаются в настоящем описании, например, в Таблице 2, молекула антитела является молекулой моноспецифического антитела, молекулой биспецифического антитела или представляет собой молекулу антитела, которая содержит антигенсвязывающий фрагмент антитела, например, половинное антитело или антигенсвязывающий фрагмент половинного антитела.

Таблица 2: Тяжелая цепь и легкая цепь, CDR и тяжелая цепь и вариабельные домены легкой цепи антитела против PD-1

Таблица 3. Аминокислотные последовательности лидерных последовательностей тяжелой и легкой цепи для гуманизированных mAb BAP049-Клона-B и BAP049-Клона-E

Таблица 4. Аминокислотные последовательности константной области тяжелых цепей человеческого IgG и человеческой каппа легкой цепи

Генерация гуманизированных BAP049-Клона-B и BAP049-Клона E и их характеризация

Мышиное моноклональное антитело BAP049 против PD-1 было гуманизировано. Были получены последовательности и образцы для тестирования от шестнадцати клонов гуманизированного BAP049 с уникальными последовательностями их вариабельной области. Эти клоны дополнительно анализировали на предмет их биологических функций (например, связывания с антигеном и блокирования лиганда), структурных признаков и транзиентной экспрессии в клетках CHO.

Аффинность связывания и специфичность

Связывание иллюстративного гуманизированного антитела против PD-1 на человеческом белке PD-1 измеряли методом Biacore. Результаты представляют собой: Ka=2,78×10⁵ M^-1s^-1; Kd=2,13×10^-4 с^-1; K_D=0,0827±0,005505 нМ.

Технология и способ гуманизации

Гуманизацию BAP049 выполняли, используя комбинаторную библиотеку человеческих эмбриональных каркасов вариабельной области (FW). Технология предусматривает перенос мышиных CDR в рамке считывания в библиотеку человеческих вариабельных областей (VR), которые были построены посредством статистического комбинирования последовательностей FW1, FW2 и FW3 человеческой эмбриональной линии. Применяли только одну последовательность FW4, которая представляет собой WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 45) для тяжелой цепи (HC) (подгруппа I человеческой HC по Кэбат) и FGQGTKVEIK(SEQ ID NO: 46) для легкой цепи (LC) (подгруппа I человеческой κ по Кэбат). Библиотеку последовательностей VR гибридизировали с последовательностями человеческой константной области (CR), человеческой IgG4(S228P) из HC и человеческой κ CR из LC, и полученную в результате библиотеку целого IgG экспрессировали в клетках CHO для скрининга. Скрининг выполняли с супернатантами культуры ткани, измеряя авидность связывания на антиген-экспрессирующих клетках методом ELISA в полноклеточном формате или на FACS.

Способ гуманизации выполняли постадийным образом, начиная с построения и экспрессии соответствующего химерного mAb (мышиная VR, IgG4(S228P), человеческая κ), которое может служить в качестве компаратора для скрининга гуманизированных клонов. Гуманизацию VR из LC и HC выполняли на двух независимых стадиях. Библиотеку гуманизированной LC (huLC) спаривали с химерной HC (мышиная VR, IgG4(S228P)) и полученные в результате ʺгуманизированные наполовинуʺ mAb подвергали скринингу на связывание активность посредством ELISA. Отбирали huLC от клонов с адекватной активностью связывания (≥ связывания химерного mAb). Аналогично, библиотеку гуманизированной HC (huHC) спаривали с химерной LC (мышиная VR, человеческая κ) и подвергали скринингу на активность связывания посредством ELISA. Отбирали huHC от клонов с соответствующей активностью связывания (≥ связывания химерного mAb).

Вариабельные области отобранных huLC и huHC затем секвенировали, чтобы идентифицировать huLC и huHC с уникальными последовательностями (несколько клонов от первоначального процесса селекции могут иметь общие LC или HC). Уникальные huLC и huHC затем статистически комбинировали для образования небольшой библиотеки гуманизированных mAb (humAbs), которые экспрессировали в клетках CHO и подвергали скринингу на антиген-экспрессирующих клетках в формате ELISA и FACS. Клоны с активностями связывания, которые были равны связыванию или были лучше связывания химерного компаратора mAb представляют собой конечный продукт способа гуманизации.

Построение химерного антитела

Получали три варианта химерного антитела, которые имели остаток либо Cys, Tyr или Ser в положении 102 последовательности LC. Три химерных антитела, т.е., BAP049-chi (Cys), BAP049-chi (Tyr) и BAP049-chi (Ser) (также известные как BAP049-chi, BAP049-chi-Y, и BAP049-chi-S, соответственно), экспрессировали в клетках CHO и тестировали по их способности конкурировать с меченым мышиным антителом за связывание с PD-1-экспрессирующими клетками Юркат. Три варианта были неразличимыми в эксперименте по конкурентности. Результаты показывают, что три химерных mAb (Cys, Tyr, Ser) конкурируют в равной степени хорошо со связыванием меченого мышиного mAb BAP049. Небольшое различие между кривыми для химерного mAb и кривой мышиного mAb обусловлено вероятно различными методами, применяемыми для определения концентраций mAb. Концентрацию мышиного mAb определяли по измерению OD280, в то время как концентрации химерного mAb в супернатантах определяли с использованием ELISA, используя стандартный IgG4. Остаток эмбрионального Tyr был отобран для гуманизированного антитела.

Клоны гуманизированного антитела

Способ гуманизации дал на выходе шестнадцать клонов с аффиностями связывания, сравнимыми с аффиностью связывания химерного антитела. Дополнительно к данным по связыванию, для каждого клона, были предоставлены последовательности VR наряду с образцом mAb. Образцы были получены посредством транзиентных трансфекций клеток CHO, и супернатанты культуры ткани были концентрированы. Концентрации антитела в растворах определяли посредством IgG4-специфичного ELISA.

Шестнадцать уникальных клонов представляют собой комбинации четырех уникальных последовательностей HC и девяти уникальных последовательностей LC. Для областей HC FW, последовательности HC являются комбинациями последовательностей одной из двух различных VHFW1, одной из трех различных VHFW2 и одной из двух различных VHFW3. Для областей LC FW, последовательности LC являются комбинациями последовательностей одной из пяти различных VLFW1, одной из трех различных VLFW2, и одной из четырех различных VLFW3. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи для клонов B и E гуманизированного BAP049 показаны в Таблице 2. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности CDR тяжелой и легкой цепи клонов гуманизированного BAP049 также показаны в Таблице 2.

Селекция гуманизированных клонов

Отобранные клоны, включающие клоны B и E, дополнительно тестировали на предмет их способности блокировать связывание PD-L1 и PD-L2 с PD-1 и усиления активности Т-клеток в аналитических тестах in vitro с человеческими PBMC.

Экспрессия гуманизированного антитела против PD-1, BAP049

Пять гуманизированных клонов были отобраны для оценки экспрессии в клетках яичника китайского хомяка (CHO).

Векторы единичного гена (SGV) были построены с использованием GS Xceed векторов Лонцы (IgG4proΔk для тяжелой цепи и Каппа для легкой цепи). SGV амплифицировали и транзиентно совместно трансфицировали в клетки CHOK1SV GS-KO для экспрессии в объеме 2,8 л.

Культуры экспрессии собирали в День 6 после трансфекции и осветляли центрифугированием и стерилизующей фильтрацией. Осветленный супернатант культур клеток очищали, используя одностадийную хроматографию с Белком А. Анализ качества продукта в виде SE-ВЭЖХ, SDS-PAGE, IEF и LAL проводили, используя очищенное вещество при концентрации, равной 1 мг/мл, включая антитело в качестве контрольного образца.

Построение вектора

Последовательности областей, кодирующих вариабельный домен легкой и тяжелой цепи, синтезировали в GeneArt AG. Области, кодирующие вариабельный домен легкой цепи, субклонировали в pXC-Каппа, а области, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи, субклонировали в векторы pXC-IgG4pro ΔK, соответственно, используя N-концевой сайт рестрикции Hind III и C-концевые сайты рестрикции BsiWI (легкая цепь) и ApaI (тяжелая цепь). Позитивные клоны подвергали скринингу посредством ПЦР-амплификации (праймеры 1053: GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC (SEQ ID NO: 47) и 1072: CAAATGTGGTATGGCTGA (SEQ ID NO: 48)) и верифицировали посредством рестрикционного расщепления (используя двойное расщепление по EcoRI-HF и HindIII-HF) и нуклеотидного секвенирования гена, представляющего интерес.

Амплификация ДНК

Одиночную бактериальную колонию пикировали в 15 мл среды Луриа-Бертани (LB) (LB Broth, Sigma-Aldrich, L7275), содержащую 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37°C в течение ночи при встряхивании при 220 об/мин. Полученную стартовую культуру применяли для инокуляции 1 л среды Луриа-Бертани (LB), содержащую 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37°C в течение ночи при встряхивании при 220 об/мин. ДНК вектора изолировали, используя систему QIAGEN Plasmid Plus Gigaprep (QIAGEN, 12991). Во всех случаях, концентрацию ДНК измеряли, используя спектрофотометр Nanodrop 1000 (Thermo-Scientific), и доводили до 1 мг/мл буфером EB (10 мМ Tris-Cl, pH 8,5). Качество ДНК для векторов единичного гена оценивали посредством измерения отношения поглощения A260/A280. Было установлено, что оно составляет между 1,88 и 1,90.

Культура клеток CHOK1SV GS-KO

Клетки CHOK1SV GS-KO культивировали в среде CD-CHO, (Invitrogen, 10743-029), дополненной 6 мМ глутамина (Invitrogen, 25030-123). Клетки инкубировали во встряхивателе-инкубаторе при 36,5°C, 5% CO₂, 85% влажности, 140 об/мин. Клетки обычным образом субкультивировали каждые 3-4 дня, засевая при 2×10⁵ клеток/мл, и размножали, чтобы иметь достаточно клеток, доступных для трансфекции. Клетки удаляли после 20 пассирования.

Транзиентные трансфекции клеток CHOK1SV GS-KO

Транзиентные трансфекции выполняли, используя клетки CHOK1SV GS-KO, которые находились в культуре минимально две недели. Клетки субкультивровали за 24 ч до трансфекции, и жизнеспособность клеток составляла >99% во время трансфекции.

Все трансфекции выполняли посредством электропорации, используя Gene Pulse MXCell (Bio-Rad), систему на основе планшета для электропорации. Для каждой трансфекции, жизнеспособные клетки ресуспендировали в предварительно нагретой среде до 2,86×10⁷ клеток/мл. 80 мкг ДНК (отношение 1:1 тяжелой и легкой цепи SGV) и 700 мкл клеточной суспензии, распределяли аликвотами в каждую кювету/лунку. Клетки электропорировали при 300 В, 1300 мкФ. Трансфицированные клетки переносили в предварительно нагретую среду в колбах Эрленмейера и кювету/лунки споласкивали дважды предварительно нагретой средой, которую также переносили в колбы. Трансфсцированные клеточные культуры инкубировали во встряхивателе-инкубаторе при 36,5°C, 5% CO₂, 85% влажности, 140 об/мин. в течение 6 дней. Жизнеспособность клеток и концентрации жизнеспособных клеток измеряли во время сбора, используя автоматизированный цитометр Cedex HiRes (Roche).

Характеризация аффинности связывания и специфичности гуманизированного антитела против PD-1

Связывание иллюстративного гуманизированного антитела против PD-1, включая Клон B и Клон E, как показано в Таблице 2 на белке человеческого PD-1, измеряли, используя метод Biacore. Результаты представляют собой: Ka=2,78×10⁵ M^-1с^-1; Kd=2,13×10^-4 с^-1; K_D=0,0827±0,005505 нМ.

Связывание одного и того же гуманизированного антитела против PD-1 на человеческих PD-1-экспрессирующих клетках 30019 измеряли, используя анализ FACS. Результат показывает, что антитело против PD-1 (человеческий IgG4) связывается с высокой аффинностью с человеческим PD-1 по сравнению с изотипическим контролем человеческого IgG4.

Было обнаружено, что иллюстративное гуманизированное антитело против PD-1 проявляет высокую аффинность к белку PD-1 макаки и экспрессирующим PD-1 макаки клеткам 30019. По данным измерений методом Biacore, антитело против PD-1 связывается с PD-1 макаки с K_D, равным 0,093±0,015 нМ. Аффинность связывания с PD-1 макаки является сравнимой с его аффинностью связывания с человеческим PD-1.

Дополнительные анализы связывания показывают, что иллюстративное гуманизированное антитело против PD-1 не является перекрестно реагирующим с мышиным PD-1 или перекрестно реагирующим с родительской клеточной линией.

Блокирование взаимодействий между PD-1 и его лигандами

Исследовали способность иллюстративного гуманизированного антитела против PD-1 блокировать взаимодействия между PD-1 и обоими его известными лигандами, PD-L1 и PD-L2. результаты показывают, что антитело против PD-1 блокировало связывание PD-L1 и PD-L2 на человеческих PD-1-экспрессирующих клетках 30019 в сравнении с контрольным изотипом человеческого IgG4 и контролем без антитела. Антитело против PD-1 блокировало связывание PD-L1 на клетках 30019 с IC50, равным 0,94±0,15 нМ. Такое же антитело блокировало связывание PD-L2 на клетках 30019 с IC50, равным 1,3±0,25 нМ.

Биологическая активность и функция антитела против PD-1

В других вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела способны к связыванию с человеческим PD-1 с константой диссоциации (K_D) менее около 0,2 нМ.

В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела связываются с человеческим PD-1 с K_D менее около 0,2 нМ, 0,15 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ или 0,02 нМ, например, от около 0,13 нМ до 0,03 нМ, например, от около 0,077 нМ до 0,088 нМ, например, около 0,083 нМ, например, измеренной методом Biacore.

В других вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела связываются с PD-1 макаки с K_D менее около 0,2 нМ, 0,15 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ или 0,02 нМ, например, от около 0,11 нМ до 0,08 нМ, например, около 0,093 нМ, например, измеренной методом Biacore.

В некоторых вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела связываются с обоими человеческим PD-1 и PD-1 макаки с аналогичной K_D, например, в интервале нМ, например, измеренной методом Biacore. В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела связываются с человеческим гибридным белком PD-1-Ig с K_D менее около 0,1 нМ, 0,075 нМ, 0,05 нМ, 0,025 нМ или 0,01 нМ, например, около 0,04 нМ, например, измеренной ELISA.

В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела связываются с клетками Юркат, которые экспрессируют человеческий PD-1 (например, человеческий PD-1-трансфицированный с клетками Юркат) с K_D менее около 0,1 нМ, 0,075 нМ, 0,05 нМ, 0,025 нМ, или 0,01 нМ, например, около 0,06 нМ, например, измеренной анализом FACS.

В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела связываются с Т-клетами макаки с K_D менее около 1нМ, 0,75 нМ, 0,5 нМ, 0,25 нМ, или 0,1 нМ, например, около 0,4 нМ, например, измеренной анализом FACS.

В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела связываются с клетками, которые экспрессируют PD-1 макаки (например, клетками, трансфицированными с PD-1 макаки) с K_D менее около 1нМ, 0,75 нМ, 0,5 нМ, 0,25 нМ, или 0,01 нМ, например, около 0,6 нМ, например, измеренной анализом FACS.

В других вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела способны снижать связывание PD-1 с PD-L1, PD-L2 или обоими, или с клеткой, которая экспрессирует PD-L1, PD-L2 или оба. В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела снижают (например, блокируют) связывание PD-L1 с клеткой, которая экспрессирует PD-1 (например, клетками 30019, экспрессирующими человеческий PD-1) с IC50 менее около 1,5 нМ, 1 нМ, 0,8 нМ, 0,6 нМ, 0,4 нМ, 0,2 нМ или 0,1 нМ, например, между около 0,79 нМ и около 1,09 нМ, например, около 0,94 нМ или около 0,78 нМ или менее, например, около 0,3 нМ. В нескольких вариантах осуществления, вышеуказанные антитела снижают (например, блокируют) связывание PD-L2 с клеткой, которая экспрессирует PD-1 (например, человеческими PD-1-экспрессирующими клетками 30019) с IC50 менее около 2 нМ, 1,5 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ или 0,2 нМ, например, между около 1,05 нМ и около 1,55 нМ или около 1,3 нМ или менее, например, около 0,9 нМ.

В других вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела способны к усилению антиген-специфичного Т-клеточного ответа.

В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела увеличивают экспрессию IL-2 из клеток, активированных энтеротоксином В стафилококков (SEB) (например, при 25 мкг/мл) по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5-кратно, например, приблизительно 2-3-кратно, например, приблизительно 2-2,6-кратно, например, приблизительно 2,3-кратно, по сравнению с экспрессией IL-2, когда применяют изотипический контроль (например, IgG4), например, измеренную в аналитическом тесте на активацию Т-клеток SEB или тесте ex vivo с человеческой цельной кровью.

В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела увеличивают экспрессию IFN-γ из Т-клеток, стимулированных антисывороткой против CD3 (например, при 0,1 мкг/мл) по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5-кратно, например, приблизительно 1,2-3,4-кратно, например, приблизительно 2,3-кратно, по сравнению с экспрессией IFN-γ, когда применяют изотипический контроль (например, IgG4), например, измеренную в аналитическом тесте на активность IFN-γ.

В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела увеличивают экспрессию IFN-γ из Т-клеток, активированных SEB (например, при 3 пг/мл) по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5-кратно, например, приблизительно 0,5-4,5-кратно, например, приблизительно 2,5-кратно, по сравнению с экспрессией IFN-γ, когда применяют изотипический контроль (например, IgG4), например, измеренную в аналитическом тесте на активность IFN-γ.

В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела увеличивают экспрессию IFN-γ из Т-клеток, активированных пептидом CMV по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5-кратно, например, приблизительно 2-3,6-кратно, например, приблизительно 2,8-кратно, по сравнению с экспрессией IFN-γ, когда применяют изотипический контроль (например, IgG4), например, измеренную в аналитическом тесте на активность IFN-γ.

В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела увеличивают пролиферацию Т-клеток CD8⁺, активированных пептидом CMV по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5-кратно, например, приблизительно 1,5-кратно, по сравнению с пролиферацией Т-клеток CD8⁺, когда применяют изотипический контроль (например, IgG4), например, измеренную по процентной доле Т-клеток CD8+, которые проходят через по меньшей мере n (например, n=2 или 4) делений клеток.

В некоторых вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела имеют Cmax между приблизительно 100 мкг/мл и приблизительно 500 мкг/мл, между приблизительно 150 мкг/мл и приблизительно 450 мкг/мл, между приблизительно 250 мкг/мл и приблизительно 350 мкг/мл, или между приблизительно 200 мкг/мл и приблизительно 400 мкг/мл, например, приблизительно 292,5 мкг/мл, например, измеренную у обезьян.

В некоторых вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела имеют T_1/2 между приблизительно 250 часами и приблизительно 650 часами, между приблизительно 300 часами и приблизительно 600 часами, между приблизительно 350 часами и приблизительно 550 часами или между приблизительно 400 часами и приблизительно 500 часами, например, приблизительно 465,5 часами, например, измеренное у обезьян.

В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела связываются с PD-1 с Kd медленнее 5×10^-4, 1×10^-4, 5×10^-5 или 1×10^-5 с^-1, например, приблизительно 2,13×10^-4 с^-1, например, измеренной методом Biacore. В нескольких вариантах осуществления, молекулы вышеуказанного антитела связываются с PD-1 с Ka быстрее 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, или 5×10⁵ M^-1 с^-1, например, приблизительно 2,78×10⁵ M^-1с^-1, например, измеренной методом Biacore.

Дополнительные партнеры комбинации

Партнеры комбинации антитела против PD-1 и антитела против M-CSF в любом варианте осуществления предпочтительно составляют или применяют, чтобы они были совместно терапевтически активными. Это означает, в частности, что имеется по меньшей мере один благоприятный эффект, например взаимное усиление эффекта партнеров комбинации, в частности, например, синергизм, более чем аддитивный эффект, дополнительные преимущественные эффекты (например, дополнительный терапевтический эффект, не обнаруженный для любого из одиночных антител), меньше побочных эффектов и/или комбинированный терапевтический эффект при дозировке, неэффективной для одного или обоих партнеров комбинации. Например, термин "совместно (терапевтически) активные" может означать, что соединения могут даваться раздельно или последовательно (в хронологически разделенном шахматном порядке, особенно специфичном к последовательности) в таких временных интервалах, что они, предпочтительно, у теплокровного животного, особенно, человека, подлежащего лечению, все еще показывают (предпочтительно усиленное, более аддитивного, или синергестическое) взаимодействие (совместный терапевтический эффект). Совместный терапевтический эффект может, среди прочего, определяться по снижению объема опухоли или уменьшению симптомов и, как описано ниже.

В одном аспекте, изобретение относится к лечению субъекта in vivo с использованием комбинации молекул антитела против PD-1 и молекул антитела против M-CSF, таким образом, что рост злокачественных опухолей, как описано в настоящем документе, ингибируется или снижается. Комбинация антитела против PD-1 и молекул антитела против M-CSF может применяться по отдельности, чтобы ингибировать рост злокачественных опухолей или может применяться в комбинации с одним или несколькими из: стандартного лечения (например, злокачественных новообразований), одного другого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, иммуномодулятора (например, активатора костимулирующей молекулы или ингибитора ингибирующей молекулы); или вакцины, например, терапевтической противораковой вакцины других форм клеточной иммунотерапии.

В одном примере, комбинация, описанная в настоящем документе может применяться для лечения рака молочной железы, такого как позитивный к эндокринному рецептору (рецептору эстрогена или прогестерона), HER2-позитивный, трижды негативный (непозитивный к рецепторам для эстрогена, прогестерона или HER2) или трижды позитивный (позитивный для эстрогенных рецепторов, прогестероновых рецепторов и HER2). Субъекты со злокачественным новообразованием, получающие комбинацию, могут быть пациентами, которые прежде проходили лечение с использованием стандартной терапии (будет зависеть от стадии рака молочной железы) или пациентами, проходящими лечение с использованием стандартной терапии, или пациентами, не получавших еще никакого лечения. В одном примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих прогрессирующий трижды негативный рак молочной железы, которые проходили лечение или которые получают стандартную терапию, но показывают прогрессирование заболевания.

В одном другом примере, комбинация, описанная в настоящем документе, может применяться для лечения меланомы. Субъекты со злокачественным новообразованием, получающие комбинацию, могут быть пациентами, которые прежде проходили лечение или проходят лечение с использованием стандартной терапии (например, карбоплатин с паклитакселом или Карбоплатин/Гемцитабин или паклитаксел) или являются резистентными или рефрактерными к другим иммуномодуляторным ингибиторам контрольных точек иммунного ответа (например, PD-1 или PD-L1), или пациентами, не получавших еще никакого лечения. В одном примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих меланому, которые проходили лечение с использованием PD-1 или PD-L1, и которые являются резистентными или рефрактерными к такому лечению, или которые получают стандартное лечение, но показывают прогрессирование заболевания.

В одном другом примере, комбинация, описанная в настоящем документе, может применяться для лечения рака яичника. Субъекты со злокачественным новообразованием, принимающие комбинацию, могут быть пациентами, которые прежде проходили лечение или проходят лечение с использованием стандартной терапии (например, карбоплатином с паклитакселом или Карбоплатином/Гемцитабином или паклитакселом), или пациентами, которые еще не получали какой-либо терапии. В одном примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих прогрессирующий рак яичника, которые проходили лечение с использованием стандартной терапии или получают стандартное лечение, но показывают прогрессирование заболевания.

В одном примере, комбинация, описанная в настоящем документе, может применяться для лечения рака поджелудочной железы. Субъекты со злокачественным новообразованием, принимающие комбинацию, могут быть пациентами с раком поджелудочной железы, которые прежде проходили лечение с использованием стандартной терапии (например, гемцитабином), или проходят лечение с использованием стандартной терапии, или пациентами, которые еще не получали какой-либо терапии. В одном примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих прогрессирующий рак поджелудочной железы, которые проходили лечение с использованием стандартной терапии, или которые получают стандартное лечение, но показывают прогрессирование заболевания. Комбинация, описанная в настоящем документе, может вводиться пациентам, которые получают стандартное лечение, или которые получали стандартное лечение.

В одном другом примере, комбинация, описанная в настоящем документе, может применяться для лечения глиобластомы. Субъекты со злокачественным новообразованием, принимающие комбинацию, могут быть пациентами, которые прежде проходили лечение с использованием стандартной терапии, или проходят лечение с использованием стандартной терапии, или пациентами, которые еще не получали какой-либо терапии. В одном примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих глиобластому, которые проходили лечение с использованием стандартной терапии, но показывают прогрессирование заболевания.

В одном другом примере, комбинация, описанная в настоящем документе, может применяться для лечения рака легких, такого как немелкоклеточный рак легких (NSCLC), аденокарцинома легкого или плоскоклеточный рак легких. Субъекты со злокачественным новообразованием, принимающие комбинацию, могут быть пациентами с раком легких, которые прежде проходили лечение с использованием стандартной терапии (например, карбоплатином/гемцитабином или паклитакселом), или проходят лечение с использованием стандартной терапии, или пациентами, которые еще не получали какой-либо терапии. В одном примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих рак легких, которые проходили лечение с использованием стандартной терапии, но показывают прогрессирование заболевания.

В одном другом примере, комбинация, описанная в настоящем документе, может применяться для лечения почечно-клеточной карциномы. Субъекты со злокачественным новообразованием, принимающие комбинацию, могут быть пациентами, которые прежде проходили лечение с использованием стандартной терапии, или проходят лечение с использованием стандартной терапии или пациентами, которые еще не получали какой-либо терапии. В одном примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих почечно-клеточную карциному, которые проходили лечение с использованием стандартной терапии, но показывают прогрессирование заболевания.

В одном другом примере, комбинация, описанная в настоящем документе, может применяться для лечения диффузной В-крупноклеточной лимфомы. Субъекты со злокачественным новообразованием, принимающие комбинацию, могут быть пациентами которые прежде проходили лечение с использованием стандартной терапии, или проходят лечение с использованием стандартной терапии, или пациентами, которые еще не получали какой-либо терапии. В одном примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих диффузную В-крупноклеточную лимфому, которые проходили лечение с использованием стандартной терапии, но показывают прогрессирование заболевания.

В одном другом примере, комбинация, описанная в настоящем документе, может применяться для лечения мезотелиомы. Субъекты со злокачественным новообразованием, принимающие комбинацию, могут быть пациентами, которые прежде проходили лечение с использованием стандартной терапии, или проходят лечение с использованием стандартной терапии, или пациентами, которые еще не получали какой-либо терапии. В одном примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих мезотелиому, которые проходили лечение с использованием стандартной терапии, но показывают прогрессирование заболевания.

В одном другом примере, комбинация, описанная в настоящем документе, может применяться для лечения назофарингеальной карциномы. Субъекты со злокачественным новообразованием, принимающие комбинацию, могут быть пациентами, которые прежде проходили лечение или проходят лечение с использованием стандартной терапии, или пациентами, которые еще не получали какой-либо терапии. В одном примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих назофарингеальную карциному, которые проходили лечение с использованием стандартной терапии, но показывают прогрессирование заболевания.

В еще одном другом примере, комбинация, описанная в настоящем документе, может применяться для лечения злокачественного новообразования, которое является резистентным или рефрактерным к иммуномодулятору, такому как ингибитор молекулы контрольной точки иммунного ответа. В одном варианте осуществления, иммуномодулятор представляет собой ингибитор PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 и/или TGFR бета. В одном другом примере иммуномодулятор явлется антителом против PD-1 или против PD-L1. В этом примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих прогрессирующий трижды негативный рак молочной железы, которые прежде проходили лечение с использованием антитела против PD-1 или против PDL1, но показывают прогрессирование заболевания. В одном другом примере, комбинацию, описанную в настоящем документе, применяют для лечения пациентов, имеющих меланому, которые прежде проходили лечение с использованием антитела против PD-1 или против PDL1, но показывают прогрессирование заболевания.

Таким образом, комбинация согласно изобретению предоставляет способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, включающего введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинации, описанной в настоящем документе. В одном другом варианте осуществления, комбинация согласно изобретению может вводиться по отдельности или в комбинации с одним или несколькими другими средствами, и комбинация может вводиться в любом порядке или одновременно. В одном примере, комбинационная терапия, раскрытая в настоящем описании, может включать композицию согласно настоящему изобретению, составленную вместе с и/или совместно вводимую вместе с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, например, одним или несколькими средствами против злокачественного новообразования, цитотоксическими или цитостатическими средствами, гормональной терапией, вакцинами, и/или другой иммунотерапией. В других вариантах осуществления, комбинация, описанная в настоящем документе, может вводиться в комбинации с другими терапевтическими модальностями лечения, включающих хирургическое вмешательство, облучение, криохирургию, и/или термотерапию. В таких комбинационных терапиях могут преимущественно использоваться более низкие дозировки вводимых терапевтических средств, что, таким образом, позволяет избежать возможных токсичностей или осложнений, ассоциированных с различными монотерапиями.

Под выражением ʺв комбинации сʺ не подразумевают то, что терапия или терапевтические средства должны вводиться в одно и то же время и/или быть составлены для доставки вместе, несмотря на то, что эти способы доставки попадают в объем, описанный в настоящем документе. Молекулы антитела против PD-1 и антитела против M-CSF могут вводиться параллельно с, до или после одной или нескольких других дополнительных терапий или терапевтических средств. Молекулы антитела против PD-1 и антитела против M-CSF и другое средство или терапевтический протокол могут вводиться в любом порядке. В целом, каждое средство будет вводиться при дозе и/или по графику выполнения, определенных для данного средства. Следует дополнительно учитывать, что используемое дополнительное терапевтическое средство может вводиться вместе в единой композиции или вводиться раздельно в различных композициях. Как правило, ожидают, что дополнительные терапевтические средства, используемые в комбинации, будут использоваться при уровнях, которые не превышают уровней, при которых они используются индивидуально. В нескольких вариантах осуществления, уровни, используемые в комбинации, будут ниже, чем уровни, используемые индивидуально.

В некоторых вариантах осуществления, комбинацию совместно изобретению вводят в комбинации с одним или несколькими другими ингибиторами PD-1, PD-L1 и/или PD-L2, известными в данной области. Антагонист может представлять собой антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, гибридный белок или олигопептид. В нескольких вариантах осуществления, другое антитело против PD-1 выбирают из MDX-1106, Merck 3475 или CT-011. В нескольких вариантах осуществления, ингибитором PD-1 является иммуноадгезин (например, иммуноадгезин, содержащий внеклеточную или связывающую PD-1 часть PD-Ll или PD-L2, гибридизированную с константной областью (например, областью Fc последовательности иммуноглобулина). В нескольких вариантах осуществления, ингибитором PD-1 является AMP-224. В нескольких вариантах осуществления, ингибитор PD-L1 представляет собой антитело против PD-L1. В нескольких вариантах осуществления, антагонист связывания против PD-Ll выбирают из YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, MSB-0010718C или MDX-1105. MDX-1105, также известный как BMS-936559, является антителом против PD-L1, описанным в WO2007/005874. Антитело YW243.55.S70 (последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи показаны в SEQ ID No. 20 и 21, соответственно) является антителом против PD-L1, описанным в WO 2010/077634.

MDX-1106, также известный как MDX-1106-04, ONO-4538 или BMS-936558, представляет собой антитело против PD-1, описанное в WO2006/121168. Merck 3745, также известное как MK-3475 или SCH-900475, представляет собой антитело против PD-1, описанное в WO2009/114335. Пидилизумаб (CT-011; Cure Tech) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG1k, которое связывается с PD-1. Пидилизумаб и другие гуманизированные моноклональные антитела против PD-1 раскрыты в WO2009/101611. В других вариантах осуществления, антителом против PD-1 является пембролизумаб. Пембролизумаб (Торговое наименование Китруда, ранее ламбролизумаб, также известный как MK-3475) раскрыт, например, в Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44. AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; например, раскрыт в WO2010/027827 и WO2011/066342), представляет собой Fc гибридный растворимый рецептор PD-L2, который блокирует взаимодействие между PD-1 и B7-H1. Другие антитела против PD-1 включают AMP 514 (Амплиммун), среди других, например, антитела против PD-1, раскрытые в US 8,609,089, US 2010028330 и/или US 20120114649.

Иллюстративные другие средства, которые могут комбинироваться с комбинацией согласно изобретению, могут включать химиотерапевтические средства для стандартного лечения, включающие, но не ограниченные приведенными, анастрозол (Arimidex^®), бикалутамид (Casodex^®), блеомицина сульфат (Blenoxane^®), бусулфан (Myleran^®), бусулфан для инъекций (Busulfex^®), капецитабин (Xeloda^®), N4-пентоксикарбонил-5-дезокси-5-фторцитидин, карбоплатин (Paraplatin^®), кармустин (BiCNU^®), хлорамбуцил (Leukeran^®), цисплатин (Platinol^®), кладрибин (Leustatin^®), циклофосфамид (Cytoxan^® или Neosar^®), цитарабин, цитозина арабинозид (Cytosar-U^®), цитарабин липосомальный для инъекций (DepoCyt^®), дакарбазин (DTIC-Dome^®), дактиномицин (Actinomycin D, Cosmegan), даунорубицина гидрохлорид (Cerubidine^®), даунорубицина цитрат липосомальный для инъекций (DaunoXome^®), дексаметазон, доцетаксел (Taxotere^®), доксорубицина гидрохлорид (Adriamycin^®, Rubex^®), этопозид (Vepesid^®), флударабина фосфат (Fludara^®), 5-фторурацил (Adrucil^®, Efudex^®), флутамид (Eulexin^®), тезацитибин, Гемцитабин (дифтордезоксицитидин), гидроксимочевину (Hydrea^®), Идарубицин (Idamycin^®), ифосфамид (IFEX^®), иринотекан (Camptosar^®), L-аспарагиназа (ELSPAR^®), лейковорин кальция, мелфалан (Alkeran^®), 6-меркаптопурин (Purinethol^®), метотрексат (Folex^®), митоксантрон (Novantrone^®), милотарг, паклитаксел (Taxol^®), феникс (Иттрий 90/MX-DTPA), пентостатин, полифепросан 20 с кармустиновым имплантатом (Gliadel^®), тамоксифена цитрат (Nolvadex^®), тенипозид (Vumon^®), 6-тиогуанин, тиотепа, тирапазамин (Tirazone^®), топотекана гидрохлорид для инъекций (Hycamptin^®), винбластин (Velban^®), винкристин (Oncovin^®), винорелбин (Navelbine^®), Ибрутиниб, иделалисиб и брентуксимаба ведотин.

Иллюстративные алкилирующие средства включают, без ограничения, азотные мустарды, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевины и триазены): урациловый мустард (Aminouracil Mustard^®, Chlorethaminacil^®, Demethyldopan^®, Desmethyldopan^®, Haemanthamine^®, Nordopan^®, Uracil nitrogen mustard^®, Uracillost^®, Uracilmostaza^®, Uramustin^®, Uramustine^®), хлорметин (Mustargen^®), циклофосфамид (Cytoxan^®, Neosar^®, Clafen^®, Endoxan^®, Procytox^®, Revimmune^TM), ифосфамид (Mitoxana^®), мелфалан (Alkeran^®), Хлорамбуцил (Leukeran^®), пипоброман (Amedel^®, Vercyte^®), триэтиленмеламин (Hemel^®, Hexalen^®, Hexastat^®), триэтилентиофосфорамин, Темозоломид (Temodar^®), тиотепа (Thioplex^®), бусулфан (Busilvex^®, Myleran^®), кармустин (BiCNU^®), ломустин (CeeNU^®), стрептозоцин (Zanosar^®), и Дакарбазин (DTIC-Dome^®). Дополнительные иллюстративные алкилирующие средства включают, без ограничения, Оксалиплатин (Eloxatin^®); Темозоломид (Temodar^® и Temodal^®); Дактиномицин (также известный, как актиномицин-D, Cosmegen^®); Мелфалан (также известный как L-PAM, L-сарколизин и фенилаланиновый мустард, Alkeran^®); Алтретамин (также известный как гексаметилмеламин (HMM), Hexalen^®); Кармустин (BiCNU^®); Бендамустин (Treanda^®); Бусулфан (Busulfex^® и Myleran^®); Карбоплатин (Paraplatin^®); Ломустин (также известный как CCNU, CeeNU^®); Цисплатин (также известный как CDDP, Platinol^® и Platinol^®-AQ); Хлорамбуцил (Leukeran^®); Циклофосфамид (Cytoxan^® и Neosar^®); Дакарбазин (также известный как DTIC, DIC и имидазола карбоксамид, DTIC-Dome^®); Альтетамин (также известный как гексаметилмеламин (HMM), Hexalen^®); Ифосфамид (Ifex^®); Преднумустин; Прокарбазин (Matulane^®); Мехлорэтамин (также известный как азотный мустард, мустин и мехлорэтамина гидрохлорид, Mustargen^®); Стрептозоцин (Zanosar^®); Тиотепа (также известный как тиофосфамид, TESPA и TSPA, Thioplex^®); Циклофосфамид (Endoxan^®, Cytoxan^®, Neosar^®, Procytox^®, Revimmune^®); и Бендамустина HCl (Treanda^®).

Иллюстративные антрациклины включают, например, доксорубицин (Adriamycin^® и Rubex^®); блеомицин (lenoxane^®); даунорубицин (даунорубицина гидрохлорид, дауномицин и рубидомицина гидрохлорид, Cerubidine^®); даунорубицин липосомальный (липосомы с даунорубицина цитратом, DaunoXome^®); митоксантрон (DHAD, Novantrone^®); эпирубицин (Ellence™); идарубицин (Idamycin^®, Idamycin PFS^®); митомицин C (Mutamycin^®); гелданамицин; гербимицин; равидомицин; и дезацетилравидомицин.

Иллюстративные алкалоиды барвинка, которые могут применяться в комбинации с молекулами антитела против PD-1, по отдельности или в комбинации с одним другим иммуномодулятором (например, молекулой антитела против LAG-3, против PD-L1 или против TIM-3), включают, но не ограничены приведенными, винорелбина тартрат (Navelbine^®), Винкристин (Oncovin^®), и Виндезин (Eldisine^®)); винбластин (также известный как винбластина сульфат, винкалейкобластин и VLB, Alkaban-AQ^® и Velban^®); и винорелбин (Navelbine^®).

Композиции и применения

Настоящее изобретение относится к фармацевтическому продукту или промышленно изготовленной упаковке, содержащим комбинационный продукт согласно изобретению, описанный в настоящем документе, в частности, вместе с инструкциями по одновременному, раздельному или последовательному применению (особенно, для проявления совместной активности) его при лечении злокачественного новообразования. В одном аспекте, настоящее изобретение предоставляет композиции, например, фармацевтически приемлемые композиции, которые включают молекулы антитела против PD-1, описанные в настоящем документе, и молекулы антитела против M-CSF, описанные в настоящем документе, составленные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Как применяют в настоящем описании, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, изотонические и замедляющие всасывание средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Носитель может подходить для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, ректального, спинального или эпидермального введения (например, посредством инъекции или инфузии).

Композиции этого изобретения могут находиться в различных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые дозированные формы, такие как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предназначенного способа введения и терапевтического применения. Типовые предпочтиетльные композиции находятся в форме инъекционных или инфузионных растворов. Предпочтительным способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления, комбинацию, раскрытую в настоящем описании, вводят посредством внутривенной инфузии или инъекции. В одном другом предпочтительном варианте осуществления, комбинацию, раскрытую в настоящем описании, вводят посредством внутримышечной или подкожной инъекции.

Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена как раствор, микроэмульсия, дисперсия, липосома, или другая упорядоченная структура, подходящая для высокой концентрации антител. Стерильные инъекционные растворы могут быть получены посредством введения активного соединения (т.е., антитела или части антитела) в требуемом количестве в соответствующем растворителе с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, как требуется, с последующей стерилизующей фильтрацией. Как правило, дисперсии получают посредством введения активного соединения в стерильную несущую среду, которая содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов, предпочтительными способами получения являются сушка в вакууме и лиофилизация, которые дают на выходе порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент из его, ранее подвергнутого стерилизующей фильтрации раствора. Подходящая текучесть раствора может поддерживаться, например, посредством применения покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и посредством применения поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может придаваться посредством включения в композицию средства, которое замедляет всасывание, например, моностеаратных солей и желатина.

Фармацевтические композиции для применения в раскрытых способах могут быть изготовлены общепринятым образом. Применение антител в качестве активного ингредиента фармацевтических препаратов в настоящее время является широко распространенным, включая продукты Herceptin^® (трастузумаб), Rituxan^® (ритуксимаб), Synagis^® (паливизумаб) и т.д. Методы лиофилизации, получения водных лекарственных форм и очистки антител до фармацевтической степени чистоты хорошо известны в данной области.

Антитела типовым образом составляют либо в водной форме, готовой для парентерального введения или в виде лиофилизатов для восстановления с подходящим разбавителем перед введением. В нескольких вариантах осуществления раскрытых способов и применений, антитела согласно настоящему изобретению составляют в виде лиофилизата. Подходящие лекарственные формы лиофилизата могут быть восстановлены в небольшом жидком объеме (например, 2 мл или менее) для обеспечения подкожного введения и могут обеспечить растворы с низкими уровнями агрегации антител. Для немедленного введения его растворяют в подходящем водном носителе, например, стерильной воде для инъекций или стерильном забуференном физиологическом растворе. Если получение раствора большего объема для введения посредством инфузии считают желательным в большей степени, чем для введения болюсной инъекцией, преимущественным может быть введение человеческого сывороточного альбумина или собственной гепаринизированной крови пациента в физраствор во время составления. Наличие избытка такого физиологически инертного белка предотвращает потерю антитела посредством адсорбции на стенках контейнера и трубках, применяемых с инфузионным раствором. Если применяют альбумин, подходящая концентрация составляет от 0,5 до 4,5% масс. физраствора.

Способы и скорости введения

Молекулы антитела комбинации, раскрытой в настоящем описании, могут вводиться посредством различных способов, известных в данной области, хотя для многих терапевтических применений, предпочтительным путем/способом введения является внутривенная инъекция или инфузия. См. например, Sachs et al., Optimal Dosing for Targeted Therapies in Oncology: Drug Development Cases Leading by Example, Clin. Cancer Res; 22(6) 2016; Bai et al, A Guide to Rational Dosing of Monoclonal Antibodies, Clin. Pharmacokinet. 2012: 51 (2) 119-135; Le Tourneau, J., Dose Escalation Methods in Phase I Cancer Clinical Trials, J Natl Cancer Inst 2009; 101:708-720; Wang, D. et al., Fixed Dosing Versus Body Size-Based Dosing of Monoclonal Antibodies in Adult Clinical Trials, J Clin Pharmacol 2009;29:1012-1024; Hempel, G. et ano, Flat-Fixed Dosing Versus Body Surface Aread-Based Dosing of Anticancer Drugs: There Is a Difference, Oncologist 2007: 12:924-926, Mathijssen, R., Flat-Fixed Dosing Versus Body Surface Area-Based Dosing of Anticancer Drugs in Adults: Does It Make a Difference?, Oncologist, 2007;12:913-923; Leveque, Evaluation of Fixed Dosing of New Anticancer Agents in Phase I Studies, Anticancer Research 28:300275-2078 (2008), Gurney, How to calculate dose of chemotherapy, British Journal of Cancer (2002) 86, 1297-1302; Например, молекулы антитела могут вводиться посредством внутривенной инфузии при скорости более 20 мг/мин, например, 20-40 мг/мин, и обычно свыше или равной 40 мг/мин для достижения дозы приблизительно от 35 до 440 мг/м², обычно приблизительно от 70 до 310 мг/м², и более типично, приблизительно от 110 до 130 мг/м². В вариантах осуществления, молекулы антитела могут вводиться посредством внутривенной инфузии при скорости менее 10 мг/мин; предпочтительно меньшей или равной 5 мг/мин для достижения дозы приблизительно от 1 до 100 мг/м², предпочтительно приблизительно от 5 до 50 мг/м², приблизительно от 7 до 25 мг/м² и^, более предпочтительно, приблизительно от 10 мг/м². Путь и/или способ введения будет варьировать в зависимости от желательных результатов.

Режимы дозировки

Режимы дозировки регулируют, чтобы обеспечить оптимальный желательный ответ (например, терапевтический ответ). Например, может вводиться единственный болюс, несколько разделенных доз могут вводиться с течением времени или доза может быть пропорционально снижена или увеличена, как указывают требования терапевтической ситуации. Особенно преимущественно составлять парентеральные композиции в виде единичной дозированной формы для простоты введения и однородности дозировки. Единичная дозированная форма, как применяют в настоящем описании, относится к физически дискретным единицам, подходящих в качестве единичных дозировок для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит предварительно заданное количество активного соединения, рассчитанное, чтобы производить желательный терапевтический эффект в ассоциации с желательным фармацевтическим носителем. Спецификация для единичных дозированных форм согласно изобретению напрямую зависит от (a) уникальных характеристик активного соединения и конкретного достигаемого терапевтического эффекта и (b) ограничений, характерных для области составления такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов, и определяется ими.

Дозировка по массе

Антитело может быть дозировано в соответствии с массой тела пациента. Иллюстративный, неограничивающий интервал для терапевтически или профилактически эффективного количества молекул антитела составляет 0,1-30 мг/кг, более предпочтительно 1-25 мг/кг. Дозировки и терапевтические режимы для комбинаций, раскрытых в настоящем описании, могут быть определены квалифицированным специалистом в данной области. Их можно доставлять раздельно или одновременно. В некоторых вариантах осуществления, антитело против PD-1 вводят посредством инъекции (например, подкожно или внутривенно) при дозе, равной приблизительно от 1 до 40 мг/кг, например, от 1 до 30 мг/кг, например, приблизительно от 3 до 25 мг/кг, приблизительно от 3 до 20 мг/кг, приблизительно от 1 до 5 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг, от 3 до 10 мг/кг, от 5 до 15 мг/кг, от 10 до 20 мг/кг, от 15 до 25 мг/кг, или приблизительно 3 мг/кг, и антитело против M-CSF вводят посредством инъекции (например, подкожно или внутривенно) при дозе равной приблизительно от 1 до 40 мг/кг, например, от 1 до 30 мг/кг, например, приблизительно от 3 до 25 мг/кг, приблизительно от 10 до 20 мг/кг, приблизительно от 1 до 5 мг/кг, от 3 до 10 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг, от 5 до 15 мг/кг, от 10 до 20 мг/кг, от 15 до 25 мг/кг, или приблизительно 3 мг/кг.

Базовая дозировка

Антитела могут также вводиться пациентам в виде базовой дозировки, которая обеспечивает фиксированное или заранее заданное количество дозировки для каждого пациента. Термины базовая дозировка и фиксированная дозировка применяют взаимозаменяемо. Базовое или фиксированное дозирование может быть благоприятным для пациентов, например, чтобы сохранить снабжение лекарственными средствами и снизить ошибки фармацевтики.

В нескольких вариантах осуществления, молекулу антитела против PD-1 вводят посредством инъекции (например, подкожно или внутривенно) при дозе (например, базовой дозе), равной приблизительно от 200 мг до 500 мг, например, приблизительно от 250 мг до 450 мг, приблизительно от 300 мг до 400 мг, приблизительно от 250 мг до 350 мг, приблизительно от 350 мг до 450 мг или приблизительно от 300 мг или приблизительно 400 мг. Схема дозирования (например, базовая схема дозирования) может варьировать от, например, одного раза в неделю до одного раза в каждые 2, 3, 4, 5 или 6 недель. В одном варианте осуществления, молекулу антитела против PD-1 вводят при дозе от приблизительно 300 мг до 400 мг один раз в три недели или один раз в четыре недели. В одном варианте осуществления, молекулу антитела против PD-1 вводят при дозе приблизительно от 300 мг один раз в три недели. В одном варианте осуществления, молекулу антитела против PD-1 вводят при дозе приблизительно от 400 мг один раз в четыре недели. В одном варианте осуществления, молекулу антитела против PD-1 вводят при дозе приблизительно от 300 мг один раз в четыре недели. В одном варианте осуществления, молекулу антитела против PD-1 вводят при дозе приблизительно от 400 мг один раз в три недели.

Антитело против M-CSF может аналогично вводиться в виде базовой дозировки. В нескольких вариантах осуществления, молекулу антитела против M-CSF вводят посредством инъекции (например, подкожно или внутривенно) при дозе (например, базовой дозе) от приблизительно 200 мг до 500 мг, например, приблизительно от 250 мг до 450 мг, приблизительно от 300 мг до 400 мг, приблизительно от 250 мг до 350 мг, приблизительно от 350 мг до 450 мг, или приблизительно от 300 мг или приблизительно 400 мг. Дополнительно, молекула антитела против M-CSF может также вводиться посредством инъекции при базовой дозе, равной приблизительно от 300 мг до 800 мг, включающей приблизительно 800 мг. Схема дозирования (например, базовая схема дозирования) может варьировать, например, от одного раза в неделю до одного раза каждые 2, 3, 4, 5 или 6 недель. В одном варианте осуществления, молекулу антитела против M-CSF вводят при дозе от приблизительно 300 мг до 400 мг один раз в три недели или один раз в четыре недели. В одном варианте осуществления, молекулу антитела против M-CSF вводят при дозе от приблизительно 300 мг один раз в три недели. В одном варианте осуществления, молекулу антитела против M-CSF вводят при дозе от приблизительно 400 мг один раз в четыре недели. В одном варианте осуществления, молекулу антитела против M-CSF вводят при дозе от приблизительно 300 мг один раз в четыре недели. В одном варианте осуществления, молекулу антитела против M-CSF вводят при дозе от приблизительно 400 мг один раз в три недели.

Схема дозирования

Схема дозирования может варьировать от, например, одного раза в неделю до одного раза каждые 2, 3 или 4 недели. В одном варианте осуществления, антитело против PD-1 и антитело против M-CSF или оба вида молекул вводят при дозе приблизительно от 3 до 10 мг/кг раз в две недели. Следует отметить, что значения дозировки могут варьировать в зависимости от типа и тяжести состояния, подлежащего облегчению. Следует дополнительно понимать, что для каждого конкретного субъекта, специфичные режимы дозировки должны регулироваться с течением времени в соответствии с потребностью индивидуума и профессиональным суждением лица, вводящего композицию или осуществляющего надзор за введением композиции, и то, что интервалы дозировки, приведенные в настоящем описании, являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения объема или практической реализации заявленной композиции.

Иллюстративные дозы для трех (или более) режимов введения средства являются следующими. Антитело против PD-1 и антитело против M-CSF или оба вида молекул могут вводиться, например, при дозе, равной приблизительно от 1 до 40 мг/кг, например, от 1 до 30 мг/кг, например, приблизительно от 5 до 25 мг/кг, приблизительно от 10 до 20 мг/кг, приблизительно от 1 до 5 мг/кг, или приблизительно от 3 мг/кг. Молекула антитела против M-CSF может вводиться, например, при дозе, равной приблизительно от 1 до 40 мг/кг, например, от 1 до 30 мг/кг, например, приблизительно от 5 до 25 мг/кг, приблизительно от 10 до 20 мг/кг, приблизительно от 1 до 5 мг/кг или приблизительно 3 мг/кг.

Биомаркеры

Изобретение дополнительно включает отбор пациентов, которые могут получить благоприятное воздействие в основном от лечения с использованием комбинации молекулы антитела против PD-1 и молекулы антитела против M-CSF. Отбор пациентов может достигаться определением присутствия PD-1 или присутствия опухолеассоциированных макрофагов (TAMS). Без ограничения какой-либо теорией, в нескольких вариантах осуществления, пациент наиболее вероятно реагирует на лечение комбинацией согласно изобретению, если пациент имеет злокачественное новообразование, которое в высокой степени экспрессирует PD-L1, и/или злокачественное новообразование инфильтруется противоопухолевыми иммунными клетками, например, TIL и/или имеет высокий уровень TAMS, например, определенный наблюдением CD163 или CD163/CD8, как описано ниже.

В дополнение к другим потенциальные предикторы возможной эффективности действия комбинации включают уровни экспрессии FoxP3, PD-L1 и CD68 на исходном уровне (модуляция фенотипа TAM и TIL) и конечные результаты противоопухолевой активности (например, на протяжении всей частоты ответа). В одном варианте осуществления согласно настоящему изобретению кровь пациента может быть проанализирована на присутствие CD163 или CD163/CD8, как единственного предиктора эффективности действия комбинации.

Фармакодинамический эффект комбинации потенциально можно оценить по уровням экспрессии CD8, CD163, FoxP3, PD-L1, CD68 на исходном уровне и после исходного уровня (модуляция фенотипа TAM и TIL), CD4, LAG3 или TIM3, (а также CD80, LKB2, CCL2, если доступно). В дополнение, для оценки фармакодинамики можно измерять системные уровни цитокинов на исходном уровне и после исходного уровня (например, GM-CSF, IFN-γ, IL-10, IL-18, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α или TNF-β).

ORR согласно RECIST v 1.1 у пациентов с мутантными BRCA1/BRCA2 и немутантными TNBC, соответственно может применяться, чтобы оценить влияет ли статус BRCA1 и BRCA2 на ответ на лечение пациентов с TNBC. ORR по RECIST v1.1 в соответствии со статусом MSI и мутационной нагрузкой позволяет оценить влияет ли статус нестабильности микросателлита и мутационная нагрузка на общую частоту ответа. Противоопухолевую активность комбинации MCS110 у PDR001 у пациентов с меланомой с первоначальной или приобретенной резистентностью к целевым терапиям с PD-1/PDL-1 можно оценить по ORR согласно RECIST v. 1.1 у пациентов с меланомой с первоначальной или приобретенной резистентностью к PD-1 (по истории болезни), соответственно.

Отбор пациентов, имеющих PD-1

В одном примере, может иметь место определение присутствия PD-1 для определения противоопухолевых иммунных клеток посредством аналитического теста на клетки, позитивные для CD8, PD-L1, и/или IFN-γ; таким образом, уровни CD8, PD-L1 и/или IFN-γ могут служить для считывания данных по уровням TIL в микроокружении. В некоторых вариантах осуществления, микроокружениие злокачественного новообразования называют трижды позитивным для PD-L1/CD8/IFN-γ.

Соответственно, в некоторых аспектах, данная заявка предоставляет способы определения того, является ли образец опухоли позитивным для одного или нескольких из PD-L1, CD8, и IFN-γ, и того, является ли образец опухоли позитивным для одного или нескольких, например, двух или всех трех маркеров, а затем введения пациенту терапевтически эффективного количества молекулы антитела против PD-1, необязательно в комбинации с одним или несколькими другими иммуномодуляторами или противоопухолевыми средствами.

При следующих показаниях, большая часть пациентов является трижды позитивной для PD-L1/CD8/IFN-γ: TN-рак молочной железы. Независимо от того большая или малая фракция пациентов является трижды позитивной для этих маркеров, скрининг пациентов по этим маркерам позволяет идентифицировать фракцию пациентов, которая имеет особенно высокую вероятность благоприятного ответа на терапию с использованием антитела против PD-1 (например, блокировки антитела против PD-1) в комбинации с M-CSF-1 и необязательно одного или нескольких других иммуномодуляторов (например, молекулы антитела против TIM-3, молекулы антитела против LAG-3, или молекулы антитела против PD-L1) и/или противоопухолевых средств.

В нескольких вариантах осуществления, образец злокачественного новообразования классифицируют как трижды позитивный для PD-L1/CD8/IFN-γ. Это измерение можно грубо свести к определению двух порогов: классифицируют ли индивидуальную клетку как позитивную, и классифицируют ли образец в целом как позитивный. Во-первых, в индивидуальной клетке, можно измерить уровень PD-L1, CD8, и/или IFN-γ. В нескольких вариантах осуществления, клетка, которая является позитивной для одного или более маркеров, представляет собой клетку, которая имеет более высокий уровень маркера по сравнению с контрольной клеткой или эталонным значением. Например, в нескольких вариантах осуществления, высокий уровень PD-L1 в данной клетке представляет собой уровень, более высокий, чем уровень PD-L1 в соответствующей незлокачественной ткани у пациента. В качестве одного другого примера, в нескольких вариантах осуществления, высокий уровень CD8 или IFN-γ в данной клетке является уровнем этого белка, обычно наблюдаемый в TIL. Во-вторых, можно также измерить процентную долю клеток в образце, которые являются позитивными для PD-L1, CD8 и/или IFN-γ. (Для единичной клетки необязательно экспрессировать все три маркера.) В нескольких вариантах осуществления, трижды позитивный образец является образцом, который имеет высокую процентную долю клеток, например, выше эталонного значения или выше, чем у контрольного образца, которые являются позитивными для этих маркеров.

В других вариантах осуществления, можно измерить общие уровни PD-L1, CD8, и/или IFN-γ в образце. В этом случае, высокий уровень CD8 или IFN-γ в образце может быть уровнем такого белка, обычно наблюдаемый в опухоли, инфильтрованной TIL. Аналогично, высокий уровень PD-L1 может быть уровнем такого белка, обычно наблюдаемый в образце опухоли, например, микроокружении опухоли.

Идентификация подмножеств пациентов, которые являются трижды позитивными для PD-L1/CD8/IFN-γ отображает некоторые субпопуляции пациентов, которые, вероятно, являются восприимчивыми к терапии антителом против PD-1. Например, многие пациенты с IM-TN (иммуномодуляторным, трижды негативным) раком молочной железы являются трижды позитивными для PD-L1/CD8/IFN-γ. IM-TN рак молочной железы описан в, например, Brian D. Lehmann et al., ʺIdentification of human triple negative breast cancer subtypes and preclinical models for selection of targeted therapiesʺ, J Clin Invest. Jul 1, 2011; 121(7): 2750-2767. Трижды негативные злокачественные новообразования молочной железы являются такими новообразованиями, которые не экспрессируют эстрогеновый рецептор (ER), прогестероновый рецептор (PR) и Her2/neu. Эти виды рака трудно поддаются лечению, поскольку они обычно невосприимчивы к средствам, которые нацелены на ER, PR, и Her2/neu. Трижды негативные злокачественные новообразования молочной железы могут быть дополнительно подразделены на различные классы, один из которых является иммуномодуляторным. Как описано в Lehmann et al., IM-TN рак молочной железы обогащен факторами, вовлеченными в процессы иммунных клеток, например, одной или несколькими из сигнальных систем иммунной клетки (например, путь TH1/TH2, NK-клеточный путь, сигнальный путь B-клеточного рецептора, путь DC, и сигнальная система Т-клеточного рецептора), цитокиновая сигнальная система (например, цитокиновый путь, путь IL-12 и путь IL-7), процессинг и презентирование антигена и передача сигналов через центральные пути передачи иммунных сигналов (например, сигнальная система NFKB, TNF, и JAK/STAT), генами, вовлеченными в функцию T-клеток, иммунную транскрипцию, интерфероновый (IFN) ответ и процессинг антигена. Соответственно, в нескольких вариантах осуществления, злокачественное новообразование, подвергаемое лечению представляет собой злокачественное новообразование, которое является, или определяется как, позитивное для одного или нескольких маркеров IM-TN рака молочной железы, например, фактора, который стимулирует одну или несколько сигнальных систем иммунной клетки (например, путь TH1/TH2, NK-клеточный путь, сигнальный путь B-клеточного рецептора, путь DC, и сигнальная система Т-клеточного рецептора), цитокиновую сигнальную систему (например, цитокиновый путь, путь IL-12 и путь IL-7), процессинг и презентирование антигена и передачу сигналов черз центральные пути передачи иммунных сигналов (например, сигнальную систему NFKB, TNF, и JAK/STAT), гены, вовлеченные в функцию T-клеток, иммунную транскрипцию, интерфероновый (IFN) ответ и процессинг антигена.

Отбор пациентов с использованием TAM

Настоящее изобретение направлено на применение комбинации антитела против M-CSF, описанного в Таблице 1, и антитела против PD-1, описанного в Таблице 2, для лечения злокачественного новообразования, такого как трижды негативный рак молочной железы. В настоящее время не существует целенаправленных терапий для этого подтипа рака молочной железы, и единственным вариантом лечения является химиотерапия. Настоящее изобретение предоставляет персонализированную терапию, которая максимизирует благоприятное воздействие и минимизирует риск применения молекулы антитела против M-CSF в популяциях больных раком посредством идентификации тех пациентов, которые вероятно будут иметь благоприятный ответ, до лечения с использованием терапии M-CSF. В одном примере, настоящее изобретение включает идентификацию пациентов, имеющих злокачественное новообразование, таких как пациенты с трижды негативным раком молочной железы, которые имеют уровень опухолеассоциированных макрофагов (TAM), указывающий на то, что пациент, вероятно, будет иметь ответ на лечение с использованием антагониста M-CSF. Конкретно, уровень TAM у пациента измеряют посредством определения уровня CD163 (например, мРНК или белка) в образце от пациента и уровень CD163 у пациента, в свою очередь, применяют для указания на то, что пациент, наиболее вероятно, будет иметь благоприятный ответ на лечение с использованием M-CSF. В одном примере, если пациент имеет увеличенный уровень CD163 по сравнению с контролем, тогда пациента идентифицируют как пациента, наиболее вероятно реагирующего на антагонист M-CSF. В одном другом примере, если пациент имеет уровень CD163, равный или превышающий предварительно определенный уровень CD163 (ʺпорогʺ), тогда пациента идентифицируют как пациента, наиболее вероятно реагирующего на антагонист M-CSF. Уровень экспрессии CD163, анализируемый в образце, полученном от пациента со злокачественным новообразованием, может относиться, например, к экспрессии мРНК и/или белка.

Приготовление образцов

Может применяться любой соответствующий образец или тестируемый образец клеток, взятый от индивидуума, имеющего злокачественное новообразование. Как правило, тестируемый образец клеток или образец ткани будет получен от субъекта со злокачественным новообразованием посредством биопсии или хирургической резекции. Образец клеток, ткани или жидкой среды может удаляться посредством игольной аспирационной биопсии. Для этого, тонкую иглу, присоединенную к шприцу, вводят через кожу в ткань, представляющую интерес. Иглу обычно направляют в интересующую область, используя визуализацию ультразвуком или с помощью компьютерной томографии (КТ). Как только иглу вводят в ткань, с помощью шприца создают вакуум, так что клетки или жидкая среда могут быть отсосаны через иглу и собраны в шприце. Образец клеток или ткани также может быть удален посредством эксцизионной биопсии или кор-биопсии. Для этого, конус, цилиндр или крошечный кусочек ткани удаляют из области интереса. Визуализацию с использованием КТ, ультразвука или эндоскопа, как правило, применяют для направления этого типа биопсии. Более конкретно, полное злокачественное повреждение может удаляться посредством эксцизионной биопсии или хирургической резекции. В настоящем изобретении, тестируемый образец обычно представляет собой образец клеток, удаленных как часть хирургической резекции.

Тестируемый образец из, например, ткани, может также храниться, например, в растворе для стабилизации РНК (Ambion; Austin Tex.) или быстро заморожен и храниться при -80°C для более позднего применения. Биопсийный образец ткани также может быть зафиксирован с использованием фиксатора, такого как формальдегид, параформальдегид, или смесь уксусная кислота/этанол. Зафиксированный образец ткани может быть залит в воск (парафин) или пластмассовой смоле. Залитый образец ткани (или замороженный образец ткани) может быть нарезан на тонкие срезы. РНК или белок также можно экстрагировать из зафиксированного или залитого воском образца ткани или замороженного образца ткани. Как только образец клеток или образец ткани удаляют из субъекта со злокачественным новообразованием, он может быть обработан для выделения РНК или белка с использованием методов, хорошо известных в данной области, и как описано ниже.

Пример экстракции РНК из биопсийной пробы, взятой у пациента со злокачественным новообразованием, может включать, например, лизис тиоцианатом гуанидия с последующим центрифугированием в CsCl. РНК из одиночных клеток может быть получена, как описано в методах получения библиотек кДНК из одиночных клеток. В одном варианте осуществления, популяция РНК может быть обогащена CD163. Обогащение может осуществляться, например, посредством статистических гексамеров и праймер-специфичного синтеза кДНК или множества циклов линейной амплификации, основанной на синтезе кДНК, и матрично-ориентированной на транскрипцию in vitro.

Субъект с опухолью или злокачественным новообразованием, как правило, является млекопитающим субъектом, таким как примат. В иллюстративном варианте осуществления, субъект является человеком.

Наличие TAM можно оценить посредством обнаружения присутствия CD163+

В способах, раскрытых в настоящем описании, используют, среди прочего, определение уровня CD163. Уровень CD163 является прогностическим для оценки того, реагирует ли индивидуум с большей вероятностью на антагонист M-CSF. В одном примере уровень CD163, который является прогностическим, относится к уровню экспрессии, который выше медианного уровня (контроля) для экспрессии CD163 при злокачественном новообразовании или больше предварительно заданного порогового значения.

В одном варианте осуществления, уровень экспрессии белка CD163 сравнивают с контрольным или пороговым значением для отбора пациентов для лечения с использованием антагониста M-CSF, например, уровень экспрессии CD163 по сравнению с контролем может быть прогностическим для оценки того, что пациент вероятно или маловероятно будет реагировать на антагонист M-CSF, такой как H-RX1. В одном варианте осуществления, пациентов, имеющих уровень экспрессии белка CD163 (также называемый ʺплотность TAMʺ) свыше порогового уровня, равного 10%, 15%, 20%, 30%, 40% или выше, отбирают для лечения с использованием антагониста M-CSF. Контрольный уровень CD163 можно определить по существу одновременно с измерением экспрессии CD163 или может быть определен прежде.

Обнаружение экспрессии нуклеиновой кислоты CD163

Биологический образец от пациента может быть подвергнут оценке на наличие экспрессии CD163, таким образом, как при участии РНК, любыми применимыми средствами. Увеличенные уровни экспрессии CD163 могут применяться для прогнозирования улучшенного ответа на антагонизм M-CSF для пациентов со злокачественным новообразованием, например, TBNC.

Обнаружение белка CD163

В некоторых случаях, присутствие CD163 можно определить посредством анализа продуктов полипептида CD163. Обнаружение полипептидных продуктов может выполняться с использованием любого метода, известного в данной области, включая, но не ограничиваясь, иммуноцитохимическое окрашивание, ELISA, проточную цитометрию, Вестерн-блотинг, спектрофотометрию, ВЭЖХ и масс-спектрометрию.

Контроль

Как применяют в настоящем описании, контроли для сравнения могут определяться специалистом в данной области. В одном примере, контроли определяют посредством выбора контрольных образцов со значениями плотности TAM, которые задают предельное значение. Например, значение может иметь величину, которая различается между, например, тестируемыми образцами, где индивидуум имеет CD163 (или плотность ТАМ) менее 15%, или тестируемыми образцами, где индивидуум имеет CD163 (или плотность ТАМ), равную или свыше 15% CD163 (или плотность ТАМ); или между теми тестируемыми образцами, где индивидуум, вероятно, получает благоприятное воздействие от терапии антагонистом M-CSF и теми образцами, где, вероятно, не получает его.

В одном другом примере, контроль может представлять собой образец от здорового добровольца или образец от пациента со злокачественным новообразованием, который, как известно, имеет низкую экспрессию CD163 (мРНК или белка), и пациента выбирают для лечения, когда определенное значение CD163 выше, чем у других контролей.

В еще одном другом примере, контрольное значение может являться значением, предварительно заданным в соответствии с историческими контролями в качестве основы математической модели. Модель, также называемая классификатором, может быть построена, используя уровни экспрессии (например, мРНК или белка) из коллекции пациентов со злокачественным новообразованием (например, TBNC). Математическая модель, может представлять собой, например, любой класс прогностического метода или его вариации, и производное контрольное значение может применяться в качестве порогового значения. Если уровень экспрессии находится на уровне порога или выше, пациент, более вероятно, будет восприимчив к лечению с использованием антагониста M-CSF. В одном варианте осуществления, выбирают индивидуума, который имеет уровень экспрессии CD163, равный или выше порогового, например, он может быть на 15%, 20%, 30%, 40%, или выше.

Отбор и лечение пациентов со злокачественным новообразованием

Уровень экспрессии нуклеиновой кислоты CD163 или белка CD163 позволяет клиницистам обеспечить персонализированную терапию для пациентов со злокачественным новообразованием, таким как TBNC, рак поджелудочной железы, рак яичника, меланома, назофарингеальная карцинома, диффузная В-крупноклеточная лимфома, мезотелиома, почечно-клеточная карцинома или глиобластома, т.е., он позволяют определить, можно ли селективно лечить пациента с использованием антагониста M-CSF. Таким образом, клиницист может максимизировать благоприятное воздействие и минимизировать риск антагонизма M-CSF в целой популяции пациентов, страдающих от злокачественного новообразования. Различные аспекты изобретения описаны ниже с дополнительными подробностями. Дополнительные определения устанавливают на протяжении всего описания.

Пример 1

Фазу Ib клинических испытаний выполняют с MCS110 и PDR001, вводимыми один раз в 3 недели посредством в.в. инфузий в течение 30 минут и 1 часа, соответственно. Лекарственные средства будут вводиться раздельно с по меньшей мере 30-минутным перерывом между двумя антителами. Инфузии каждого антитела могут продлеваться до 2 часов, если имеются клинические показания. Описанный ниже режим дозирования применяют в приведенной ниже Таблице 5.

Таблица 5. Пример режима дозирования

Оба исследуемых лекарственных средства могут инфузионно вводиться с использованием одного и того же участка для в.в. доступа. Следуют одной и той же последовательности введения для всех пациентов, т.е. PDR001 должен инфузионно вводиться первым. Если реакция на инфузию происходит после введения PDR001, последующую инфузию MCS110 откладывают, пока для пациента не станет безопасным получать MCS110 на основании клинического суждения исследователя. Отсрочка между инфузиями PDR001 и MCS110 может достигать 4 часов, если имеются клинические показания.

Запланированная доза лекарственных средств текущего исследования может быть отсрочена вплоть до 7 дней, для восстановления от предшествующих AE или при пропущенных визитах. Если запланированная доза лекарственных средств текущего исследования отсрочена более чем на 7 дней вследствие неразрешенных AE, введение должно быть пропущено, а лечение возобновляться при более низком уровне дозы (при соответствии критериям для DLT) во время следующей запланированной дозы. Протокол оценки будет сдвинут соответственно. Задержки приема дозы относятся ко всем лекарственным средствам текущего исследования: для комбинационного лечения с использованием как MCS110, так и PDR001, и для лечения единственным средством, MCS110 или PDR001. Дозу для исследуемого лекарственного средства в случае MCS110 рассчитывают, исходя из массы тела индивидуальных субъектов, измеренной при скрининговом визите и последующих визитах до введения.

Начальная доза

Начальная доза и режим MCS110 будут составлять 3 мг/кг в.в. каждые 3 недели, что соответствует приблизительно 40% дозы единичного средства, вводимого пациентам с PVNS (10 мг/кг каждые 4 недели в исследовании NCT01643850, CMCS110X2201)) и 30% дозы, вводимой в комбинации со смесью карбоплатин/гемцитабин при TNBC (10 мг/кг каждые 3 недели в исследовании NCT02435680, CMCSZ2201).

Доза MCS110, равная 10 мг/кг хорошо переносилась пациентами с PVNS и показывала значительное уменьшение опухоли у пациентов с PVNS. После единичной дозы, равной 3 мг/кг MCS110 у здоровых добровольцев, наблюдали, что CSF-1 насыщался под действием MCS110 в течение приблизительно 21 дня CMCSX2101. Фармакодинамические анализы, проводимые при исследованиях HV, показывают, что ответ циркулирующего биомаркера должен быть близок к максимальному при дозе, равной или свыше 5 мг/кг, и минимальным при дозах ниже 3 мг/кг. Учитывая риск потенциальных перекрывающихся профилей токсичности, дозу 3 мг/кг MCS110 выбирают в качестве начальной дозы для части исследования с повышением дозы.

Начальная доза и режим PDR001 составляют 100 мг в.в. каждые 3 недели. PDR001 тестировали до дозы, равной 10 мг/кг каждые 2 недели, в проводящемся исследовании NCT02404441, CPRD001X2101. Никаких MTD не определяли и плановая рекомендуемая доза для фазы два (RP2D) составляет 300 мг (3,75 мг/кг), принимаемые каждые 3 недели или 400 мг (5 мг/кг), принимаемые каждые 4 недели. Обе из предложенных RP2D могут достигать устойчивых средних C_{остаточных} (C остаточной) концентраций, которые приблизительно в 77-раз выше, чем действенность EC50 для PDR001 in vitro/ex vivo, оцениваемая как 0,42 мкг/мл. Экспозиция PDR001 при начальной дозе, равной 100 мг Q3W находится в пределах интервала этих значений, наблюдаемых в исследовании CPDR001X2101 без каких-либо DLT. Ожидается, что PDR001 будет демонстрировать противоопухолевую активность при дозах в 100 мг или выше каждые 3 недели.

Таблица 6

Потенциальная токсичность

Данное исследование является первым исследованием, оценивающим комбинацию MCS110 и PDR001. Потенциальные перекрывающиеся токсичности включают повышения уровней ферментов печени, вызванные иммунной стимуляцией (PDR001), или сниженным элиминированием ферментов печени (MCS110), более высокую частоту или аггравацию иммуноопосредованных нежелательных явлений и кожную токсичность.

Дозо-лимитирующую токсичность (DLT) определяют как нежелательное явление или аномальное лабораторное значение CTCAE Степени > 3, оцениваемое как не относящееся к заболеванию, прогрессированию заболевания, интеркуррентной болезни или сопутствующим препаратам, которое происходит в интервале первых двух циклов лечения с использованием комбинационной терапии, и соответствует любому из критериев, включенных в Таблице 7.

Появившиеся данные в новой области исследований иммунологических комбинаций позволяют предположить, что некоторые связанные с иммунной системой нежелательные явления имеют продолжительную латентность. Как таковое, окно DLT для когорты с комбинацией в этом испытании расширяют до продолжительности двух циклов или 42 дней.

Общая терминология критериев нежелательных явлений Национального института онкологии США (NCI CTCAE) версия 4.03 будет применяться для всей сортировки. С целью решений по повышению дозы, DLT будут учтены и включены в Байесовскую регрессионную логистическую модель (BLRM).

Для пациентов, которые не переносят установленную протоколом схему дозирования, разрешаются регулирования дозы, чтобы позволить пациенту продолжить исследуемое лечение, за исключением периода во время первых двух циклов, когда модификации дозы допускаются лишь в том случае, если пациент испытывает DLT. Необходимо применять следующие рекомендации:

Если пациент испытывает AE, соответствующее критериям для DLT, как уже указано в Разделе 62.4, лечение должно быть приостановлено. Модификации дозы для токсичностей, относящихся к исследуемому препарату, обобщены в Таблице 6-44. После разрешения Токсичности до Степени 1 или до значения исходного уровня для пациента, пациент может возобновить исследуемое лечение при более низком уровне дозы, чем тестируют в это время (по той же схеме дозирования), если отсутствуют очевидные признаки прогрессирования заболевания по irRC. Решение о продолжении лечения после случая DLT находится на усмотрении Исследователя. После того, как AE удовлетворяет критериям для DLT, если пациент возобновляет лечение в исследовании, оно должно проводиться при последующем более низком уровне дозы. Снижения дозы до доз ниже MCS110 0,3 мг/кг/PDR001 100 мг Q3W не разрешаются. Если более 2 последовательных доз должны быть пропущены вследствие токсичностей, относящихся к исследуемому лечению, тогда пациент должен выбыть из исследования, пока пациент не испытает клиническое благоприятное воздействие по мнению исследователя. В этом случае, лечение может продолжаться при дозе, согласованной между Novartis и исследователем.

Если лечение одним из исследуемых лекарственных средств прерывают, пациент может продолжить лечение оставшимся исследуемым лекарственным средством, если исследователь считает, что это наилучшим образом соответствует интересам пациента. Доза оставшегося исследуемого лекарственного средства должна быть согласована между Novartis и исследователем.

В случаях диареи/колита, почечных, легочных, эндокринопатологических, печеночных и кожных AE, сначала исключают невоспалительные причины. Если имеются признаки воспалительной причины, лечение проводят согласно Приложению 14.3: Рекомендуемые алгоритмы управления для подозреваемой токсичности, которые включают кортикостероидную терапию.

Критерии для дозо-лимитирующих токсичностей

Таблица 7

Таблица 8. Модификации дозировки для токсичностей, связанных с исследуемым препаратом

Пример 2

После части Фазы Ib, если появившиеся данные ФК, ФД и безопасности указывают на то, что стратегия базового дозирования MCS110 является подходящей, тогда стратегию базового дозирования можно осуществлять в части Фазы II исследования. Данные ФК, полученные во время части Фазы Ib этого исследования, будут комбинироваться с данными ФК других клинических исследований MCS110 для оценки базового дозирования в сравнении с дозированием, основанным на массе тела, и базовая доза может быть идентифицирована для части Фазы II этого исследования

Пример 3

Данные Rnaseq из базы данных TCGA показывают высокий уровень экспрессии суррогатного маркера для макрофагов M2, CD163, в популяции пациентов, характеризующейся наивысшим уровнем экспрессии PD1. Был предпринят анализ различных типов опухолей, чтобы определить экспрессию CD163 и PD1 у различных типов опухолей. Используя Rnaseq из базы данных TCGA и внутренней базы данных для различных злокачественных новообразований, включающих трижды негативный рак молочной железы (TNBC), рак кожи, рак яичника, злокачественные новообразования поджелудочной железы, глиобластому (GBM), рак легких, почечно-клеточную карциному, диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), мезотелиому и назофарингеальную карциному (NPC), наблюдали уровни экспрессии PD-1 по отношению к CD163. ФИГ. 1 показывает взаимосвязь уровней экспрессии PD-1 по отношению к CD163 посредством упорядочивания экспрессии PD-1 от высокой к низкой. Результаты показывают, что высокая экспрессия PD-1, в целом, хорошо коррелирует с высокими уровнями CD163.

Пример 4

Антитело H-RX1 против M-CSF (антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 2), в комбинации с молекулой антитела против PD-1 BAP049-Клона-E (молекулой антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 12), вводят пациентам с прогрессирующим трижды негативным раком молочной железы (TNBC), которые проходили стандартное лечение. Ответ опухоли определяют местно согласно Критериям оценки ответа солидных опухолей (RECIST) v1.1 (Therasse et al., (2000) New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16); New Guidelines to Evaluate the Response in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16 и пересмотренное руководство RECIST (версия 1.1) (Eisenhauer et al 2009) European Journal of Cancer; 45:228-247.

Пример 5

Антитело H-RX1 против M-CSF (антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 2), в комбинации с молекулой антитела против PD-1 BAP049-Клона-E (молекулой антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 12) вводят пациентам с раком поджелудочной железы. Ответ опухоли будет определяться местно согласно Критериям оценки ответа солидных опухолей (RECIST) v1.1 (Therasse et al., (2000) New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16); New Guidelines to Evaluate the Response in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16 и пересмотренное руководство RECIST (версия 1.1) (Eisenhauer et al 2009) European Journal of Cancer; 45:228-247.

Пример 6

Антитело H-RX1 против M-CSF (антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 2) в комбинации с молекулой антитела против PD-1 BAP049-Клона-E (молекулой антитела, имеющей вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 12), вводят пациентам с карциномой эндометрия. Ответ опухоли будет определяться местно согласно Критериям оценки ответа при солидных опухолях (RECIST) v1.1 (Therasse et al., (2000) New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16); New Guidelines to Evaluate the Response in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16 и пересмотренное руководство RECIST (версия 1.1) (Eisenhauer et al 2009) European Journal of Cancer; 45:228-247.

Пример 7

Антитело H-RX1 против M-CSF (антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 2) в комбинации с молекулой антитела против PD-1 клона E (молекулой антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 12) вводят пациентам с меланомой, которые проходили стандартное лечение и являются резистентными к терапии с использованием PD-1 или PD-L1. Ответ опухоли будет определяться местно согласно Критериям оценки ответа при солидных опухолях (RECIST) v. 1.1 (Therasse et al., (2000) New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16); New Guidelines to Evaluate the Response in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16 и пересмотренное руководство RECIST (версия 1.1) (Eisenhauer et al 2009) European Journal of Cancer; 45:228-247.

Пример 8

Антитело H-RX1 против M-CSF (антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 2) в комбинации с молекулой антитела против PD-1 BAP049-Клона-E (молекулой антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 12) вводят пациентам с прогрессирующим трижды негативным раком молочной железы (TNBC), которые проходили стандартное лечение, и, которые являются рефрактерными или резистентными к терапии с использованием PD-1 или PD-L1. Ответ опухоли определяют местно согласно Критериям оценки ответа при солидных опухолях (RECIST) v1.1 (Therasse et al., (2000) New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16); New Guidelines to Evaluate the Response in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16 и пересмотренное руководство RECIST (версия 1.1) (Eisenhauer et al 2009) European Journal of Cancer; 45:228-247.

Пример 9

Антитело H-RX1 против M-CSF (антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 4) в комбинации с молекулой антитела против PD-1 BAP049-Клона-E (молекулой антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 37, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислоты, приведенные в SEQ ID NO: 47) вводят пациентам с одним или обоими из немелкоклеточного рака легких и плоскоклеточного рака легких. Ответ опухоли будет определяться местно согласно Критериям оценки ответа при солидных опухолях (RECIST) v1.1 (Therasse et al., (2000) New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16); New Guidelines to Evaluate the Response in Solid Tumors, Journal of National Cancer Institute, Vol. 92; 205-16 и пересмотренное руководство RECIST (версия 1,1) (Eisenhauer et al 2009) European Journal of Cancer; 45:228-247.

Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, указанные в настоящем описании, полностью включены в него посредством ссылки. Другие признаки, цели и преимущества изобретения будут понятными из описания и чертежей и из формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> FJAELLSKOG, MARIE-LOUISE

CAMERON, JOHN SCOTT

CAO, ZHU ALEXANDER

CIPOLLETTA, DANIELA

MACISAAC, KENZIE DANIEL

<120> НОВАЯ КОМБИНАЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ

<130> PAT057000

<140>

<141>

<150> 62/352,637

<151> 2016-06-21

<150> 62/198,384

<151> 2015-07-29

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 448

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Phe Asp Tyr Ala His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn Ser Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 3

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 4

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 5

Phe Asp Tyr Ala His Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 6

Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 7

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 8

Gln Gln Ile Asn Ser Trp Pro Thr Thr

1 5

<210> 9

<211> 467

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 9

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Tyr Ser Ile

35 40 45

Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Ser Phe Asp Tyr Ala His Ala Met Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 10

<211> 234

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 10

Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro

1 5 10 15

Ala Ser Arg Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser

20 25 30

Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Asp Gln Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn

100 105 110

Ser Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 113

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 13

Thr Tyr Trp Met His

1 5

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 14

Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 15

Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 16

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 17

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 18

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 19

<211> 443

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 20

<211> 220

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 21

Thr Tyr Trp Met His

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 22

Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 23

Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr

1 5

<210> 24

<211> 117

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 443

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 26

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 27

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 28

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 29

<211> 113

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 29

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 30

<211> 220

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический полипептид”

<400> 30

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 31

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 31

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Val Gln Ala

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 32

Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Gly Thr Arg Cys

20

<210> 33

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 33

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Val Gln Ala

<210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 34

Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Gly Thr Arg Cys

20

<210> 35

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 37

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

325

<210> 38

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 39

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 40

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 41

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 42

Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn

1 5

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 43

Arg Phe Arg Asp Asn Thr Ala Asn

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 44

Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu

1 5

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 45

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 46

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический пептид”

<400> 46

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 47

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический праймер”

<400> 47

gctgacagac taacagactg ttcc 24

<210> 48

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<221> источник

<223> /замечание=“Описание Искусственной Последовательности: Синтетический праймер”

<400> 48

caaatgtggt atggctga 18

<---