Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА БОЛЬНЫХ РОЗАЦЕА

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано в дополнительной диагностике функциональной патологии желудочно-кишечного тракта у больных розацеа.

Известен способ диагностики желудочно-кишечного тракта путем изучения клинических, анамнестических и катамнестических данных больных розацеа [К. Вольф, Л.А. Голдсмит, С.И. Кац, Б.А. Джилкрест, Э.С. Паллер, Д. Дж, Леффель. Дерматология Фитцпатрика в клинической практике. Москва 2012, Издательство «Бином» Том 1. с. 769-775].

Недостатком этого способа является то, что клинические, анамнестические и катамнестические данные являются общими критериями диагностики болезни и не позволяют прогнозировать течение дерматоза.

Известен способ диагностики функционального состояния желудочно-кишечного тракта у больных розацеа на основе уреазного теста и морфологического изучения состояния слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки на предмет содержания Н.pylori [В.В. Карлова. Эффективность лечения acne rosacea на фоне патологии желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori. Альманах клинической медицины.2007, №15, с. 162-185]. Указанный метод трудоемкий, необходим доступ к слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки с помощью фиброгастроскопии и взятием биоптата. Не все больные согласны на проведение процедуры фиброгастроскопии, которая в то же время требует подготовки больного в связи инвазивным методом исследования [В.В. Карлова. Эффективность лечения acne rosacea на фоне патологии желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori. Альманах клинической медицины. 2007, №15, с. 162-185].

Задачей изобретения является повышение эффективности диагностики функциональной патологии желудочно-кишечного тракта больных, страдающих различными клиническими формами розацеа.

Задача решается способом диагностики функционального состояния желудочно-кишечного тракта у больных розацеа, включающий клиническое обследование больного, сбор анамнестических данных и данных изучения. Способ лабораторной диагностики функциональной патологии желудочно-кишечного тракта у больных розацеа, заключающийся в исследовании периферической крови больных, набором реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с нарушениями обмена фермента лактозы, методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (генетика метаболизма лактозы) с анализом кривых плавления предоставленной фирмой ООО «ДНК-Технология» РФ.

Технология ПЦР с анализом кривых плавления дает возможность идентифицировать фрагменты ДНК путем детекции изменений в уровне флуоресценции комплекса фрагмент-проба (меченный флуорофором олигонуклеотидный зонд) на этапе его денатурации и последующего построения графика кривой плавления.

Технология включает следующие этапы:

а) Амплификация искомой последовательности ДНК;

б) Гибридизация ампликонов с олигонуклеотидами (пробами), меченными флуорофорами;

в) Образование комплементарных и частично комплементарных дуплексов;

г) Плавление (денатурация) дуплексов;

д) Детекция флуоресценции с последующим построением и анализом кривых плавления.

Для определения нуклеотидной последовательности, образовавшейся в процессе амплификации, используют метод примыкающих проб (kissing probes или резонансный перенос энергии).

В его основе лежит использование двух типов олигонуклеотидов (проб), гибридизующихся на матрицу при низкой температуре в непосредственной близости друг от друга. Один из олигонуклеотидов метят флуоресцентным донором, другой - акцептором (гасителем). Идентификация нуклеотидной последовательности образца осуществляется в процессе плавления дуплексов (результат гибридизации фрагментов ДНК и олигонуклеотидных зондов), которое происходит при последовательном увеличении температуры реакционной смеси.

Преимуществом данного подхода является использование специфических флуорофоров, снижающих риск детектирования неспецифических продуктов амплификации, как при использовании интеркалирующих красителей.

Для проведения анализа необходимы следующие расходные материалы и оборудование:

- микропробирки (или микропробирки в стрипах) объемом 0,2 мл для ПЦР-анализа, адаптированные для работы с термоциклером в режиме реального времени;

- штатив и насадка на микроцентрифугу (вортекс) для стрипованного пластика.

Оборудование, необходимое для проведения анализа: Набор реагентов предназначен для использования в лабораториях, оснащенных детектирующими мплификаторами для ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (приборы сеии «ДТ» производства ООО «НПО ДНК-Технология»): «ДТлайт», «ДТпрайм» и «ДТ-96» (для «ДТ-322» Приборы серии «ДТ» оснащены специально разработанным программным обеспечением, поддерживающим автоматическую обработку данных и выдачу результатов исследования в удобной для интерпретации форме.

Проведено исследование 39 больных, страдающих различными клиническими формами розацеа. У всех пациентов (100%) исследование периферической крови методом ПЦР анализа показал результаты ферментативной недостаточности лактаза-флорингидролазы [С/Т и С/С]. У 31 пациента выявлен генотип С/С, у 8 больных розацеа установлен генотип С/Т. Таким образом, выявление в периферической крови у всех больных розацеа генотипов С/Т и С/С указывало на наличие функциональной недостаточности ферментной системы желудочно-кишечного тракта - лактазы-флорингидролазы гена МСМ6, способной к расщеплению дисахарида - лактозы, являющейся одной и патогенетических звеньев в развитии воспалительного процесса при указанном дерматозе.

Приводим клинические наблюдения.

Клинический случай 1

Больная О.З. 1978 г. р. поступила в клинику 23.02.2020 г. с жалобами на стойкое покраснение в области лица, жжение в очагах поражений. Страдает в течение 2 лет. В начале заболевания беспокоили эпизодические приливы в области лица и покраснение, которые в течение 10-15 минут исчезали. За полтора - два месяца до поступления в клинику беспокоила стойкая эритема лица, усиливающая при эмоциональном напряжении, воздействии ультрафиолетового излучения, при нахождении вблизи источника тепла, при физических нагрузках и употреблении горячей пищи. Пользовалась наружно кортикостероидными мазями с временным улучшением.

При объективном осмотре лицо больной отечное, имеется воспалительная эритема, локализующая в области щек, лба, носогубной треугольнике и подбородке. На фоне эритематозных пятен имеются телеангиэктазии и также папулезные элементы. Субъективно беспокоит жжение в очагах поражений. При обследовании внутренних органов особых изменений не обнаружено. Больная жалуется на нерегулярный стул. Выставлен клинический диагноз: розацеа, эритематозная стадия.

Параклинические анализы: Общий анализ крови от 29.02.2020 г.: эритроциты 4,8х10^А12/л, гемоглобин 139 г/л, гематокрит 42,2%, средний объем эритроцита (MCV) 88,7 фл, среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН) 29,1 г/л, средняя концентрация НЬ в эритроците (МСНС) 328 г/л, цветной показатель 0,88, лейкоциты 6,2×10^9/л, нейтрофилы 3,39 10^9/л, палочкоядерные нейтрофилы 2%, сегментоядерные нейтрофилы 52%, лимфоциты 33%, моноциты 6%, эозинофилы 6%, базофилы 1%, СОЭ 2 мм/ч, тромбоциты (PLT) 370×10^9/л, средний объем тромбоцита (MPV) 7,8 фл, индекс распределения тромбоцитов по объему (PDW) 15,4, тромбокрит (РСТ) 0,3%. Биохимические анализы крови: Антитела IgA к глиадину 0,409 Ед/ мл (в норме <25); Антитела IgG глиадину 0,148 Ед/мл (в норме <25), генетика метаболизма лактозы (С/С), Вир гепатита A IgM отр., Вирус гепатита A IgG>200 МЕ/мл (в норме 0,00-20,00), антигены вирусного гепатита В отсутствуют, антигены гепатита С отсутствуют, АЛТ - 9,00 Ед/л, (в норме 0,00-49,00 Ед/л), ACT - 14,5 Ед/л, в норме 0,00-49,00), ГГТ 7,00 U/L (в норме 0,00-49,00).

Клинический случай 2

Больная К.С. 1950 г. р. поступила в клинику с жалобами на появление покраснения в области лица и гнойничковых элементов. Субъективно беспокоят жжение и боль в очагах поражения. Страдает в течение 10 лет. По поводу розовых угрей (розацеа) неоднократно лечилась у дерматологов с временным улучшением. Поступила в клинику 24.06.2019 г. При объективном осмотре лицо больной отечное, имеется воспалительная гиперемия в области обеих щек, на лбу, в области век, на подбородке. На гиперемированном фоне располагаются папуло-пустулезные элементы. При пальпации беспокоит боль в очагах. Выставлен клинический диагноз: розацеа, папуло-пустулезная форма.

При обследовании внутренних органов с помощью УЗДГ выявлен жировой гепатоз печени, липоматоз поджелудочной железы. В желчном пузыре единичные конкременты.

Параклинические методы исследований от 26.06.2019 г.: 1) общий анализ крови: концентрация гемоглобина (HGB) 141 g/L, концентрация эритроцитов (RBC) 4,56×10^12/L, гематокрит (НСТ) 38,7%, средний объем эритроцитов (MCV) 84,8 fL, среднее содержание гемоглобина (МСН) 30,9 pg, средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (МСНС) 364g/L, цветной показатель 0,92, тромбоциты (PLT) 123×10^9/L, средний объем тромбоцитов (MPV) 8,0 fL, тромбокрит (РСТ) 0,098%, лейкоциты 4,3×10^9/L, палочкоядерные нейтрофилы 3%, сегментоядерные нейтрофилы 64%, эозинофилы 1%, лимфоциты 25%, моноциты 7%, СОЭ 12 мм/ч. биохимический анализ крови: АЛТ 43,2 Е/л (норма 0,00-40,00), ACT 52,4 Е/л (норма 0,00-40,00), ГГТ 97,9 ед/л (норма до 32), общий холестерин 4,1 ммоль/л (норма до 5,2), липопротеиды высокой плотности 1,25 ммоль/л, (норма 1,03-1,54), липопротеиды низкой плотности 2,7 ммоль/л (норма <2,59), триглицериды 0,82 ммоль/л (норма <1,7), генетика метаболизма лактозы МСМ6 (С/С), антигены вирусного гепатита А (анти HAV - IgM) -отрицательный, анти HAV-IgG - 273 мМЕ/мл (норма 0,00-20,00), антиген вирусного гепатита В (HBs-Ag) отрицательный, антиген вирусного гепатита С (анти HCV - IgM положительный), антиген вирусного гепатита С (анти HCV суммарные антитела) - положительный (ОП=2,703) (норма - отрицательный ОП=0,220), антитела к глиадину IgG - 0,3 Ед/мл (норма 0,00-25,00), антитела к глиадину IgA -2,5 Ед/мл (норма 0,00-25,00). Клинический случай 3.

Больной Э.К. 1994 г. р. поступил в клинику 0.4.10.2019 г. с жалобами на стойкое покраснение лица, сопровождающееся жжение в очагах поражений. Страдает в течение 1,5 лет. Лечился у дерматологов с незначительным улучшением. Последнее обострение наблюдалось два месяца назад.

При объективном осмотре у больного в области лица имеется воспалительная гиперемия с наличием телеангиэктазий в очагах поражений. Очаги преимущественно локализуются на обеих щеках и в области подбородка. Выставлен клинический диагноз: розацеа, эритематозно-телеангиэктатическая форма.

При объективном осмотре со стороны внутренних органов особых изменений не найдено. Параклинические методы исследования от 05.10.2019 г.: Общий анализ крови: концентрация гемоглобина HGB (162 g/L), концентрация эритроцитов (RBC) 5,29×10^12/L, гематокрит (НСТ) 48,8%, средний объем эритроцитов (MCV) 92,2 fL, среднее содержание гемоглобина (МСН) 30,6 pg, средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (МСНС) 332 g/L,ширина распределения эритроцитов (RDW-CV) 12,2%, ширина распределения эритроцитов (RDW-SD) 43,5 fL, цветной показатель 0,92, тромбоциты (PLT) 222×10^9/L, средний объем эритроцитов (MPV) 8,6 fL, тромбокрит (РСТ) 0,191%, лейкоциты (WBC) 7,9×10^9/L, палочкоядерные нейтрофилы 5%, сегментоядерные нейтрофилы 55%, эозинофилы 1%, лимфоциты 36%, моноциты 3%, СОЭ 6 мм/ч. Биохимические анализы крови: генетика метаболизма лактозы МСМ6 9 (С/Т), антиген вирусного гепатита А (анти HAV-IgM) отрицательный, (анти HAV-IgG) 190 мМЕ/мл (норма 0,00-20,00), антиген вирусного гепатита В (HBs-Ag) - отрицательный, антигены вирусного гепатита С (анти HCV- IgM) отрицательный, анти HCV суммарные антитела - отрицательный, Щелочная фосфатаза 74,1 Ед/л (норма 40,00-130,00), гаммаглутамилтрансфераза ГГТ 25 ед/л (норма 0,00-49,00), АЛТ 25,1 Е/л (норма 0,00-40,00), ACT 24,5 Е/л (норма0,00-40,00), общий билирубин 10,9 мкмоль/л (норма 2-21), прямой билирубин 4 мкмоль/л (норма 0,00-4,30), тимоловая проба 0,52 Ед (норма 0,00-4,00).

Таким образом, исследование генотипов МСМ6 - лактаза-флорингидролазы у больных различными клиническими формами розацеа является эффективным методом диагностики функциональной патологии желудочно-кишечного тракта.