Результат интеллектуальной деятельности: Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.

Прототипом является вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Баженова Е.А., Киселева И.В., Матюшенко В.А., Исакова-Сивак И.Н., Ларионова Н.В., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1) pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2735291. Опубликовано: 29.10.2020 Бюл. №31]. Однако в последние годы в странах, расположенных в Северном полушарии, широкое распространение получили вирусы, относящиеся к клайду 6 В.1А.5А, которые в процессе циркуляции приобрели дополнительные аминокислотные замены D187A и Q189E, позволяющие им ускользнуть от имеющейся иммунной прослойки в человеческой популяции [https://cdn.who.int/media/docs/default-source/influenza/whoinfluenza-recomme-ndations/vcm-northern-hemisphere-reconimendation-2020-2021/202002-recom-mendation.pdf?sfvrsn=6868e7b3_21&download=true]. В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1) pdm09, известный вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1) pdm09 - прототип - утратил свою актуальность и вследствие этого не может эффективно защищать население во время эпидемии, вызванной А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09-подобными штаммами вируса гриппа. По этой причине в феврале 2020 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) дала рекомендации по замене A/H1N1-pdm09 компонента в составе противогриппозных вакцин для Северного полушария на 2020-2021 эпидемический сезон на А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09-подобные вирусы [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020 -2021 northern hemisphere influenza season. 28 February 2020. https://www.who.int/publications/m/item/recormnended-composition-of-influenza-virus-vaccines-for-use-in-the-2020-2021-northern-hemisphere-influenza-season].

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического вируса А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными, безвредными для человека штаммами - донорами аттенуации [Shcherbik, S.; Pearce, N.; Kiseleva, L; Larionova, N.; Rudenko, L.; Xu, X.; Wentworth, D.E.; Bousse, T. Implementation of new approaches for generating conventional reassortants for live attenuated influenza vaccine based on Russian master donor viruses. J Virol Methods 2016, 227, 33-39, doi:10.1016/j.jviromet.2015.10.009].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа -разрешен для получения живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2 - два гена, кодирующих поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) -от донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм A/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Выбранный чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и са-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма A/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 показало, что ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в перекрестной РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09, поскольку показатели взаимодействия реассортанта A/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 и родительского штамма А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09 с крысиными антисыворотками, полученными к эпидемическому вирусу A/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09 и к вакцинному реассортанту А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09, полностью совпадали (табл. 1).

Второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом полного секвенирования последовательности соответствующего гена, в ходе которого была подтверждена идентичность последовательности данного гена соответствующему гену эпидемического родительского вируса А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09, из чего очевидно следует его полная антигенная идентичность.

Для анализа состава генома полученных в процессе подготовки вакцинного штамма реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины // «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» - №2. 2018. - с. 101-107] с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных для анализа генома современных штаммов подтипа H1N1 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Результаты анализа всех генов вакцинного штамма A/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 представлены в табл.2. Установлено, что формула генома вакцинного штамма А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 - 6:2, что соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) унаследованы от эпидемического родительского вируса А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09, гены, кодирующие внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), унаследованы от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Данные, полученные при отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома. Было показано, что последовательность генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, полностью соответствует последовательности соответствующих генов донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2), последовательность генов, кодирующих гемагглютинин и нейраминидазу полностью соответствует последовательности соответствующих генов вируса A/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1) pdm09.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций, связанных с аттенуированным фенотипом вакцинного штамма A/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, в куриных эмбрионах. Последовательность нуклеотидов на интересующем участке определяли методом пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design.

На фиг. 1 приведен пример пирограммы, полученной для фрагмента гена М, содержащего аттенуирующую мутацию в позиции 68 у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), приводящую к замене Ile-15-Val. Чтение нуклеотидов происходит с комплементарной цепи. Присутствие замены характеризуется отсутствием пика в первой позиции и присутствием пика во второй позиции. В результате пиросеквенирования вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) - эпидемического предшественника донора аттенуации, не обладающего аттенуирующей мутацией, присутствует пик в первой позиции и отсутствует - во второй (фиг. 1, фрагмент А). Наличие аттенуирующей мутации А → G характеризуется отсутствием пика в первой позиции и присутствием - во второй, что можно увидеть на пирограмме, полученной для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (фиг. 1, фрагмент Б), а также на пирограмме, полученной для фрагмента гена М вакцинного штамма А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 (фиг. 1, фрагмент В).

В таблице 3 приведены результаты пиросеквенирования всех фрагментов генов вакцинного штамма А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09, содержащих аттенуирующие мутации, соответствующие донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), до и после пятикратного пассирования в развивающихся куриных эмбрионах. Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 и не утрачиваются в процессе пассирования.

Таким образом, анализ сохранности аттенуирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 показал генетическую стабильность его аттенуирующих мутаций и отсутствии их реверсий в процессе пассирования.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма A/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09, проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09, в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤1.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 7.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04. 2016. https://cdnimg.rg.ru/pril/130/25/64/43232.pdf]

Мышам вводили однократно внутрибрюшинно одну человеческую дозу, соответствующую 0.5 мл вакцинного вируса в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/мл. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 4) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью актуального эпидемического вируса А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 депонирован 11.11.2020 года в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского под №2965 и имеет характеристики, представленные в образце паспорта штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 9.0 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:1024.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа A/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 может быть использован для производства живой гриппозной интраназальной вакцины с целью профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.