Способ моделирования неалкогольной жировой болезни печени при помощи диеты, насыщенной фруктозой

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, и может быть использовано в эксперименте для изучения эффективности различных схем терапии неалкогольной жировой болезни печени.

Известен способ моделирования, предложенный рядом авторов, при помощи использования генетически модифицированной линии животных имеющих мутации гена лептина ob/ob (лептин-дефицитные), или рецептора лептина db/db (резистентные к действию лептина) [Бивалькевич Н. В. Закономерности структурно-функциональной реорганизации печени при формировании диет-индуцированной неалкогольной жировой болезни печени у крыс; кандидатская диссертация, Владивосток, 2015 г]. Тем не менее, в генетически-индуцированных моделях формирования неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) у крыс линий оb/оb и db/db в связи с недостаточной активностью лептина наблюдаются ожирение, инсулинорезистентность и стеатоз печени, однако отмечается устойчивость к прогрессированию стеатонекроза и фиброза [Norepinephrine regulates hepatic innate immune system in leptindificient mice with nonalcogolic steatohepatitis / Z. Li [et al.] // Hepatology. 2004. Vol. 40, N 2. P. 434-441.]. Помимо этого очевидна и дороговизна с труднодоступностью животных с данными мутациями.

Использование метионин-холин-дефицитной диеты (МХД) позволяет смоделировать тяжелую степень стеатоза печени и некротические изменения с воспалительным ответом уже на второй неделе эксперимента, с дальнейшим прогрессированием до септального и препортального фиброза [Fan J.G., Qiao L. Commonly used animal models of non-alcoholic steatohepatitis // Hepatobiliary pancreat. dis. int. 2009. Vol. 8, N 3. P. 233–240]. При всем сходстве патологических изменений в печени животных с НАЖБП у людей отмечаются различия в течении заболевания. Так, при модели МХД диеты у крыс наблюдается потеря мышечной и жировой массы до 40% за 10 недель. В отличие от НАЖБП у людей, у животных на МХД диете не развивается инсулинорезистентность, и, таким образом, не отражается в полной мере патофизиология неалкогольной жировой болезни печени. Кроме того, развитие заболевания наблюдается не у всех животных, содержащихся на экспериментальном рационе. В зависимости от вида, пола и линии животных может наблюдаться значительная резистентность к развитию НАЖБП при помощи МХД диеты. Эти несоответствия ограничивают использование данной модели в исследованиях [Fan J.G., Qiao L. Commonly used animal models of non-alcoholic steatohepatitis // Hepatobiliary pancreat. dis. int. 2009. Vol. 8, N 3. P. 233–240]. Кроме того, в ходе информационного поиска не удалось найти и подробной схемы данной диеты для лабораторных животных.

Диета с высоким содержанием жиров также довольно широко используется для формирования стеатоза и неалкогольного стеатогепатита у животных. В литературе упоминается модель Либера и др., при которой формирование НАЖБП происходит путем интергастрального кормления животных эмульсией с высоким содержанием жиров, представляющей собой смесь 71% жиров, 11% углеводов и 18% белков. При данной экспериментальной модели на 21 сутки происходит формирование стеатоза и воспалительной инфильтрации печени на фоне окислительного стресса и инсулинорезистентности [Mechanisms of hepatic steatosis in mice fed a lipogenic methionine choline-deficient diet / M.E. Rinella [et al.] // J. lipid. res. 2008. Vol. 5, N 49. P. 1068–1076. doi: 10.1194/jlr.M800042-JLR200]. Однако данный метод достаточно трудоемок и требует специального оборудования и определенных навыков исследователя.

Техническим результатом является создание пищевого рациона для самостоятельного кормления мышей линии C57Bl/6, позволяющего моделировать у животных изменения печени, аналогичные тем, которые наблюдаются у людей с неалкогольной жировой болезнью печени. За основу диеты была взята фруктоза, которая по данным ряда источников способна индуцировать жировой гепатоз печени у мышей [TakahashiY., SoejimaY., FukusatoT.Animal models of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis // WorldJ. gastroenterol. 2012. Vol. 18, N 19.P. 2300–2308]. Однако в ходе работы было установлено, что мыши не употребляют фруктозу ни в чистом виде, ни в составе сухой смеси с зерновыми кормами.

Технический результат достигнут при помощи применения следующей схемы. Сухой зерновой корм для грызунов, из расчета 4-5 грамм корма в сутки на одну мышь весом 30-40 грамм перемешивают с сухой фруктозой, из расчета 2-3 грамма фруктозы на одну мышь весом 30-40 грамм в сутки. Смесь заливают кипятком, вновь перемешивают и настаивают до остывания. Затем сливают жидкую часть. Непосредственно перед употреблением во влажную смесь добавляют фруктозу, из расчета 2-3 грамма фруктозы на одну мышь в сутки, перемешивают и используют для кормления животных. Корм насыпают в кормушку, животные поедают его самостоятельно. При этом объем питьевого режима мышей включает 30-40% водный раствор фруктозы в объёме 3-4 мл в сутки на одну мышь массой 30-40 грамма в сутки.

Способ был апробирован на 46 мышах линии C57Bl/6 на базе Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины ВГМУ им. Н.Н.Бурденко.* Масса тела животных на момент включения в исследование составляла 30–40 г. Исследования проводились в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (National Academypress, 1996). Материалом для исследований явились ткань печени и кровь мышей. Было сформировано 3 экспериментальные группы. Забор крови и морфологическое исследование печени мышей производили на 30 и 75 сутки моделирования заболевания для определения референсных значений изучаемых показателей и оценки их изменений в ходе применения экспериментальной диеты. Общепринятыми методами в крови определяли такие биохимические маркеры, как содержание глюкозы, концентрацию общего билирубина, активность ферментов аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, и щелочной фосфатазы (ЩФ), содержание общего холестерина. Спектрофотометрическое исследование для измерения уровня малонового диальдегида в гомогенате печени при помощи тиобарбитуровой кислоты. Для гистологического исследования ткани печени фиксировали в 10% забуференном формалине (рН – 7,2). Структуру долек и клеток печени исследовали после заливки в парафин, на срезах, окрашенных гематоксилин-эозином. Липиды выявляли окраской REDOIL “O” с докраской гематоксилином на криостатных срезах. Для определения степени активности стеатогепатита использовали шкалу NAS [Диагностика и лечение неалкогольной жировой болезни печени; под редакцией академика РАН профессора В. Т. Ивашкина; Москва 2015 г., стр.13-14].

Уже начиная с 30-х суток исследования у животных опытной группы была замечена тенденция к увеличению уровня общего билирубина в плазме крови, в этом сроке наблюдения не более, чем на 5% превышающем норму, преимущественно за счет свободной фракции. Уровень показателя продолжал нарастать в ходе эксперимента. Такой рост, на наш взгляд, отражает прогрессирующую дисфункцию печени по мере развития стетогепатита. Подтверждением этого тезиса является повышение и показателей цитолиза, таких как АлАт, АсАт уже к 30 дню на 37% выше нормы. Изучение содержания в крови животных исследуемой группы на 30 сутки эксперимента ЩФ — основного биохимического маркера холестатического синдрома — выявило достоверное умеренное нарастание активности этого фермента, составившее 13% выше нормы. Выявлено увеличение содержания малонового диальдегида в гомогенате печени на 16% выше референсных значений.

Гистологическое исследование структуры печени крыс при формировании неалкогольной жировой болезни печени в течение 30 суток показало выраженные изменения по сравнению с гистоморфологией печени контрольных мышей. У животных опытной группы были выявлены признаки гидропической и жировой дистрофии печени. Мы обнаружили нарушение балочной структуры печеночных долек. Часть гепатоцитов имела признаки гидропической дистрофии: гепатоциты увеличены в объёме, были выявлены участки просветления цитоплазмы – вакуоли, заполненные жидкостью. Ядра изменённых клеток окрашивались бледно.

Окраска на липиды RedOil позволила выявить жировые включения, которые присутствовали в большем количестве, чем в группе контроля, затрагивая уже 23±8% гепатоцитов, и были представлены преимущественно мелкокапельными и единичными среднекапельными включениями. Распределение липидов в разных долях печени было однородным, была выявлена тенденция к более густой жировой инфильтрации в перицентральных областях.

В группе, содержавшейся на экспериментальной диете 75 суток, содержание малонового диальдегида в гомогенате печени было повышено в среднем на 27%. Отмечалась выраженная гиперхолестеринемия, показатель возрос на 69% в сравнении с нормой; гипергликемия – на 13% выше нормы, гиперферментемия – АсАт на 76% выше нормы, АлАт на 69% выше нормы, незначительная гипербилирубинемия на 10% выше нормы. Содержание общего белка оставалось в рамках референсных значений.

При формировании НАЖБП в течение 75 суток в печени животных обнаруживалось резко выраженные признаки гидропической и жировой дистрофии: гепатоциты увеличены в объёме, отмечаются участки просветления цитоплазмы – вакуоли, заполненные жидкостью. Значительная часть гепатоцитов имела признаки альтерации: изменение формы клеток с выраженной вакуолизацией цитоплазмы вплоть до баллонной дистрофии. Участки зернистой слабоэозинофильной цитоплазмы располагаются вокруг ядер и вдоль клеточных мембран. Во всех зонах долек выявлялись грубые нарушения гистологической архитектоники и балочной структуры печёночных долек, признаки гидропической и жировой дистрофии. Баллонная дистрофия затрагивала до 75% гепатоцитов.

Жировая дистрофия гепатоцитов была значительно выражена и имела вид мелкокапельной и среднекапельной вакуолизации. При помощи окраски на липиды с помощью красителя RedOil, была выявлена массивная жировая дистрофия печени. Наибольшая аккумуляция липидов отмечалась в гепатоцитах перицентральных зон. При мелкокапельной вакуолизации цитоплазма гепатоцитов была пенистой, пылевидные вакуоли располагались равномерно по цитоплазме, не смещая ядра. При среднекапельной вакуолизации в цитоплазме имелись округлые капельные включения, накапливающие краситель. Жировые включения в образцах печени мышей после 75 суток эксперимента затрагивали около 82±15% гепатоцитов, и были представлены мелкокапельными, 48±8%, и среднекапельными, 34±7%, жировыми включениями. Распределение липидов в разных дольках было однородным, имелась тенденция к более густой жировой инфильтрации в перицентральных областях.

Таким образом, по шкале NAS срезы печени от мышей из группы, находящейся на экспериментальной диете, получили среднюю величину в 6,7 балла, что соответствовало высокой активности неалкогольного стеатогепатита.

Таблица 1. Изменения исследуемых показателей при моделировании неалкогольной жировой болезни печени в эксперимента по предлагаемому способу.

Таблица 2. Сравнительная характеристика предлагаемого и известных способов моделирования НЖББП.

Таким образом, предложенный нами пищевой рацион для самостоятельного кормления мышей линии C57Bl/6, приводил к развитию у экспериментальных животных стеатогепатита, характеризующегося явлениями мембранодеструкции, признаками жировой, гидропической дистрофии, нарушением гистологической архитектоники морфофункциональных единиц печени. Такие гистологические изменения характерны и для людей, больных неалкогольной жировой болезнью печени. Имеются изменения и в биохимических показателях крови, нарастающие в зависимости от продолжительности содержания на экспериментальной диете, а именно гиперферментемия, гипергликемия, гипербилирубинемия, увеличение показателя щелочной фосфатазы. Так же увеличивалось содержание малонового диальдегида в гомогенате печени, которое свидетельствует об усилении пероксидного окисления липидов и является характерными признаком НАЖБП у людей. Существенным преимуществом разработанного нами способа является простота выполнения, дешевизна и доступность предлагаемого нами экспериментального рациона. Животные питаются самостоятельно, дополнительного введения экспериментатором веществ перорально или иными путями не требуется.

* За помощь, оказанную при проведении различных этапов исследования авторы выражают благодарность сотрудникам НИИ экспериментальной биологии и медицины ВГМУ имени Н.Н.Бурденко:

руководителю лаборатории постгеномных исследований, старшему научному сотруднику, к.б.н. Антаковой Любви Николаевне; старшему научному сотруднику, к.б.н. Герасимовой Ольге Андреевне; старшему лаборанту Сенчуковой Любви Николаевне; лаборанту Корденко Антону Анатольевичу; лаборанту Самолдиной Светлане Викторовне; лаборанту Мешковой Валентине Юрьевне; Чусовой Лидии Петровне и Износовой Марии Борисовне.