Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ ХИТОЗАНА

Изобретение относится к области химии полимеров, нанотехнологии, фармацевтической промышленности, медицине и может быть использовано для получения полимерных наночастиц из высокомолекулярного хитозана, перспективного для создания новых, в том числе персонализированных лекарственных форм.

Последнее четвертое поколение лекарственных средств на основе наночастиц - так называемых терапевтических систем - характеризуется высокой эффективностью, отсутствием побочных эффектов, пролонгированным действием, предполагает направленный транспорт лекарственного вещества и его векторное действие в зоне запланированной локализации, а также, и это самое главное, инициирование процесса саногенеза (восстановление механизмов саморегуляции) живого организма. Терапевтически активные наночастицы получают, как правило, инкапсулированием биологически активного вещества (БАВ) в липосомальную или липоплексовую оболочку, полиэлектролитные капсулы, наномицеллы амфифильных полимеров или циклодекстриновые нанополости, либо адсорбцией БАВ на поверхности наночастиц и др. В отличие от классических лекарственных форм, проникновение действующего вещества которых обеспечивается через эндотелий, проникновение наносистем происходит на уровне эндоцитоза.

Наибольшим потенциалом должны обладать наночастицы полностью построенные из БАВ. В качестве потенциального материала для создания таких частиц может рассматриваться аминополисахарид хитозан. Хитозан обладает антибактериальным, противовирусным и фунгицидным действием, проявляет антитоксическую, иммунотропную и противовоспалительную активности. Материалы на основе хитозана совместимы с живыми тканями, биорезорбируемы, способны стимулировать процессы ранозаживления, регенерации тканей, саногенеза.

В настоящее время для получения наночастиц хитозана используют методы сшивания полимерной эмульсии преимущественно глутаровым альдегидом, коацервации/осаждения с использованием растворов неорганических солей, распылительной сушки в присутствии сшивающих агентов или в среде сверхкритических жидкостей, ионотропного гелеобразования с применением натриевой соли триполифосфата и др. (Naskar S., Koutsu K., Sharma S. Chitosan-based nanoparticles as drug delivery systems: a review on two decades of research // Journal of Drug Targeting. 2019. Vol. 27. No 4. P 379-393).

Данные методы получения наночастиц хитозана многостадийны, сложны в аппаратурном оформлении и требуют дорогостоящего оборудования. Некоторые методы предполагают использование органических растворителей, сшивающих реагентов и поверхностно-активных веществ, большинство из которых не разрешено к применению в медико-фармацевтических приложениях и образует токсичные побочные продукты. Все это может оказывать негативное действие на биосовместимость и другие биохимические свойства готового материала, и соответственно, ограничивать его применение в медицинской практике.

Известен способ получения наночастиц низкомолекулярного хитозана (см. Патент РФ. №2428432 по кл. МПК С08В 37/08, опуб. 10.09.2011). Способ предусматривает растворение предварительно очищенного низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой ММ~10 кДа в водном растворе уксусной кислоты концентрации 1-2 мас.%, медленное (0.1-0.2 мл/мин) введение раствора гидроксидов щелочных металлов или аммония до рН среды 6.9-7.0 при перемешивании на магнитной мешалке в течение 2-х час. Полученную дисперсию центрифугируют со скоростью 10000 об/мин, твердый остаток редиспергируют в бидистиллированной воде при механическом перемешивании со скоростью 200-300 об/мин и температуре 20°С. По данным динамического светорассеяния способ позволяет получить наночастицы низкомолекулярного хитозана с размером от 30 до 85 нм.

Однако, в предложенном способе получения наночастиц хитозана используют только низкомолекулярные образцы хитозана. Кроме того, образец необходимо предварительно очистить. Способ отличается многостадийностью, трудоемкостью, длительностью процесса формирования наночастиц хитозана. Процесс диспергирования используют на двух этапах: сначала в процессе депротонирования ацетата хитозана в течение двух часов, затем в процессе редиспергирования осадка депротонированного хитозана. Цель - получение биологически активных наночастиц хитозана - в способе не ставилась.

Известен способ получения наночастиц хитозана размером 10-20 нм, в том числе флуоресцентных, парамагнитных (см. заявку WO 2009/009469 по кл. МПК А61В5/055, опуб. 15.01.2009). Способ заключается в следующем: хитозан растворяют в 1% растворе уксусной кислоты и получают эмульсию введением эффективных количеств неионогенного поверхностно-активного вещества (Тритон Х-100), циклогексана и гексанола-1. Одновременно получают вторую эмульсию на основе эффективных количеств циклогексана, гексанола-1, водного раствора винной кислоты, 1-этил-3-(3-диметиламинопропилкарбодиимида), н-гидроксисукцинимида и неионогенного поверхностно-активного вещества. К эмульсии, содержащей хитозан, по каплям добавляют вторую эмульсию, перемешивают в течение 24 час, добавляют этанол, осадок суспендирут в воде, подвергают диализу и центрифугируют со скоростью 8000 об/мин в течение 15 мин. К центрифугату снова добавляют этанол и обрабатывают ультразвуком в течение 10 с. Процедуру повторяют не менее 5 раз. Полученный центрифугат ресуспендируют в воде и фильтруют для получения монодисперсных наночастиц. По данным просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния способ позволяет получить наночастицы хитозана с размером от 10 до 20 нм. В других вариантах осуществления способа уксуснокислый хитозан дополнительно ковалентно сшивают с флуоресцентным красителем изотиоцианатом флуоресцеина. Полученные таким образом наночастицы проявляют флуоресценцию. Альтернативно, уксуснокислый хитозан сшивают с органическим макроциклом, содержащим хелатные парамагнитные ионы, такие как гадолиний, диспрозий, европий или их комбинацию. Выделенные наночастицы парамагнины и могут быть использованы в качестве контрастной среды магнитно-резонансной томографии.

Однако, предложенный способ отличается многокомпонентностью (более девяти компонентов), сложностью аппаратурного оформления и условий проведения процесса формирования наночастиц хитозана, многостадийностью, многократностью процесса отмывки полученных наночастиц, трудоемкостью. Полученные наночастицы хитозана могут выполнять лишь функцию контрастирующего вещества при зондировании биотканей и впоследствии должны быстро выводиться из зоны локализации. О фармацевтическом применении наночастиц в способе не указывается.

Наиболее близким к заявленному является способ получения наночастиц глутамата хитозана (см. Патент РФ №2562723 по кл. МПК С08В37/08, опуб. 10.09.2015). Способ предусматривает растворение порошка хитозана с ММ=3, 9 или 30 кДа в водном растворе глутаминовой кислоты концентрации 0.0050-0.1375% в соотношении [хитозан] : [глутаминовая кислота] = 1 : 0.864 при перемешивании со скоростью 200 об/мин в течение 2 час. По первому варианту способа реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре, затем в систему вводят этанол и центрифугируют. Твердый осадок фильтруют и сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С. По второму варианту способа реакционную смесь перемешивают при температуре 70°С. По окончании реакции полученный раствор вакуумируют на роторном испарителе при 70-75°С и при -0.8-0.9 атм, а затем при той же температуре в вакууме 0.5-1 мм рт.ст. По данным динамического светорассеяния водной дисперсии способ позволяет получить наночастицы глутамата хитозана размером от 165 до 340 нм.

Однако, в предложенном способе получения наночастиц глутамата хитозана используются только низкомолекулярные образцы хитозана. Реализация способа требует специального дорогостоящего оборудования (термостат, вакуумный сушильный шкаф, роторный испаритель), высоких температур, низких давлений (вакуум), достаточно длительного времени проведения эксперимента. Введение этилового спирта в объем реакционной смеси может вызвать агрегацию нанодисперсий и укрупнение наночастиц. Кроме того, при высаживании частиц этиловым спиртом протекает депротонирование солевой формы хитозана, так что в способе получают частицы не глутамата хитозана, а хитозана в основной форме. Получение биологически активных наночастиц хитозана в способе не ставилось.

Технической проблемой заявляемого изобретения является разработка способа получения биологически активных, устойчивых к агрегации наночастиц на основе высокомолекулярного хитозана.

Техническим результатом является получение биологически активных, кинетически стабильных наночастиц хитозана размером 50-80 нм при упрощении способа получения и сохранении высокой биологической активности полимерной системы.

Техническая проблема достигается тем, что в способе получения наночастиц хитозана, заключающемся в смешивании хитозана с кислотой и получении целевого продукта, согласно изобретению, используют порошок высокомолекулярного хитозана, в качестве кислоты используют порошок L-аспарагиновой кислоты, которые смешивают и диспергируют в воде для получения раствора аспарагината хитозана с концентрацией в нём хитозана (1.8-3.5)⋅10^-2 М и концентрацией L-аспарагиновой кислоты (1.5-3.0)⋅10^-2 М при мольном соотношении [хитозан(-NH₂)] : [кислота] = 0.6-2.3, полученный раствор аспарагината хитозана фильтруют, формируют тонкую плёнку этилового спирта, на поверхность которой напыляют раствор аспарагината хитозана в объемном соотношении [аспарагинат хитозана] : [спирт] = 1 : 1 и оставляют для испарения жидкости при температуре 20±2°С не более 1 часа для получения наночастиц в виде порошка.

Используют хитозан со степенью дезацетилирования ≥ 75-80 мольн.% и молекулярной массой 200 кДа.

L-аспарагиновая кислота (Asp) - двухосновная, биполярная алифатическая аминокислота, одна из 20 протеиногенных аминокислот организма, выполняет роль нейромедиатора в центральной нервной системе. Данная кислота и её соли широко используются как компоненты лекарственных средств.

Изобретение поясняется иллюстрацией, где на фиг. 1 представлены РЭМ-фотографии наночастиц хитозана: на фиг. 1 а - с размером частиц 50-80 нм, на фиг. 1 б - с размером частиц 60-80 нм.

В основе способа получения наночастиц хитозана лежит нанофазовое разделение раствора аспарагината хитозана с одновременным депротонированием полимера (воздушно-сухие наночастицы).

Таким образом, наночастицы представляют собой высушенные порошки наночастиц хитозана. Частицы агрегативно устойчивы более трех лет.

Для визуализации и определения размера воздушно-сухих наночастиц используют растровый электронный микроскоп РЭМ MIRA II LMU («TESCAN»), снабженный энерго-дисперсионным анализатором EDX INCA ENERGY 350. На образцы предварительно напыляют 5-10 нм золота на приборе Ermitech K 4.

В качестве исходных реагентов для получения наночастиц используют хитозан со степенью дезацетилирования ≥ 75-80 мольн.% и ММ = 200 кДа, L-аспарагиновую кислоту, бидистиллированную воду, дегазированную от СО₂ и О₂ кипячением при 100°С в течение 1 час.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят водный раствор аспарагината хитозана из расчета концентрации в нём хитозана С_ХТЗ = (1.8-3.5)⋅10^-2 М и концентрации L-аспарагиновой кислоты C_Asp = (1.5-3.0) ⋅10^-2 М при соблюдении мольного соотношения [хитозан(-NH₂)] : [кислота] = 0.6-2.3. Процесс растворения компонентов проводят по стандартной методике при комнатной температуре. Для этого навески порошка хитозана и порошка аспарагиновой кислоты помещают в колбу заданного объема, добавляют расчетное количество бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения компонентов (формирования аспарагината хитозана) не более 2 часов и фильтруют через фильтр Millipore с диаметром пор ≤ 0.45 мкм. Хранят при +4°С не более двух суток.

Для получения наночастиц хитозана используют принципы нанопреципитации (соосаждения). Для этого на инертной зеркальной подложке формируют тонкую пленку из этилового спирта, на поверхность которой напыляют раствор аспарагината хитозана в объемном соотношении [аспарагинат хитозана] : [спирт] = 1 : 1 и оставляют для испарения жидкости не более 1 час. Размер выделенных частиц определяют с использованием РЭМ-микроскопии. Наночастицы хитозана представляют собой воздушно-сухой порошок.

Использование для получения наночастиц водного раствора аспарагината хитозана с концентрацией хитозана более 3.5⋅10^-2 М и концентрацией L-аспарагиновой кислоты более 3.0⋅10^-2 М нецелесообразно вследствие ограниченной растворимости компонентов. При использовании растворов аспарагината хитозана с С_ХТЗ < 1.8·10-2 М и C_Asp < 1.5⋅10^-2 М получается незначительное количество наночастиц.

Пример 1. Готовят водный раствор аспарагината хитозана из расчета в нём концентраци хитозана 1.8⋅10^-2 М и концентрации L-аспарагиновой кислоты 3.0⋅10^-2 М. Для этого навески порошка хитозана и порошка L-аспарагиновой кислоты помещают в колбу заданного объема, добавляют расчетное количество бидистиллированной воды, перемешивают в течение 2-х час. Полученный раствор аспарагината хитозана фильтруют через фильтр Millipore с диаметром пор ≤ 0.45 мкм. Далее на инертной зеркальной подложке формируют тонкую пленку из этилового спирта, на поверхность которой напыляют раствор аспарагината хитозана в объемном соотношении [аспарагинат хитозана] : [спирт] = 1 : 1 и оставляют для испарения жидкости при температуре 20±2°С не более 1 час.

По данным РЭМ-микроскопии размер выделенных наночастиц хитозана составляет 50-80 нм.

Пример выделенных наночастиц хитозана приведен на фиг. 1 а.

Пример 2. Все этапы получения наночастиц хитозана аналогичны примеру 1. Отличие в том, что концентрация хитозана в растворе составляет С_ХТЗ = 3.5⋅10^-2 М. Размер выделенных частиц 60-80 нм. Пример выделенных наночастиц хитозана приведен на фиг. 1 б.

Пример 3. Все этапы получения наночастиц хитозана аналогичны примеру 2. Отличие в том, что концентрация L-аспарагиновой кислоты в растворе составляет C_Asp = 1.5⋅10^-2 М. Размер выделенных частиц 50-70 нм.

Таким образом, примеры показывают возможность получения кинетически стабильных наночастиц хитозана размером 50-80 нм сравнительно простым способом получения с использованием принципов соосаждения.

Пример 4. Оценка цитотоксичности и биосовместимости наночастиц хитозана. Используют порошок наночастиц хитозана, полученный по примерам 1 - 3. Оценку цитотоксичности и биосовместимости проводят с использованием культуры человеческих дермальных фибробластов, полученных из биоптатов кожи здоровых взрослых доноров после косметической операции.

В стерильные чашки Петри вносят ростовую среду DMEM (Sigma), дополненную 10% FBS (Hyclone) и 1% антибиотиков (Sigma), суспензию наночастиц хитозана, полученную диспергинованием порошка наночастиц в бидистиллированной воде в течение 10 мин, в объемном соотношении [суспензия наночастиц] : [ростовая среда] = 1 : 5, а затем суспензию человеческих дермальных фибробластов из расчета 200 тыс.кл./мл и культивируют 72 час в условиях насыщающей влажности в инкубаторе с 5% СО₂ при 37°С. Оценивают время формирования зрелого монослоя клеток, которое сравнивают с временем формирования монослоя культуры клеток, выросшей в такой же питательной среде в отсутствие суспензии наночастиц хитозана.

Тестирование показало, что время формирования зрелого монослоя человеческих дермальных фибробластов в присутствии наночастиц хитозана и в контроле одинаковое и составляет 60 час. Таким образом, наночастицы хитозана не цитотоксичны и биосовместимы.