Результат интеллектуальной деятельности: Способ измерения концентрации активных форм кислорода (АФК) в подкожной опухоли живых экспериментальных животных

Область техники

Заявляемое изобретение относится к области биомедицины и касается способов реализации прижизненных наблюдений за уровнем активных форм кислорода (АФК) в органах и тканях и может быть использовано при скрининге для оценки свойств опухолевого микроокружения, а также влияния противоопухолевых препаратов на опухолевые клетки.

АФК являются жизненно необходимыми метаболитами в многочисленных биологических функциях. Нарушение клеточных механизмов может привести к перепроизводству АФК и вызвать окислительное повреждение ДНК, белков, клеток и тканей, которое связано с патогенезом ряда нейродегенеративных и воспалительных заболеваний.

Уровень техники

Известно, что почти во всех злокачественных новообразованиях присутствуют АФК в повышенной концентрации, которые способствуют развитию и прогрессии опухоли. Однако опухолевые клетки также экспрессируют повышенные уровни антиоксидантных белков (ферментов). Этот факт свидетельствует о том, что для нормального функционирования опухолевых клеток необходим баланс во внутриклеточном уровне АФК. Кроме того, большое значение играет тип генерируемой АФК, место его образования в опухоли и локальная концентрация. В связи с этим, необходим чувствительный метод, который позволил бы исследовать уровень АФК в конкретной точке опухоли в животном. На данный момент этому требованию удовлетворяют электрохимические методы определения АФК.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ определения уровня АФК, раскрытый в патенте РФ №2647464 и используемый в дальнейшем для определения цитотоксичности веществ по изменению уровня внутриклеточных АФК. В известном способе определение уровня АФК проводят на клетках, расположенных на твердой подложке. Определение уровня АФК проводят путем ввода внутрь клетки заполненного углеродом кварцевого нанокапилляра, содержащего платину в полости острия нанокапилляра, имеющего форму усеченного конуса, с последующим определением изменения сигнала, вызванного электрохимической реакцией на острие капилляра с участием АФК.

Известный способ имеют такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как измерение АФК с помощью заполненного углеродом кварцевого нанокапилляра, содержащего платину в полости острия нанокапилляра, имеющего форму усеченного конуса, с последующим определением изменения сигнала, вызванного электрохимической реакцией на острие капилляра с участием АФК.

Недостатком известного способа является невозможность проведения измерений АФК внутри подкожной опухоли экспериментального животного.

Раскрытие сущности изобретения

Техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам, за счет создания способа определения концентрации АФК в подкожной опухоли экспериментальных животных, обеспечивающего возможность измерения в выбранном участке опухоли.

Технический результат, достигаемый при использовании заявляемого изобретения, заключается в обеспечении возможности определения концентрации АФК внутри опухоли живого экспериментального животного в заданной точке с высоким пространственным и временным разрешением с помощью наноэлектрода при потенциале +800 мВ относительно хлорсеребряного электрода сравнения, что позволит получить полную картину распределения АФК в объеме опухоли.

Поставленная задача решается тем, что способ измерения концентрации АФК в подкожной опухоли экспериментальных животных включает последовательное выполнение следующих этапов:

1) предварительная подготовка живых экспериментальных животных с подкожно привитой опухолью, для чего животных наркотизируют посредством внутрибрюшинного введения раствора золетила (50-75 мг/кг) с ксилазином (5-7,5 мг/кг),

2) обеспечение доступа к подкожной опухоли животного, для чего проводят разрез кожи по линии позвоночника и отделяют кожную складку с опухолью от прилегающих тканей, проводят прижигание кровеносных сосудов в местах разреза и очищают опухоль от капсулы посредством удаления ее верхних слоев,

3) формирование ванночки для проведения исследования из кожной складки и подкожной мускулатуры спины животного, для чего края кожной складки приподнимают и закрепляют с помощью шовного материала,

4) заполнение ванночки фосфатно-солевым буфером с рН 7.4,

5) подготовка измерительного наноэлектрода, представляющего собой нанопипетку, заполненную пиролитическим углеродом с осажденной на нем платиной, с предварительной калибровкой наноэлектрода по пероксиду водорода,

6) размещение экспериментального животного на предметном столике микроскопа, установка измерительного наноэлектрода в держателе интравитально-электрохимического модуля (ИВЭХ-модуля), взаимное позиционирование опухоли и измерительного наноэлектрода, помещение хлорсеребряного электрода сравнения в ванночку с раствором фосфатно-солевого буфера, подключение его к измерительной системе,

7) подача линейной развертки потенциала от -800 мВ до +800 мВ,

8) пошаговое введение наноэлектрода в опухоль на заданную глубину под заданным углом и измерение силы тока при +800 мВ для исследования концентрации АФК на каждом шаге погружения наноэлектрода,

9) определение значения концентрации АФК в опухоли по соответствующей калибровочной кривой.

Для реализации способа используют мышей линии BALB/c с подкожно привитыми опухолями карциномы молочной железы мыши 4Т1. Экспериментальное животное подвергают дополнительному наркозу через установленный в хвостовую вену животного катетер. При увеличении концентрации АФК происходит увеличение тока, поскольку вблизи рабочей поверхности электрода происходит увеличение числа молекул пероксида водорода, которые окисляются при потенциале +800 мВ. Глубина погружения наноэлектрода в опухоль, как правило, составляет 1-3 мм.

Краткое описание чертежей

Заявляемое изобретение поясняется следующими чертежами и изображениями.

На фиг. 1 приведена схема расположения опухоли, подкожно привитой мыши линии BALB/c.

На фиг. 2 схематично представлены подготовленное к измерению экспериментальное животное и измерительная система для реализации заявляемого способа.

На фиг. 3 приведено изображение наноэлектрода.

На фиг. 4 приведена микрофотография кончика наноэлектрода.

На фиг. 5 представлен пример калибровочной кривой, построенной для расчета концентрации пероксида водорода по силе тока.

На фиг. 6 представлены результаты измерений концентрации АФК при проникновении в опухоль.

Позициями на чертежах обозначены:

1. Место имплантации опухоли экспериментальному животному (латеральнее срединной линии)

2. Место имплантации опухоли экспериментальному животному (краниально от основания хвоста)

3. Опухоль

4. Венозный катетер

5. Кожная складка с опухолью

6. Шовный материал

7. Хлорсеребряный электрод сравнения

8. Наноэлектрод

9. Лейкопластырь

10. Усилитель тока

11. Микроманипулятор

12. Платформа для создания ванночки

Осуществление изобретения

Ниже представлено подробное описание изобретения. Специалисту понятно, что нижеприведенное описание осуществления настоящего изобретения носит исключительно пояснительный характер и не ограничивает объем притязаний, заявленных в формуле изобретения.

Заявляемый способ реализуют в несколько этапов.

1) предварительная подготовка экспериментальных животных с подкожно привитой опухолью

Для проведения измерений АФК в опухоли брали лабораторных мышей. При проведении экспериментальных работ по реализации заявляемого способа были проанализированы опухоли различного размера - от 15 до 80 мм² - для выявления наиболее оптимального. Было установлено, что опухоли, площадь которых превышала 40 мм², не подходят для данного вида исследований, поскольку такие опухоли имеют очень развитую разветвленную систему кровеносных сосудов, что затрудняет их подготовку. Что касается опухолей, площадь которых не превышала 25 мм², то их использование для работы также представлялось неоптимальным, поскольку в силу своих размеров они обладали ограниченным количеством мест для введения наноэлектрода (1-2 измерений на опухоль). В связи с этим для проведения исследований по измерению АФК использовали опухоли площадью 25-40 мм2. Для этого мышам подкожно вводили 0,5×10⁶-1,5×10⁶ опухолевых клеток и через 7-8 дней проводили эксперименты. Для того, чтобы обеспечить доступ наноэлектрода к максимальной площади поверхности опухоли, ее следует имплантировать на расстоянии 0,7-1 см латеральнее срединной линии (линии позвоночника) и 2,5-3,5 см краниально от основания хвоста животного (Фиг. 1).

Для обеспечения общей анестезии экспериментальных животных при реализации заявляемого способа используют дозу 50-75 мг/кг золетила в смеси с ксилазином 5-7,5 мг/кг. Указанная доза обеспечивает адекватное наркотизирование животного на протяжении 40-90 минут. Поддерживающая доза составляла 10% от исходной; ее введение каждые 30-60 минут позволяло проводить исследования на протяжении 3-6 ч.

2) обеспечение доступа к подкожной опухоли животного

Животное укладывают на живот на операционный столик. Предпочтительно, чтобы столик был оборудован камерой для поддержания температуры тела животного, а также подвижными светодиодными лампами и увеличительным стеклом. В хвостовую вену животного вводят катетер, через который осуществляются инъекции дополнительной смеси золетила с ксилазином в течение эксперимента. Конечности животного фиксируют на поверхности столика при помощи кожного пластыря Blenderm. Хирургическое вмешательство начинают, убедившись в том, что животное находится в глубоком наркозе (замедленное дыхание, торможение сухожильных и вибрисс-рефлексов). Несмотря на то, что перед имплантацией опухоли зону инъекции выбривают, на момент проведения измерений шерсть отрастает, кроме того, электробритва не может полностью удалить волосяной покров. В то же время попадание даже мелких волос на поверхность препарата ограничивает рабочую зону для исследования. В связи с этим перед разрезом поверхность кожи обрабатывают минеральным маслом, которое уменьшает вероятность попадания шерсти на инструменты и позволяет добиться чистоты препарата. Разрез проводят при помощи ножниц и пинцета вдоль линии позвоночника от основания хвоста вверх на 3-5 см. Отклонение от срединной линии может привести к кровотечению. Остановку кровотечения в этом и других случаях осуществляют коагулятором.

3) формирование ванночки для проведения исследования из кожной складки и подкожной мускулатуры спины животного

Вокруг опухоли создают специальную ванночку, имеющую достаточно протяженные (3-5 см в длину и 2-3 см в ширину) размеры, высотой 0,5-0,7 см. Это связано с тем, что небольшая или узкая ванночка, а также высокие стенки ванночки могут препятствовать движению наноэлектрода, закрепленного в держатель под углом 45°, приводя при этом к большим погрешностям измерений. С одной стороны краем ванночки служит мускулатура спина мыши, с другой - кожная складка.

Для формирования ванночки при помощи двух пинцетов с загнутым краем отделяют кожный лоскут с опухолью, отрезая ножницами соединительно-тканные пленки. При этом следует избегать прямого контакта инструментов с поверхностью опухоли, а также повреждения сосудов. Убедившись, что выделенный кожный лоскут позволяет экспонировать опухоль, края этого лоскута фиксируют шовным материалом с атравматической иглой с двух сторон. Для этого иглу захватывают иглодержателем, прокалывают кожу на краю лоскута, избегая повреждения крупных сосудов. Далее проводят иглу с ниткой через отверстие и, отрезав 7-10 см нитки, фиксируют один ее конец к коже при помощи двойного узла. Свободный конец прикрепляют к поверхности хирургического стола при помощи кожного пластыря Blenderm так, чтобы обеспечить расправление и равномерное натяжение кожного лоскута с опухолью на столе. После того как кожный лоскут с опухолью закреплен и растянут, прижигают его края (где проходил разрез) для предотвращения кровотечения, даже если отсутствуют его видимые признаки. Далее при помощи специальных ножниц и пинцета под тщательным визуальным контролем с использованием увеличительного стекла аккуратно удаляют соединительную ткань капсулы с поверхности опухоли, не допуская повреждения сосудов и по возможности минимизируя количество контактов инструментов с предполагаемой областью исследования. После этого опухоль промывают раствором фосфатно-солевого буфера (PBS) для удаления тканевого дебриса и мелкого мусора, избытки раствора удаляют салфеткой с края препарата. Процедуру повторяют дважды. Ванночку заполняют PBS так, чтобы вся опухоль была полностью погружена в раствор. Подготовленное таким образом животное помещают рядом с измерительной установкой (Фиг. 2).

4) подготовка измерительного наноэлектрода

Измерение проводят с помощью наноэлектрода, основой которого выступает изготовленная из кварцевого стекла пипетка, острый конец которой заполнен углеродом. В полости осажденного углерода содержится платина (Фиг. 3, 4). Методика изготовления наноэлектродов подробно описана в патенте РФ №2647464.

Известно, что внутри опухоли концентрация АФК может варьироваться. Поэтому при реализации предлагаемого способа необходимо предварительно осуществить калибровку вводимого в опухоль измерительного наноэлектрода по одному из видов наиболее стабильной АФК, например, по пероксиду водорода.

Для построения калибровочного графика по АФК, наноэлектрод и электрод сравнения подключают к традиционно используемым приборам для снятия вольтамперных характеристик и последовательно опускают в водные растворы пероксида водорода с известной концентрацией в диапазоне от 10^-7 до 10^-4 моль/л, подают развертку потенциала от -800 мВ до +800 мВ относительно хлорсеребряного электрода сравнения на наноэлектрод и измеряют значения силы тока при+800 мВ в каждом водном растворе пероксида водорода. Это позволяет построить калибровочную кривую, где на одной оси приведена концентрация пероксида водорода, а на другой - величина силы тока, что позволят осуществлять количественную оценку уровня АФК (Фиг. 5).

Пероксид водорода выступает как наиболее стабильная форма АФК. Большинство нестабильных АФК переходят в пероксид водорода. Поэтому построение калибровочной кривой по пероксиду водорода оправдано для дальнейших измерений общей концентрации АФК внутри опухоли экспериментального животного.

5) размещение экспериментального животного на предметном столе микроскопа, установка измерительного наноэлектрода в держателе интравитально-электрохимического модуля (ИВЭХ-модуля), взаимное позиционирование опухоли и измерительного наноэлектрода, помещение хлорсеребряного электрода сравнения в ванночку с раствором фосфатно-солевого буфера, подключение его к измерительной системе

Наноэлектрод помещают в держатель так, чтобы серебряная проволока имела контакт со слоем пиролитического графита. Держатель, размещенный в микроманипуляторе, подключают к измерительной системе (усилителю), позволяющей регистрировать силу тока и/или потенциал, а также подавать разность потенциалов на наноэлектрод. Измерительную систему подключают к аналого-цифровому преобразователю с целью дальнейшей передачи сигнала на компьютер. Опускают наноэлектрод с помощью манипулятора в буферный раствор над опухолью. Туда же помещают солевой мостик, соединенный с емкостью, в которой находится хлорсеребряный электрод.

6) подача линейной развертки потенциала для исследования концентрации пероксида водорода

Подают линейную развертку потенциала от -800 мВ до +800 мВ на наноэлектрод относительно хлорсеребряного электрода со скоростью развертки, например, 400 мВ/с, и получают вольтамперную характеристику. Сначала в фосфатно-солевом буферном растворе над опухолью, затем внутри опухоли. Для определения значений концентрации АФК регистрируют значения силы тока при +800 мВ и пересчитывают по калибровочной кривой в концентрацию пероксида водорода.

7) пошаговое введение наноэлектрода внутрь опухоли на заданную глубину под заданным углом и измерение силы тока на каждом шаге погружения наноэлектрода

С помощью микроманипулятора пошагово вводят наноэлектрод вглубь опухоли. Величина шага может быть различной и составляет, например, 100 мкм. Угол, при котором вводят наноэлектрод, может быть различным и составлять, например, от 30° до 55° по отношению к плоскости, на которой размещено экспериментальное животное. Выбор угла подведения наноэлектрода зависит от размещения экспериментального животного на предметном столе микроскопа и выбора места вхождения в опухоль. Таким образом, угол вхождения наноэлектрода выбирается так, чтобы наноэлектрод проникал по нормали к выбранной области. На каждом шаге записывают 10 циклов вольтамперной характеристики. Глубина вхождения внутрь опухоли может быть различной и составляет, например, от 1000 до 3000 мкм.

8) определение значения концентрации АФК в опухоли по соответствующей калибровочной кривой

С помощью программного обеспечения Origin определяют значения силы тока при +800 мВ для полученной вольтамперной характеристики на различных глубинах. Полученные значения с помощью ранее полученной калибровочной кривой преобразовывают в концентрацию АФК (Фиг. 6).

Примеры конкретного выполнения

Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1

Посредством заявляемого способа была измерена концентрация АФК в поверхностных и глубоких слоях карциномы молочной железы, подкожно привитой экспериментальным мышам линии BALB/c. Животные были получены из Андреевского центра животных (Андреевка, Россия) в возрасте 7-9 недель и весом 18-21 г. Все эксперименты на животных были одобрены биоэтическим комитетом Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н.И. Пирогова (протокол №25/2017, 26/2017). Мышей содержали по 5 штук в клетках с системой индивидуальной вентиляции.

Установка для исследования концентрации АФК, с помощью которой реализован заявляемый способ, позволяющая измерять сверхмалые токи порядка 1 пА, включает следующие элементы:

- Аналого-цифровой преобразователь AxonDigidata 1550 В (MolecularDevices, США);

- Patch-clamp усилитель тока Axon MultiClamp 700 В (Molecular Devices, США);

- Микроманипулятор PatchStar (Scientifica, США);

- Компьютер с установленной программой WinWCP и с установленным программным обеспечением для управления и обработки данных;

- Цифровой микроскоп с увеличением 200х;

- Стол для подавления посторонних вибрация (SuperTech, Венгрия).

Измерения концентрации АФК в поверхностных и глубоких слоях опухоли проводили с помощью наноэлектродов, основой которых выступали нанопипетки, заполненные пиролитическим углеродом с осажденной на них платиной. Наноэлектрод калибровали по пероксиду водорода непосредственно перед проведением исследования. Для этого его помещали в растворы пероксида водорода с различной концентрацией от 10^-7 до 10^-4 моль/л и определяли значения силы тока при +800 мВ. В результате получали калибровочную кривую, исходя из которой впоследствии рассчитывали концентрацию пероксида водорода в опухоли, измеренную с помощью ИВЭХ-модуля. Наноэлектрод устанавливали в держатель и подключали последний к предусилительной головке. С помощью манипулятора опускали наноэлектрод в раствор PBS, находящийся в ванночке с опухолью. В этот же раствор помещали солевой мостик от хлорсеребряного электрода сравнения. Подавали потенциал от -800 мВ до +800 мВ (скорость развертки 400 мВ/с) и отмечали значения тока при +800 мВ. С помощью джойстика наноэлектрод подводили к выбранному участку опухоли. Устанавливали параметры для дальнейшего профилирования опухоли по АФК с шагом 100 мкм. После введения наноэлектрода в опухоль на глубину 2 мм и стабилизации вольтамперной характеристики пошагово отводили наноэлектрод. Данную процедуру повторяли 5 раз, выбирая при этом различные места опухоли, находящиеся на расстоянии 3 мм друг от друга. В результате были получены данные, показывающие, что на глубине 250-400 мкм обнаруживаются области с повышенным содержанием АФК относительно таковых на глубине до 100 мкм (37 мкМ по сравнению с 15 мкМ), а также участки, где концентрация АФК находится на том же уровне, что и в поверхностных слоях опухоли (порядка 10 мкМ).

Заявляемый способ обеспечивает возможность определении концентрации АФК внутри опухоли живого экспериментального животного в заданной точке с высоким пространственным и временным разрешением. Измерение концентрации АФК внутри опухоли экспериментального животного обеспечивается за счет специальной подготовки экспериментального животного к проведению эксперимента. Сверхмалый размер наноэлектрода позволяет определять АФК внутри опухоли с высоким пространственным разрешением на различных глубинах. Используемая программа подачи потенциала позволяет регистрировать концентрацию АФК внутри опухоли с хорошим временным разрешением в режиме реального времени.