Транспортная жидкая питательная среда для сохранения жизнеспособности бруцеллезного микроба

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к получению питательных сред, обеспечивающих оптимальные условия для жизнедеятельности бруцеллезного микроба при их транспортировке. Изобретение целесообразно использовать для диагностических исследований на бруцеллез клинического материала от людей.

Для диагностики бруцеллеза проводят сбор биоматериала от больного, подозрительного на данное заболевание, путем забора из вены 5 мл крови и посева ее на жидкую питательную среду. В таком виде биоматериал отправляют для дальнейшего исследования в специализированную бактериологическую лабораторию (МУК 4.2.3010-12 Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней, стр. 16).

Известна транспортная жидкая питательная среда для сбора, культивирования и транспортировки крови больных, подозреваемых на заболевание бруцеллезом, содержащая, г/л: гидролизат говяжьего мяса 170,0; натрий хлористый 5,0; глицерин 20,0; глюкозу 10,0; цитрат натрия 5,0; САГ - 10,6; 20%-ную гидроокись натрия 0,0001-0,0003; дистиллированную воду до 1 л (патент РФ №2247775. Опубл. 10.03.2005 г. Бюл. №7).

Недостатком данной питательной среды является невозможность приобретения стимулятора роста САГ-1 в связи с закрытием института биоорганической химии АН УССР (Украина).

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда (жидкая) для культивирования бруцелл, содержащая, г/л: гидролизат говяжьего мяса 170,0; натрий хлористый 5,0; глицерин 20,0; глюкозу 10,0; цитрат натрия 5,0; липоевую кислоту 0,5; дистиллированную воду до 1 л (патент РФ №2238973. Опубл. 27.10.2004 г. Бюл. №30).

Недостатком данной среды является невозможность приобретения для изготовления среды стимулятора роста бруцелл, липоевой кислоты, в малом количестве, а также ее дороговизна.

Целью предполагаемого изобретения является получение транспортной жидкой питательной среды для сохранения жизнеспособности бруцеллезного микроба от момента посева крови больного, подозреваемого на бруцеллез, до доставки проб в специализированную лабораторию.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что посев крови от больного, подозреваемого на бруцеллез, осуществляют в транспортную жидкую питательную среду для сохранения жизнеспособности бруцеллезного микроба, разлитую и завальцованную в пенициллиновые флаконы (объемом 15 мл) по 5 мл, стерильную, которая сохраняет жизнеспособность бруцеллезного микроба при транспортировке на любые расстояния.

Достигаемый технический результат заключается в том, что основой предлагаемой транспортной жидкой питательной среды для сохранения жизнеспособности бруцеллезного микроба является: пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, уголь активированный, также основа включает натрий хлористый, глицерин, глюкозу, натрий лимоннокислый, дистиллированную воду до 1 л, с добавлением в среду стимулирующих добавок - стимулятора роста гемофильных микроорганизмов и натрия метабисульфита, при следующем соотношении ингредиентов:

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - ГОСТ 13805-76. Производитель ООО «НПО «Порт-Петровск». Дата изготовления 05.2018 г. Годен до 05.2021 года. Пептон представляет собой смесь разнообразных частиц распада белка, не свертывающихся при нагревании (пептоны, пептиды, аминокислоты и т.д.). Пептон ферментативный в своем составе содержит 16 аминокислот, мг %: аспарагиновая кислота 0,40±0,03; треонин 0,30±0,01; серии 0,40±0,03; глутаминовая кислота 0,50±0,03; глицин 0,50±0,01; аланин 1,0±0,02; валин 0,80±0,02; метионин 0,40±0,02; изолейцин 0,70±0,01; лейцин 2,40±0,06; тирозин 0,40±0,01; фенилаланин 1,30±0,01; лизин 1,30±0,05; гистидин 0,20±0,02; аргинин 1,70±0,09; триптофан 0,06±0,01 (Шепелин А.П., Дятлов И.А. Питательные среды для энтеробактерий. Оболенск, 2017. 232 с. С. 43).

Дрожжевой экстракт - произведен во Франции, партия № AD 17A04592. Дата изготовления 10.2017 г. Срок годности 10.2020 г.

Дрожжевой экстракт используется в качестве полноценного и дешевого источника факторов роста микроорганизмов, что повышает ростовые свойства предлагаемой питательной среды (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1986). По химическому составу дрожжи представляют высокоценный питательный субстрат, весьма близкий к мясу, содержащий до 53% белка. Дрожжевой экстракт используют как источник витамина группы В, азотистых оснований. Богатство дрожжей белками и витаминами позволяет получать из них высококачественные питательные среды («Питательные среды в медицинской микробиологии», Козлов Ю.А., М., Медгиз. 1950 г., с. 101-102).

Натрий хлористый - хч, ГОСТ 4233-77, партия 24. Произведен в г. Барнаул. Дата изготовления 06.2017 г. Срок годности 3 года. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитической диссоциации, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке. Натрий хлористый необходим для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала.

Глюкоза кристаллическая - ЧДА, партия 20140327, ООО «МСД Торговая компания». Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глюкозы в концентрации 1% улучшаются ее ростовые свойства.

Глицерин - ГОСТ 6259-75, партия 21.2015. Дата выпуска 04.2018. Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глицерина в концентрации 2% улучшаются ее ростовые свойства.

Натрий лимоннокислый 3-зам. 5,5 вод. ГОСТ 22280-76. Партия №6. Дата изготовления 10.2018 г. Срок годности 10.2019 год. Применяется широко в клинической практике для сохранения жизнеспособности микроорганизмов в период от момента взятия биоматериала до посева. Основная цель использования - сохранить жизнеспособность возбудителя и предотвратить размножение сопутствующей микрофлоры в период транспортировки образцов. «Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии» М.С. Поляк, В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич. Санкт-Петербург. Элби-СПб. 2008. С. 22.

Стимулятор роста гемофильных микроорганизмов ТУ 9385-016-78095326-2007. ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. Г. Оболенск. Московская область.

Уголь активный древесный порошкообразный, марки ОУ-А. Тонкодисперсный порошок, черного цвета. Без посторонних включений, соответствует ГОСТ 4453-74. Абсорбирует на себя продукты метаболизма микробов.

Натрия метабисульфит, по данным авторов Zo Bell С.Е. и Meyer K.F., 1932; Lankford et al., 1952; Lankford et al.,1956; Rode et al., 1951; Гудзовский А.Г., 1982, полностью обеспечивает потребность бруцеллезного микроба в сере. Метабисульфит натрия ГОСТ 11683-76 в средах переходит в гидросульфит натрия, при нагревании происходит термическое разложение с выделением двуокиси серы (SO₂), что способствует нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов.

Дистиллированная вода - ГОСТ 6709-72, отвечает всем санитарно-гигиеническим требованиям. Внешний вид - прозрачная жидкость, хлориды, мг/дм³ нет, нитраты, мг/дм³ нет. дельная электропроводимость при 20°С, См/м - 0,38, рН - 6,5. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важнейшую роль в их физиологических функциях, а также входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях, например, в реакциях гидролиза.

Кровь человеческая донорская Ph+ 0(1). Тесты на ВИЧ, гепатиты В и С, сифилис отрицательны. Дата донации 27.08.2018 г.

Пенициллиновые флаконы ФО-1-10 по ТУ 64-2-1087, вместимостью 15 мл, марка НС-2 или МТО. Флаконы герметично закрывают резиновыми пробками К-2 по ТУ 38.006108-95, или типа ТУ 38.106618-95, завальцовывают алюминиевыми колпачками по ТУ 9467-003-05749470-94.

Шприц LUER. Апирогенно. 5Б/5m1. Сделано в России. Шприц инъекционный однократного применения. Срок годности 10.2019 г. Шприц для введения крови в пенициллиновые флаконы.

Шприц для инсулина 1 А/1 m1. Шприц инъекционный однократного применения. Срок годности 01.2022 г. Шприц для забора зараженного материала из пенициллиновых флаконов и дальнейшего высева на пластинки питательного агара.

Стандарт мутности оптический, эквивалентный 10 международным единицам (10 ME) (ОСО мутности 42-28-85-2018), дата изготовления 01.06.2019 г., годен до 01.06.2020 г. (производство ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Россия).

Предлагаемая среда создает оптимальные условия для сохранения жизнеспособности и роста бруцелл от момента посева крови больного, подозрительного на бруцеллез, до доставки проб в специализированную лабораторию. Введение в состав среды стимулирующих добавок -стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, метабисульфита натрия, и сочетанное применение вышеописанных ингредиентов в целом обеспечивает существенное повышение ростовых свойств транспортной питательной среды жидкой в отношении бруцелл.

Способ получения транспортной жидкой питательной среды для сохранения жизнеспособности и роста бруцелл заключается в следующем: в эмалированную кастрюлю вносят пептон ферментативный 20,0 г; дрожжевой экстракт 10,0 г; натрий хлористый 5,0 г; натрий лимоннокислый 3 зам. 5,5 водный 5,0 г; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 10,0 г; уголь активированный марки ОУА 20,0 г; дистиллированную воду до 1 л, затем устанавливают рН 4,5 раствором соляной кислоты в соотношении 1:1, кипятят в течение 5 мин до растворения всех составляющих, затем фильтруют через ткань Бельтинг и 8 слоев фильтровальной бумаги, в фильтрате устанавливают рН (7,6±0,1) 20% раствором натрия гидроокиси, добавляют глицерин 20,0 мл; глюкозу 10,0 г; натрий метабисульфит 0,3 г. Среду разливают в стерильные пенициллиновые флаконы объемом 15 мл по (5,0±0,1) мл, закупоривают стерильными резиновыми пробками, накрывают алюминиевыми колпачками, вальцуют, стерилизуют при 1 атм 20 мин. Готовую транспортную жидкую питательную среду используют для сохранения жизнеспособности и роста возбудителя бруцеллеза от момента посева в нее крови больного, подозрительного на бруцеллез, и до доставки проб в специализированную лабораторию для дальнейшего исследования.

Для подтверждения высоких ростовых свойств заявляемой питательной среды в соответствии с методическими указаниями МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., проводили ее контроль с использованием среды сравнения и донорской крови, искусственно контаминированной возбудителем бруцеллеза. В качестве испытуемых культур брали тест-штаммы бруцелл Brucella melitensis 16 М; В. abortus 19 ВА; В. suis 1330 и вирулентные штаммы В. melitensis 565; В. abortus 544. Испытуемые культуры бруцелл предварительно выращивали на скошенном агаре Альбими, рН (7,3±0,1), при температуре 37°С в течение 48 ч. Затем культуры смывали с поверхности скошенного агара 0,9% раствором натрия хлорида, доводили концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85П ФГБУ НЦЭСМП МЗ России, эквивалентную 1,7×10⁹ бруцелл в 1 мл. Полученную микробную взвесь культуры разводили в 0,9% растворе натрия хлорида сначала до концентрации 1×10⁹ м.к./мл, затем, серийными десятикратными разведениями, - до концентрации 1×10³ м.к./мл (разведение 10^-6).

Разведение 10^-7 (1×10² м.к./мл) получали в крови путем десятикратного титрования: 0,5 мл взвеси из разведения 10^-6 (1×10³ м.к./мл) переносили в 4,5 мл крови. В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производили стерильной пипеткой объемом 1 мл, меняя пипетку для каждого разведения.

Далее по 0,5 мл микробной взвеси каждого из штаммов В. melitensis 16 М; В. melitensis 565; В. abortus 544; В, abortus 19 ВА; В. suis 1330 из разведения 10^-7 (1×10² м.к./мл крови) одноразовыми шприцами вносили в 3 флакона с 5 мл предлагаемой транспортной жидкой питательной среды и в 3 флакона с 5 мл среды сравнения - эритрит-бульона, перемешивали и инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 22-26 ч. Одновременно по 0,1 мл этих же взвесей каждого тестируемого штамма высевали на 3 чашки Петри с эритрит-агаром (контрольный посев). Через 22-26 ч инкубации при температуре (37±1)°С по 0,1 мл микробной взвеси из каждого флакона высевали также на 3 чашки Петри с эритрит-агаром. Засеянные чашки с эритрит-агаром без подращивания и с подращиванием инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 70-74 ч.

Оценку ростовых свойств транспортной жидкой питательной среды осуществляли отдельно для каждого штамма путем визуального осмотра, измерения диаметра и подсчета среднего количества колоний бруцелл, выросших на чашках с эритрит-агаром через 70-74 ч инкубирования при температуре (37±1)°С до и после подращивания в предлагаемой транспортной жидкой среде, среде сравнения и в результате «контрольного» посева.

Среднее количество колоний бруцелл, выросших в результате «контрольного» посева, составило 32,2; 25,7; 23,7; 24,3; 21,3 для В. melitensis 16 М; В. abortus 19 ВА; В. suis 1330, В. melitensis 565; В. abortus 544, соответственно.

Пример 1. Тестируемые штаммы выращивали на питательной среде, содержащей: пептон ферментативный 18,0 г; дрожжевой экстракт 8,0 г; натрий хлористый 3,0 г; натрий лимоннокислый 3-зам. 5,5 водный 3,0 г; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 8,0 г; уголь активированный марки ОУА 18,0 г; дистиллированную воду до 1 л. Указанные ингредиенты соединяли в эмалированной кастрюле и устанавливали рН 4,5 раствором соляной кислоты в соотношении 1:1, кипятили в течение 5 мин до растворения всех составляющих, затем фильтровали через ткань Бельтинг и 8 слоев фильтровальной бумаги, в фильтрате устанавливали рН (7,6±0,1) 20% раствором натрия гидроокиси, и добавляли глицерин 18,0 мл; глюкозу 8,0 г; натрий метабисульфит 0,1 г.

При таком соотношении ингредиентов количество колоний в S-форме, диаметром 1,0-1,2 мм, выросших на пластинках агара через 70-74 ч из посевной дозы 10 м.к., для В. melitensis 16 М; В. abortus 19 ВА; В. suis 1330, В. melitensis 565; В. abortus 544, соответственно, в среднем составляло: 98,6; 90,2; 93,8; 75,4; 102,5 после подращивания в предлагаемой среде и 100,8; 104,2; 102,6; 89,9; 104,9 в среде сравнения.

Пример 2. Штаммы выращивали на питательной среде содержащей, пептон ферментативный 20,0 г; дрожжевой экстракт 10,0 г; натрия хлорид 5,0 г; натрий лимоннокислый 3 зам. 5,5 водный 5,0 г; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 10,0 г; уголь активированный марки ОУА 20,0 г; дистиллированную воду до 1 л. Указанные ингредиенты соединяли в эмалированной кастрюле и устанавливали рН 4,5 раствором соляной кислоты в соотношении 1:1, кипятили в течение 5 мин до растворения всех составляющих, затем фильтровали через ткань Бельтинг и 8 слоев фильтровальной бумаги, в фильтрате устанавливали рН (7,6±0,1) 20% раствором натрия гидроокиси, и добавляли глицерин 20,0 мл; глюкозу 10,0 г; натрий метабисульфит 0,3 г.

При таком соотношении ингредиентов количество колоний в S-форме, диаметром 1,5-2,0 мм, выросших на пластинках агара через 70-74 ч из посевной дозы 10 м.к., для В. melitensis 16 М; В. abortus 19 ВА; В, suis 1330, В. melitensis 565; В. abortus 544, соответственно, в среднем составляло: 112,2; 111,5; 113,2; 94,6; 121,1 после подращивания в предлагаемой среде и 100,8; 104,2; 102,6; 89,9; 104,9 в среде сравнения.

Пример 3. Штаммы выращивали на питательной среде, содержащей: пептон ферментативный 22,0 г; дрожжевой экстракт 12,0 г; натрия хлорид 7,0 г; натрий лимоннокислый 3 зам. 5,5 водный 7,0 г; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 12,0 г; уголь активированный марки ОУА 22,0 г; дистиллированную воду до 1 л. Указанные ингредиенты соединяли в эмалированной кастрюле и устанавливали рН 4,5 раствором соляной кислоты в соотношении 1:1, кипятили в течение 5 мин до растворения всех составляющих, затем фильтровали через ткань Бельтинг и 8 слоев фильтровальной бумаги, в фильтрате устанавливали рН (7,6±0,1) 20% раствором натрия гидроокиси, и добавляли глицерин 22,0 мл; глюкозу 12,0 г; натрий метабисульфит 0,3 г.

При таком соотношении ингредиентов количество колоний в S-форме, диаметром 1,3-1,4 мм, выросших на пластинках агара через 70-74 ч из посевной дозы 10 м.к., для В. melitensis 16 М; В. abortus 19 ВА; В. suis 1330, В. melitensis 565; В. abortus 544, соответственно, в среднем составляло: 102,7; 93,4; 90,9; 77,1; 99,8 после подращивания в предлагаемой среде и 100,8; 104,2; 102,6; 89,9; 104,9 в среде сравнения.

Таким образом, способ получения транспортной питательной среды (пример 2) является оптимальным по количеству подобранных ингредиентов, которые в совокупности обеспечивают сохранение жизнеспособности и рост бруцелл от момента посева крови больного, подозрительного на бруцеллез, до доставки проб в специализированную лабораторию.