04.07.2020
220.018.2ed1

Новые полипептиды

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к димерам сконструированных полипептидов, связывающимся с неонатальным Fc рецептором FcRn, содержащих FcRn-связывающий мотив EXXXAXXEIRWLPNLXXXQRXAFIXXLXX где X выбран из A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W и Y; X выбран из A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W и Y; X выбран из A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W и Y; X выбран из A, G, K, Q, R, S и V; X выбран из A, F, H, K, N, Q, R, S и V; X выбран из N и T; X выбран из F, W и Y; X выбран из A, D, E и N; X выбран из A, S, V и W; X выбран из D, E, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W и Y; X выбран из K и S; X выбран из A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T, W и Y; и X представляет собой D. Настоящее изобретение позволяет получать слитые белки, конъюгаты и композиции, обладающие способностью эффективно связываться с FcRn. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 21 табл., 25 пр., 18 ил.
Реферат Свернуть Развернуть

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к димерам сконструированных полипептидов, обладающим аффинностью связывания в отношении неонатального Fc рецептора (в дальнейшем обозначаемого FcRn). Данное изобретение также относится к применению таких димеров в качестве агентов для модификации фармакокинетических и фармакодинамических свойств биомолекулы, например фармацевтического средства, а также в качестве терапевтических агентов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Неонатальный Fc рецептор (FcRn) представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из тяжелой цепи, подобной трансмембранному МНС (главный комплекс гистосовместимости) класса I (α-цепь FcRn), и легкой цепи β2-микроглобулина, которая также образует часть молекул МНС класса I (Simister and Mostov (1989) Nature 337: 184-7; Burmeister et al. (1994) Nature 372: 379-83).

FcRn преимущественно локализован в эндосомах и способен связываться с сывороточным альбумином и иммуноглобулином G (IgG) при pH 6,5 или менее и высвобождать их при pH 7,0 или более (обзор представлен Roopenian (2007) Nat Rev Immunol 7: 715-25).

У млекопитающих FcRn выполняет несколько различных задач (Roopenian, см. выше). FcRn задействован в рециркуляции поглощенного путем эндоцитоза IgG и сывороточного альбумина, что позволяет избежать их деградации в лизосомах, обеспечивает им более длительный период полувыведения и большую доступность в крови по сравнению с другими сывороточными белками. Когда IgG, сывороточный альбумин и другие сывороточные белки пассивно поступают в клетку путем пиноцитоза при контакте с кровью, pH в образовавшихся эндосомах постепенно снижается, что позволяет IgG и сывороточному альбумину связываться с FcRn. Затем рецептор вместе с его присоединенным лигандом транспортируется с помощью рециркулирующих эндосом обратно на плазматическую мембрану. После возвращения к плазматической мембране pH возрастает выше 7, в результате чего связанный лиганд высвобождается.

FcRn также известен своей способностью транспортировать IgG через такие барьеры, как плацента, эпителий верхних дыхательных путей, гематоэнцефалический барьер и проксимальный отдел тонкого кишечника.

Благодаря свойствам FcRn у млекопитающих осуществляется трансцитоз IgG через плаценту от матери к плоду и трансцитоз IgG из материнского молока в кровоток младенца в проксимальном отделе тонкого кишечника.

Паттерн экспрессии FcRn различается у разных биологических видов. Однако у большинства видов FcRn широко экспрессируется клетками гематоэнцефалического барьера, эпителия верхних дыхательных путей, почек и эндотелия сосудов, антиген-презентирующими клетками, а также другими клетками гемопоэтического происхождения (Roopenian (2007), см. выше).

Были созданы антитела и пептиды, обладающие аффинностью к FcRn (Liu et al. (2007) J Immunol 179: 2999-3011, Mezo et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105: 2337-42) и β2-микроглобулину (Getman and Balthasar (2005) J Pharm Sci 94: 718-29), для ингибирования связывания эндогенных IgG с FcRn. Другой подход заключается в мутировании Fc-области IgG для повышения аффинности к FcRn (Petkova et al. (2006) Int Immunol 18: 1759-69, Vaccaro et al. (2005) Nat Biotechnol 23: 1283-8).

Для увеличения периода полувыведения белков in vivo широко применяют стратегию слияния с Fc доменом или с альбумином. Однако крупный размер таких слитых белков негативно влияет на проникновение в ткани и снижает специфичность к партнеру по слиянию (Valles et al. (2011) J Interferon Cytokine Res 32: 178-184). С другой стороны, для увеличения периода полувыведения антител осуществляли мутации в Fc-фрагменте антител, которые вводили приматам, не являющимся человеком (Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279: 6213-6). Однако применение данного подхода ограничено только до применения в отношении терапевтических антител, и его нельзя экстраполировать на другие терапевтические белки, если только эти белки не слиты с Fc-фрагментами, что также приводит к образованию крупных молекул. Для улучшения периода полувыведения белка разработали ряд химических и рекомбинантных способов, таких как ПЭГилирование и рекомбинантное слияние белка с Fc-доменом IgG или с альбумином (обзор представлен Schellenberger et al. (2009) Nat Biotechnol 21: 1186-1190). Опубликованы данные, что ПЭГилирование белков снижает их активность и вносит вклад в их иммунореактивность.

Белки, слитые с Fc, также применяли для пероральной и легочной доставки, опосредованной FcRn (Low et al., (2005) Human reproduction Jul; 20(7): 1805-13), однако из-за размера слитых молекул по-прежнему возникают аналогичные проблемы, связанные с проникновением в ткани и пониженной специфичностью.

Таким образом, в области техники по-прежнему существует большая потребность в молекулах с высокой аффинностью к FcRn. В частности, необходимы небольшие связывающиеся молекулы, которые, будучи партнером по слиянию, не оказывают негативного влияния на свойства молекул, с которыми они слиты, и не способствуют иммунореактивности.

Краткое изложение сущности изобретения

Данное описание основано на неожиданном обнаружении, что FcRn-связывающие полипептиды в димерной форме демонстрируют существенно улучшенные свойства связывания с FcRn по сравнению с соответствующими FcRn-связывающими полипептидами в мономерной форме. Авторы данного изобретения обнаружили, что связывающие свойства указанных FcRn-связывающих полипептидов в димерной форме улучшаются больше, чем ожидается при простом слиянии двух FcRn-связывающих полипептидов.

Таким образом, задачей данного изобретения является обеспечение новых FcRn-связывающих агентов.

Задачей данного изобретения также является обеспечение таких агентов для применения в модификации фармакокинетических и/или фармакодинамических свойств биомолекулы, например лекарственного средства.

Задачей данного изобретения также является обеспечение таких агентов для применения в качестве терапевтических агентов как таковых, в отдельности или в составе комбинированной терапии.

Задачей данного изобретения является обеспечение молекулы, позволяющей эффективно связываться с FcRn, при этом уменьшающей упомянутые выше или другие недостатки существующей терапии.

Эти и другие задачи, очевидные специалисту в области техники на основании данного описания, решаются в различных аспектах изобретения, изложенного в прилагаемой формуле и описанного в общем виде в данном документе.

Так, первым аспектом изобретения является обеспечение димерной формы полипептида, связывающегося с неонатальным Fc рецептором (FcRn), т.е. «FcRn-связывающего димера», содержащей первую мономерную единицу, вторую мономерную единицу и аминокислотный линкер, где каждая из указанных первой и второй мономерных единиц содержит FcRn-связывающий мотив (ВМ), который состоит из аминокислотной последовательности

где, независимо друг от друга,

Х2 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х3 выбран из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х4 выбран из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х6 выбран из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х7 выбран из A, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х16 выбран из N и Т;

Х17 выбран из F, W и Y;

Х18 выбран из A, D, Е и N;

Х21 выбран из A, S, V и W;

Х25 выбран из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х26 выбран из K и S;

Х28 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y; и

Х29 выбран из D и R,

и где указанный FcRn-связывающий димер связывается с FcRn с большей связывающей способностью по сравнению с указанной первой мономерной единицей или указанной второй мономерной единицей в отдельности.

Приведенное выше определение класса FcRn-связывающих мотивов с родственными последовательностями основано на статистическом анализе ряда случайных вариантов полипептидных мономеров с исходным каркасом, которые отобрали благодаря их взаимодействию с FcRn в нескольких различных экспериментах по отбору. Идентифицированный FcRn-связывающий мотив, или «ВМ», соответствует связывающей мишень области исходного каркаса, причем указанная область образует две альфа-спирали в составе белкового домена-трехспирального пучка. В исходном каркасе варьирующие аминокислотные остатки двух спиралей ВМ образуют связывающую поверхность для взаимодействия с константной Fc-частью антител. В данном изобретении случайная вариация остатков связывающей поверхности и последующий отбор вариантов привели к замене способности взаимодействовать с Fc способностью взаимодействовать с FcRn.

В одном воплощении FcRn-связывающий мотив по меньшей мере одной из указанных первой и второй мономерных единиц состоит из аминокислотной последовательности

где, независимо друг от друга,

Х2 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х3 выбран из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х4 выбран из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х6 выбран из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х7 выбран из A, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х17 выбран из F, W и Y;

X18 выбран из A, D, Е и N;

Х21 выбран из A, S, V и W;

Х25 выбран из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y; и

Х28 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y.

В одном воплощении первого аспекта изобретения указанный связывающий мотив по меньшей мере одной из указанных первой и второй мономерных единиц состоит из аминокислотной последовательности

где, независимо друг от друга,

Х2 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х3 выбран из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х4 выбран из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х6 выбран из А, Е, F, G, Н, I, K, Q, R, S и V;

Х7 выбран из A, F, Н, K, N, Q, R, S и V;

Х16 выбран из N и Т;

Х17 выбран из F, W и Y;

Х18 выбран из A, D, Е и N;

Х21 выбран из A, S, V и W;

Х25 выбран из D, Е, G, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х26 выбран из K и S;

Х28 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y; и

Х29 выбран из D и R.

В другом воплощении первого аспекта указанный связывающий мотив по меньшей мере одной из указанных первой и второй мономерных единиц состоит из аминокислотной последовательности, где, независимо друг от друга,

Х2 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х3 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х4 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х6 выбран из А, Е, F, G, Н, I, K, Q, R и S;

Х7 выбран из A, F, Н, K, N, Q, R, S и V;

X16 выбран из N и Т;

Х17 выбран из F и Y;

X18 представляет собой D;

Х21 представляет собой V;

Х25 выбран из D, Е, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х26 выбран из K и S;

Х28 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V и W, и

Х29 выбран из D и R.

В другом воплощении первого аспекта указанный ВМ по меньшей мере одной из указанных первой и второй мономерных единиц состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из

(I)

где, независимо друг от друга,

Х2 выбран из A, D, Е, F, Н, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;

Х3 выбран из A, D, Е, G, Н, K, L, М, N, Q, R, S, Т, V и Y;

Х4 выбран из A, D, Е, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, Т, V и Y;

Х6 выбран из A, G, K, R, S и V;

Х17 выбран из F, W и Y;

Х18 выбран из A, D, Е и N;

Х21 выбран из A, S, V и W;

Х25 выбран из D, G, Н, K, L, N, R, V и W;

Х28 выбран из A, D, Е, Н, K, L, N, Q, R, S, Т, W и Y;

и

II) аминокислотной последовательности, идентичной указанной последовательности по меньшей мере на 96%.

В еще одном воплощении указанного аспекта указанный ВМ в последовательности (I) состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из

где, независимо друг от друга,

Х2 выбран из A, D, Е, F, N, Q, R, S и W;

Х3 выбран из D, Е, G, Н, K, М, N, Q, S и Т;

Х4 выбран из A, D, Е, G, N, Q, R, S, Т, V и Y;

Х6 выбран из A, G, S и V;

Х17 выбран из F, W и Y;

X18 выбран из A, D, Е и N;

Х21 выбран из A, S, V и W;

Х25 выбран из D, G, Н, K, L, N, R и V; и

Х28 выбран из А, Е, Н, L, N, Q, R, S, Т, W и Y.

Как известно специалисту в области техники, функция любого полипептида, включая способность предложенного в данном изобретении димера связывать FcRn, зависит от третичной структуры полипептида. Таким образом, возможно произвести минимальные изменения в последовательности аминокислот полипептида, не влияя на его функцию. Таким образом, изобретение охватывает варианты FcRn-связывающего димера, например варианты, в которых по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц модифицирована, но FcRn-связывающие свойства сохранены.

Таким образом, как указано выше, данное описание также охватывает FcRn-связывающий димер, где по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит FcRn-связывающий мотив (ВМ), содержащий аминокислотную последовательность, идентичную на 96% или более полипептиду, определенному в i).

В некоторых воплощениях такие изменения могут быть произведены во всех положениях последовательностей ВМ, как описано здесь. В других воплощениях такие изменения могут быть произведены только в невариабельных положениях, также обозначаемых как каркасные аминокислотные остатки. В таких случаях запрещены изменения в вариабельных положениях, то есть в положениях, обозначенных как «X» в последовательности (I). Например, допускается, что аминокислотный остаток, относящийся к определенной функциональной группе аминокислотных остатков (например, гидрофобных, гидрофильных, полярных и т.д.), может быть заменен другим аминокислотным остатком из той же функциональной группы.

Термин «% идентичности», используемый в данном описании, можно рассчитать, например, следующим образом. Искомую последовательность выравнивают с целевой последовательностью с помощью алгоритма CLUSTAL W (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Research 22: 4673-4680). Сравнение выполняют в окне, соответствующем наиболее короткой из выравниваемых последовательностей. В некоторых случаях наиболее короткая из выравниваемых последовательностей может быть целевой последовательностью. В других случаях искомая последовательность может быть наиболее короткой из выравниваемых последовательностей. Сравнивают аминокислотные остатки в каждом положении и количество положений искомой последовательности, имеющих идентичное соответствие в целевой последовательности, выраженное в процентах, указывают как % идентичности.

В данном документе "Xn" и "Xm" используют, чтобы указать аминокислоты в положениях n и m в последовательности ВМ, как определено выше, где n и m являются целыми числами, указывающими положение аминокислоты в указанной последовательности, считая с N-конца указанной последовательности. Например, Х3 и Х7 указывают аминокислоты в положении 3 и 7, соответственно, от N-конца указанного ВМ.

В воплощениях согласно первому аспекту предложен FcRn-связывающий димер, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит FcRn-связывающий мотив, где Xn независимо выбран из группы возможных остатков согласно Таблице 1. Специалист в области техники поймет, что Xn может быть выбран из любой из указанных групп возможных остатков, и что данный выбор осуществляется независимо от выбора аминокислот в Xm, где n не равно m. Таким образом, любой из перечисленных возможных остатков в положении Xn в Таблице 1 можно независимо скомбинировать с любым из раскрытых здесь возможных остатков в любом другом вариабельном положении в Таблице 1.

Специалист поймет, что Таблицу 1 следует читать следующим образом:

В одном воплощении согласно первому аспекту предложен FcRn-связывающий димер, в котором каждая из указанных первой мономерной единицы и второй мономерной единицы содержит FcRn-связывающий мотив (ВМ), и где аминокислотный остаток «Xn» в ВМ по меньшей мере одной из указанной первой мономерной единицы и указанной второй мономерной единицы независимо выбран из «возможных остатков». Специалист поймет, что аминокислотный остаток «Xn» в ВМ первой мономерной единицы выбран независимо от аминокислотного остатка «Xn» в ВМ второй мономерной единицы. Таким образом, в Таблице 1 представлено несколько конкретных отдельных вариантов первой мономерной единицы и второй мономерной единицы согласно данному изобретению. Например, в одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, содержащий по меньшей мере одну первую или вторую мономерную единицу, где Х2 в ВМ выбран из A, I, L, N, Q, S, Т, V и W, а в другом воплощении предложен FcRn-связывающий димер, содержащий по меньшей мере одну первую или вторую мономерную едииницу, где Х2 в ВМ выбран из A, I, L и Q. Во избежание двусмысленного толкования, указанные первую и вторую мономерные единицы можно свободно комбинировать в других воплощениях. Например, в одном из таких воплощений Х3 выбран из A, D, Е, G, Н, K, L, М, N, Q, R, S и Т, тогда как Х7 выбран из А и Н, а Х25 выбран из Н, L, R, V и W.

*

В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, где Х6Х7 выбран из АН и GH в по меньшей мере одной из указанных первой и второй мономерных единиц. В одном воплощении Х6Х7 представляет собой АН. В одном воплощении Х6Х7 представляет собой GH. В одном воплощении X17X18 выбран из FD и YD в по меньшей мере одной из указанных первой и второй мономерных единиц. В одном воплощении X17X18 представляет собой FD.

В более конкретном воплощении, определяющем подкласс FcRn-связывающих димеров, последовательность ВМ по меньшей мере одной указанной первой и второй мономерных единиц удовлетворяет по меньшей мере трем из шести условий I-VI:

I. Х6 выбран из A, G, K и S, например, в частности, А;

II. Х7 представляет собой Н;

III. X17 выбран из F и Y, например, в частности, F;

IV. X18 представляет собой D;

V. Х21 выбран из V и W, например, в частности, V;

VI. Х25 выбран из Н и R, например, в частности, Н.

В некоторых примерах связывающего FcRn димера согласно первому аспекту, указанная последовательность удовлетворяет по меньшей мере четырем из шести условий I-VI. Более конкретно, последовательность может удовлетворять по меньшей мере пяти из шести условий I-VI, например всем шести из шести условий I-VI.

В одном воплощении последовательности ВМ указанных первой и второй мономерных единиц являются идентичными. В другом воплощении последовательности ВМ указанных первой и второй мономерных единиц являются различными.

Как подробно описано ниже в экспериментальной части, отбор мономерных единиц FcRn-связывающего полипептида позволил идентифицировать ряд отдельных последовательностей FcRn-связывающих мотивов (ВМ). Эти последовательности составляют отдельные варианты, полезные в качестве первой и второй мономерных единиц, как описано в данном документе. Последовательности отдельных FcRn-связывающих мотивов (ВМ) представлены на Фиг. 1 и соответствуют последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-353. Так, в одном воплощении FcRn-связывающего димера согласно первому аспекту, по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит ВМ, соответствующий последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-353, такой как выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-352. В одном воплощении указанная последовательность ВМ соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-15, SEQ ID NO: 17-140 и SEQ ID NO: 353, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 17-140. В одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-2 и SEQ ID NO: 17-140. В одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-2, SEQ ID NO: 17-92, SEQ ID NO: 94-103, SEQ ID NO: 105-125 и SEQ ID NO: 127-140, такой как группа, состоящая из SEQ NO: 17-92, SEQ ID NO: 94-103, SEQ ID NO: 105-125 и SEQ ID NO: 127-140. В одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19-20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO.75-77 и SEQ ID NO: 353, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 19-20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77. В другом воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77. В другом воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77. В еще одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75. В еще одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75. В еще одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75. В еще одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 75. В одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 75, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 75. В одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 44, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 41, группа, состоящая из SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 44, или группа, состоящая из SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 44. В одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44. В одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 44. В одном воплощении указанная последовательность соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 44.

В одном воплощении раскрытого здесь FcRn-связывающего димера обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат ВМ, соответствующий последовательности от положения 8 до положения 36 в последовательности, выбранной из одной из групп, указанных выше. В одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75. В одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 75. В одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75. В другом воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44. В еще одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 44. В одном конкретном воплощении обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат ВМ, соответствующий последовательности от положения 8 до положения 36 в SEQ ID NO: 1. В одном воплощении указанный ВМ соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в SEQ ID NO: 20. В одном воплощении указанный ВМ соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в SEQ ID NO: 23. В одном воплощении указанный ВМ соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в SEQ ID NO: 41. В одном воплощении указанный ВМ соответствует последовательности от положения 8 до положения 36 в SEQ ID NO: 44.

В некоторых воплощениях данного изобретения ВМ, как определено выше, «является частью» трехспирального пучка белкового домена. Это означает, что последовательность ВМ «встроена» в последовательность или «пересажена» на последовательность исходного домена с трехспиральным пучком, так что ВМ заменяет аналогичный структурный мотив исходного домена. Например, не ограничиваясь какой-либо теорией, предполагают, что ВМ образует две из трех спиралей трехспирального пучка и, таким образом, может заменить такой двухспиральный мотив в составе любого трехспирального пучка. Специалисту в области техники понятно, что замену двух спиралей в трехспиральном пучке домена двумя спиралями ВМ необходимо осуществлять таким образом, чтобы не повлиять на основную структуру полипептида. Таким образом, общая укладка Сα каркаса полипептида согласно данному воплощению изобретения по существу такая же, как укладка белкового домена с трехспиральным пучком, частью которого он является, например, имеет такие же элементы вторичной структуры, расположенные в том же порядке, и т.д. Таким образом, ВМ согласно изобретению, «является частью» домена с трехспиральным пучком, если полипептид согласно данному воплощению аспекта имеет такую же укладку, как и исходный домен, с учетом того, что основные структурные свойства являются общими, например эти свойства обусловливают сходство спектров CD (кругового дихроизма). Специалисту известны другие имеющие значение параметры.

В конкретных воплощениях FcRn-связывающий мотив (ВМ) в по меньшей мере одном из указанных первого и второго мономеров является, таким образом, частью белкового домена с трехспиральным пучком. Например, ВМ может по существу составлять две альфа-спирали с соединительной петлей, в составе указанного белкового домена-трехспирального пучка. В конкретных воплощениях указанный белковый домен с трехспиральным пучком выбран из доменов бактериальных белков-рецепторов. Неограничивающими примерами таких доменов являются пять различных трехспиральных доменов белка А из Staphylococcus aureus, такие как домен В и его производные. В некоторых воплощениях белковый домен с трехспиральным пучком представляет собой вариант белка Z, который является производным домена В стафилококкового белка А.

В воплощениях, где FcRn-связывающий мотив, раскрытый в данном документе, является частью белкового домена с трехспиральным пучком, по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц FcRn-связывающего димера может содержать связывающий модуль (BMod), который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из:

III)

где

[BM] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено здесь, при условии, что Х29 представляет собой D;

Ха выбран из А и S;

Xb выбран из N и Е;

Хс выбран из A, S и С;

Xd выбран из Е, N и S;

Хе выбран из D, Е и S;

Xf выбран из А и S;

и

IV) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 93% идентична последовательности, определенной в (III).

В воплощениях, где FcRn-связывающий мотив, как определено здесь, является частью белкового домена с трехспиральным пучком, по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц FcRn-связывающего димера может содержать связывающий модуль (BMod), который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из:

V)

где

[ВМ] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено здесь, при условии, что Х29 представляет собой R;

Ха выбран из А и S;

Xb выбран из N и Е;

Хс выбран из A, S и С;

Xd выбран из Е, N и S;

Хе выбран из D, Е и S;

Xf выбран из А и S; и

IV) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 93% идентична последовательности, определенной в (V).

Как обсуждено выше, полипептиды, содержащие незначительные изменения по сравнению с указанными выше аминокислотными последовательностями, которые не влияют в большой степени на их третичную структуру и функцию, также входят в объем данного изобретения. Так, в некоторых воплощениях, последовательность (IV) или последовательность (VI) по меньшей мере на 95%, например по меньшей мере на 97%, идентична последовательности, определенной в (III) и (V), соответственно.

В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность (III) или (V), где Ха представляет собой А. В альтернативном воплощении Ха в последовательности (III) или (V) представляет собой S. В одном воплощении Ха в последовательности (III) или (V) представляет собой А. В одном воплощении Ха в последовательности ((III) или (V) представляет собой S.

В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность (III) или (V), где Xb представляет собой N. В одном воплощении Xb в последовательности (III) или (V) представляет собой Е.

В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность (III) или (V), где Хс представляет собой А. В одном воплощении Хс в последовательности (III) или (V) представляет собой S. В одном воплощении Хс в последовательности (III) или (V) представляет собой С.

В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность (III) или (V), где Xd представляет собой Е. В одном воплощении Xd в последовательности (III) или (V) представляет собой N. В одном воплощении Xd в последовательности (III) или (V) представляет собой S.

В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность (III) или (V), где Хе представляет собой D. В одном воплощении Хе в последовательности (III) или (V) представляет собой Е. В одном воплощении Хе в последовательности (III) или (V) представляет собой S.

В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность (III) или (V), где XdXe выбрано из ЕЕ, ES, SD, SE и SS. В одном воплощении XdXe в последовательности (III) или (V) представляет собой ES. В одном воплощении XdXe в последовательности (III) или (V) представляет собой SE. В одном воплощении XdXe в последовательности (III) или (V) представляет собой SD.

В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность (III) или (V), где Xf представляет собой А. В одном воплощении Xf в последовательности (III) или (V) представляет собой S.

В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность (III) или (V), где Ха представляет собой А, Xb представляет собой N; Хс представляет собой А и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой А и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой А; Xb представляет собой N; Хс представляет собой С и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой S и Xf представляет собой S.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой С и Xf представляет собой S.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой А; Xb представляет собой N; Хс представляет собой A; XdXe представляет собой ND и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой A; XdXe представляет собой ND и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой А; Xb представляет собой N; Хс представляет собой С; XdXe представляет собой ND и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой S; XdXe представляет собой ND и Xf представляет собой S.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой С; XdXe представляет собой ND и Xf представляет собой S.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой А; Xb представляет собой N; Хс представляет собой A; XdXe представляет собой SE и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой A; XdXe представляет собой SE и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой А; Xb представляет собой N; Хс представляет собой С; XdXe представляет собой SE и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой S; XdXe представляет собой SE и Xf представляет собой S.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой С; XdXe представляет собой SE и Xf представляет собой S.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой А; Xb представляет собой N; Хс представляет собой A; XdXe представляет собой ES и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой A; XdXe представляет собой ES и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой А; Xb представляет собой N; Хс представляет собой С; XdXe представляет собой ES и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой S; XdXe представляет собой ES и Xf представляет собой S.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой С; XdXe представляет собой ES и Xf представляет собой S.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой А; Xb представляет собой N; Хс представляет собой A; XdXe представляет собой SD и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой A; XdXe представляет собой SD и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой А; Xb представляет собой N; Хс представляет собой С; XdXe представляет собой SD и Xf представляет собой А.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой S; XdXe представляет собой SD и Xf представляет собой S.

В одном воплощении в последовательности (III) или (V) Ха представляет собой S; Xb представляет собой Е; Хс представляет собой С; XdXe представляет собой SD и Xf представляет собой S.

В одном воплощении FcRn-связывающего димера согласно первому аспекту по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит BMod согласно последовательности (III), соответствующей последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-353, SEQ ID NO: 358 и SEQ ID NO: 360-364. Таким образом, в одном воплощении FcRn-связывающего димера согласно первому аспекту по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит BMod, соответствующий последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-353, SEQ ID NO: 358 и SEQ ID NO: 360-364, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 17-352 и SEQ ID NO: 360-364. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-15, SEQ ID NO: 17-140, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 358 и SEQ ID NO: 360-364, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 17-140 и SEQ ID NO: 360-364. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-2, SEQ ID NO: 17-140, SEQ ID NO: 358 и SEQ ID NO: 360-364. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-2, SEQ ID NO: 17-92, SEQ ID NO: 94-103, SEQ ID NO: 105-125, SEQ ID NO: 127-140, SEQ ID NO: 358 и SEQ ID NO: 360-364, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 17-92, SEQ ID NO: 94-103, SEQ ID NO: 105-125, SEQ ID NO: 127-140 и SEQ ID NO: 360-364. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19-20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75-77, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 358 и SEQ ID NO: 360-364, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 19-20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75-77 и SEQ ID NO: 360-364. В другом воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75-77, SEQ ID NO: 358 и SEQ ID NO: 360-364, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75-77 и SEQ ID NO: 360-364. В другом воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77. В другом воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77. В еще одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 358 и SEQ ID NO: 360-364, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 360-364. В еще одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 360-364. В еще одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 358 и SEQ ID NO: 360-364, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 360-364. В еще одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75. В еще одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 75. В еще одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 361 и SEQ ID NO: 364, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 361 и SEQ ID NO: 364. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 75, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 75.

В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362 и SEQ ID NO: 363, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 360 и SEQ ID NO: 362; группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 360 и SEQ ID NO: 363; или группа, состоящая из SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 362 и SEQ ID NO: 363.

В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 361 и SEQ ID NO: 363, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 361 и SEQ ID NO: 363. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 44. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 44. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в SEQ ID NO: 360 или SEQ ID NO: 362 или SEQ ID NO: 363.

В одном воплощении FcRn-связывающего димера согласно данному описанию обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат BMod, соответствующий последовательности от положения 7 до положения 55 в последовательности, выбранной из одной из групп, указанных выше. В одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 358 и SEQ ID NO: 360-364. В одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 360-364. В одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 75. В другом воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 360-364. В одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75. В другом воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44. В одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362 и SEQ ID NO: 363. В другом воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 44. В другом воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362 и SEQ ID NO: 363. В одном конкретном воплощении обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат BMod, соответствующий последовательности от положения 7 до положения 55 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 358. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 360. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 361. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 362. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 363. В одном воплощении указанный BMod соответствует последовательности от положения 7 до положения 55 в SEQ ID NO: 75 или SEQ ID NO: 364.

Также в дополнительном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, как определено выше, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

VII)

где [ВМ] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено выше, и Хс выбран из A, S и С; и

VIII) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 94% идентична последовательности, определенной в (VII).

В другом воплощении предложен FcRn-связывающий димер, как определено выше, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

IX)

где [ВМ] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено выше, и Хс выбран из A, S и С; и

X) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 94% идентична последовательности, определенной в (IX).

В одном воплощении Хс в последовательности, определенной в (IX), представляет собой S.

В альтернативном варианте предложен FcRn-связывающий димер, как определено выше, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

XI)

где [ВМ] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено выше, и Хс выбран из А и С; и

XII) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 94% идентична последовательности, определенной в (XI).

Как обсуждено выше, полипептиды, имеющие незначительные изменения по сравнению с указанными выше аминокислотными последовательностями, которые не влияют в большой степени на их третичную структуру и функцию, также входят в объем данного изобретения. Так, в некоторых воплощениях FcRn-связывающий димер, как определено выше, может содержать последовательность (VIII), (X) или (XII), которая по меньшей мере на 96%, например по меньшей мере на 98% идентична последовательности, определенной в (VII), (IX) или (XI), соответственно.

В некоторых воплощениях FcRn-связывающего димера по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из

где [ВМ] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено выше.

В одном воплощении по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц FcRn-связывающего димера может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из:

XIII)

где [ВМ] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено выше, и

XIV) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 94% идентична последовательности, определенной в (XIII).

В одном воплощении последовательность (XIII) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 354-357, в частности, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 354 и 357.

В одном воплощении обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат последовательность (XIII), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 354-357, в частности, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 354 и 357. В одном воплощении указанная последовательность (XIII) представляет собой SEQ ID NO: 354 в обеих указанных первой и второй мономерных единицах. В одном воплощении указанная последовательность (XIII) представляет собой SEQ ID NO: 357 в обеих указанных первой и второй мономерных единицах.

В одном воплощении по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц FcRn-связывающего димера может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из:

XV)

где [ВМ] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено выше, и

XVI) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 94% идентична последовательности, определенной в (XV).

В одном воплощении последовательность (XV) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 365-367. В одном воплощении последовательность (XV) представляет собой SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 366 или SEQ ID NO: 367.

В одном воплощении по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц FcRn-связывающего димера может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из:

XVII)

где [ВМ] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено выше, и

XVIII) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 94% идентична последовательности, определенной в (XVII).

В одном воплощении последовательность (XVII) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 360-364. В одном воплощении последовательность (XVII) представляет собой SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 361. SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 363 или SEQ ID NO: 364.

В одном воплощении по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц FcRn-связывающего димера может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из:

XIX)

где [ВМ] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено выше, и

XX) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 94% идентична последовательности, определенной в (XIX).

В одном воплощении последовательность (XIX) представляет собой SEQ ID NO: 359.

В одном воплощении по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц FcRn-связывающего димера может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из:

XXI)

где [ВМ] представляет собой FcRn-связывающий мотив, как определено выше, и

XXII) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 94% идентична последовательности, определенной в (XXI).

И вновь, полипептиды, имеющие незначительные изменения по сравнению с указанными выше аминокислотными последовательностями, которые не влияют в большой степени на их третичную структуру и функцию, также входят в объем данного изобретения. Так, в некоторых воплощениях FcRn-связывающий димер, как определено выше, может содержать последовательность (XIV), (XVI), (XVIII), (XX) или (XXII), которая по меньшей мере на 96%, например по меньшей мере на 98% идентична последовательности, определенной в (XIII), (XV), (XVII), (XIX) или (XXI), соответственно.

В одном воплощении FcRn-связывающего димера согласно первому аспекту по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит последовательность (XXI), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-353, такой как из группа, состоящая из SEQ ID NO: 17-352. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-15, SEQ ID NO: 17-140 и SEQ ID NO: 353, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 17-140. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-2 и SEQ ID NO: 17-140. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-2, SEQ ID NO: 17-92, SEQ ID NO: 94-103, SEQ ID NO: 105-125 и SEQ ID NO: 127-140, такой как группа, состоящая из SEQ NO: 17-92, SEQ ID NO: 94-103, SEQ ID NO: 105-125 и SEQ ID NO: 127-140. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19-20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75-77 и SEQ ID NO: 353, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 19-20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77. В другом воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77. В другом воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 75-77. В еще одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77. В еще одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75. В еще одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 75. В еще одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 77, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 75, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 75. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 44, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 41, группа, состоящая из SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 44, или группа, состоящая из SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 44. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44, такой как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой SEQ ID NO: 1 или представляет собой SEQ ID NO: 20, или представляет собой SEQ ID NO: 23, или представляет собой SEQ ID NO: 41, или представляет собой SEQ ID NO: 44.

В одном воплощении FcRn-связывающего димера согласно данному описанию обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат последовательность (XXI) или (XIII), выбранную из одной из групп, указанных выше. В одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 357, как группа, состоящая из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 357, как группа, состоящая из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44 или группа, состоящая из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 357.

В одном воплощении FcRn-связывающего димера, как определено здесь, обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат последовательность (XIII), (XV), (XVII), (XIX) или (XXI), выбранную из одной из групп, указанных выше.

В одном воплощении указанная группа состоит из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 23, SEQ ID: 41; SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 360-367, как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 23, SEQ ID: 41; SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 360-367, как группа, состоящая из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 366 и SEQ ID NO: 367, как группа, состоящая из SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 366 и SEQ ID NO: 367. В одном конкретном воплощении обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат последовательность (XXI), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75, как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75, как группа, состоящая из SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44. В одном конкретном воплощении обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат последовательность (XXI), соответствующую SEQ ID NO: 1. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой SEQ ID NO: 20. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой SEQ ID NO: 23. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой SEQ ID NO: 41. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой SEQ ID NO: 44. В одном воплощении указанная последовательность (XXI) представляет собой SEQ ID NO: 75.

В другом воплощении обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат последовательность (XIII), соответствующую SEQ ID NO: 354. В одном конкретном воплощении обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат последовательность (XIX), соответствующую SEQ ID NO: 360. В одном воплощении указанная последовательность (XIX) представляет собой SEQ ID NO: 361. В одном воплощении указанная последовательность (XIX) представляет собой SEQ ID NO: 362. В одном воплощении указанная последовательность (XIX) представляет собой SEQ ID NO: 363. В одном воплощении указанная последовательность (XIX) представляет собой SEQ ID NO: 364. В другом конкретном воплощении обе из указанных первой и второй мономерных единиц содержат последовательность (XV), соответствующую SEQ ID NO: 365. В одном воплощении указанная последовательность (XV) представляет собой SEQ ID NO: 366. В одном воплощении указанная последовательность (XV) представляет собой SEQ ID NO: 367.

В конкретном воплощении связывающего FcRn димера первая и вторая мономерные единицы содержат SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 357; или SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 357, соответственно. В одном воплощении первая и вторая мономерные единицы содержат SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 357; или SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 357, соответственно. В другом воплощении первая и вторая мономерные единицы содержат SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 354; или SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 357, соответственно. В еще одном воплощении первая и вторая мономерные единицы содержат SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 44; или SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 357, соответственно.

В конкретном воплощении FcRn-связывающего димера первая и вторая мономерные единицы содержат SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 365 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 365 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 365 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 366 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 366 и SEQ ID NO: 367; или SEQ ID NO: 367 и SEQ ID NO: 367, соответственно. В одном воплощении первая и вторая мономерные единицы содержат SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO.357; SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 365 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 365 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 365 и SEQ ID NO: 367; SEQ ID NO: 366 и SEQ ID NO: 366; SEQ ID NO: 366 и SEQ ID NO: 367; или SEQ ID NO: 367 и SEQ ID NO: 367, соответственно. В другом воплощении первая и вторая мономерные единицы содержат SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 354 и SEQ ID NO: 354; SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 365 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 366 и SEQ ID NO: 366; или SEQ ID NO: 367 и SEQ ID NO: 367, соответственно. В еще одном воплощении первая и вторая мономерные единицы содержат SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 357 и SEQ ID NO: 357; SEQ ID NO: 365 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 366 и SEQ ID NO: 366; или SEQ ID NO: 367 и SEQ ID NO: 367, соответственно.

В еще одном воплощении первая и вторая мономерные единицы содержат SEQ ID NO: 365 и SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 366 и SEQ ID NO: 366; или SEQ ID NO: 367 и SEQ ID NO: 367, соответственно.

В целях ясности, обозначение первой и второй мономерных единиц, которое используется во всем данном описании, сделано во избежание двусмысленного толкования, для их различения, без намерения указать фактический порядок мономерных единиц в полипептидной цепи FcRn-связывающего димера. Так, например, указанная первая мономерная единица может располагаться в направлении N-конца или C-конца полипептидной цепи относительно указанной второй мономерной единицы.

Как поймет специалист в данной области, в конструкции слитого белка между используемыми функциональными группировками зачастую применяют линкеры. Специалисту в области техники знакомы различные типы линкеров с разными свойствами, такие как гибкие аминокислотные линкеры, жесткие аминокислотные линкеры и расщепляемые аминокислотные линкеры. Линкеры применяли, например, для повышения стабильности или улучшения фолдинга слитых белков, для повышения экспрессии, улучшения биологической активности, обеспечения нацеливания и изменения фармакокинетики слитых белков.

Так, в одном воплощении первого аспекта предложен FcRn-связывающий димер, как определено здесь, в котором указанный линкер выбран из группы, состоящей из гибких аминокислотных линкеров, жестких аминокислотных линкеров и расщепляемых аминокислотных линкеров. В одном воплощении FcRn-связывающего димера согласно данному описанию указанный линкер расположен между первой мономерной единицей и второй мономерной единицей. Специалист в области техники поймет, что присутствие линкера, расположенного между первой мономерной единицей и второй мономерной единицей, не исключает присутствия дополнительных линкеров.

Гибкие линкеры часто используют в области техники, когда требуется определенная степень подвижности или взаимодействия между соединяемыми доменами, и они могут быть особенно полезны в некоторых воплощениях FcRn-связывающего димера. Такие линкеры обычно состоят из небольших неполярных (например, G) или полярных (например, S или Т) аминокислот. Некоторые гибкие линкеры преимущественно состоят из последовательности остатков G и S, например (GGGGS)p и (SSSSG)p. Подбор числа копий "р" позволяет оптимизировать линкер для достижения надлежащего разделения функциональных группировок или поддержания необходимого взаимодействия между группировками. Помимо G и S линкеров в области техники известны другие гибкие линкеры, такие как G и S линкеры, содержащие дополнительные аминокислотные остатки, такие как Т, А, K и Е, для поддержания гибкости, а также полярные аминокислотные остатки для улучшения растворимости.

Дополнительные неиограничивающие примеры линкеров включают и Специалисту известны другие подходящие линкеры.

В одном воплощении указанный линкер представляет собой гибкий линкер, содержащий остатки глицина (G), серина (S) и/или треонина (Т). В одном воплощении указанный линкер имеет общую формулу, выбранную из (GnSm)p и (SnGm)p, где, независимо, n равно от 1 до 7, m равно от 0 до 7, сумма n и m составляет не более 8 и р равно от 1 до 7. В одном воплощении n равно от 1 до 5. В одном воплощении m равно от 0 до 5. В одном воплощении р равно от 1 до 5. В более конкретном воплощении n равно 4, m равно 1 и р равно от 1 до 4. В одном воплощении указанный линкер выбран из группы, состоящей из S4G, (S4G)3 и (S4G)4. В одном воплощении указанный линкер выбран из группы, состоящей из GS, G4S и (G4S)3. В одном конкретном воплощении указанный линкер представляет собой G4S, а в другом воплощении указанный линкер представляет собой (G4S)3.

Термины «связывание FcRn» и «аффинность связывания с FcRn», используемые в данном описании, относятся к свойству полипептида, которое можно исследовать, например, используя методику поверхностного плазмонного резонанса (SPR) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Например, как описано в приведенных ниже примерах, аффинность связывания с FcRn можно исследовать в эксперименте, в котором FcRn или его фрагмент, имеющий правильную укладку, иммобилизован на сенсор-чипе прибора, а образец, содержащий исследуемый полипептид, пропускают над чипом. В альтернативном варианте исследуемый полипептид иммобилизован на сенсор-чипе прибора, а образец, содержащий FcRn или его фрагмент, имеющий правильную укладку, пропускают над чипом. Специалист в области техники может затем интерпретировать результаты, полученные в таких экспериментах, по меньшей мере для качественной оценки аффинности связывания полипептида с FcRn. Если необходимо количественное определение, например определение значения KD взаимодействия, также можно использовать методику поверхностного плазмонного резонанса. Показатели связывания можно, например, определять с помощью аппаратов Biacore (GE Healthcare) или ProteOn XPR 36 (Bio-Rad). FcRn удобно иммобилизовать на сенсор-чипе прибора, а образцы полипептидов, аффинность которых необходимо определить, готовят в виде серии разведений и вводят в случайном порядке. Затем по полученным результатам можно рассчитать значения KD, например, используя модель связывания 1:1 по Лангмюру в программе BIAevaluation 4.1 или другой подходящей программе, предоставляемой производителями оборудования.

В альтернативном варианте, как описано в приведенных ниже примерах, аффинность связывания FcRn можно исследовать в экспериментах, в которых образцы полипептида захватываются антителом, котрым покрыты планшеты для ELISA, и к ним добавляют биотинилированный FcRn с последующим внесением стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP). Добавляют субстрат тетраметилбензидин (ТМВ) и измеряют поглощение при 450 нм с помощью считывающего устройства для многолуночных планшетов, такого как Victor3 (Perkin Elmer). Специалист в области техники может интерпретировать результаты, полученные в таких экспериментах, по меньшей мере для качественной оценки аффинности связывания полипептида с FcRn. Если необходимо количественное определение, например определение значения KD взаимодействия (полумаксимальной эффективной концентрации), также можно использовать ELISA. Ответ полипептидов на серию разведений биотинилированного FcRn измеряют с помощью ELISA, как описано выше. Специалист в области техники затем может интерпретировать результаты, полученные в таких экспериментах и по полученным результатам рассчитать значения KD, например, используя программу GraphPad Prism 5 и нелинейную регрессию.

В альтернативном варианте аффинность к FcRn можно исследовать непосредственно по способности FcRn-связывающего полипептида блокировать связывание IgG с FcRn. Так, специалист в области техники поймет, что способность FcRn-связывающего полипептида блокировать указанное связывание коррелирует со способностью FcRn-связывающего полипептида связываться с FcRn, при условии, что FcRn-связывающий димер взаимодействует с FcRn в той же самой или по меньшей мере частично перекрывающейся области FcRn, что и IgG. Таким образом, чем выше способность полипептида связывать FcRn, тем лучше способность блокировать связывание IgG с FcRn.

Специалист в области техники также поймет, что взаимодействие FcRn-связывающего полипептида и FcRn можно оценить с помощью FACS-анализа (сортировки клеток, активированную флуоресценцией), когда полученное значение средней интенсивности флуоресценции (MFI) является непрямым показателем силы связывания исследуемого полипептида относительно других исследуемых полипептидов в том же эксперименте. Так, более высокое значение MFI коррелирует с более высокой относительной аффинностью, а более низкое значение MFI коррелирует с более низкой относительной аффинностью.

В данном описании термин «более высокая связывающая способность» применительно к аффинности связывания с FcRn или к связыванию FcRn следует интерпретировать в контексте любого из упомянутых выше анализов для прямой или опосредованной оценки аффинности.

Как определено здесь, FcRn-связывающий димер связывается с FcRn с более высокой связывающей способностью по сравнению с указанными первой или второй мономерной единицей в отдельности. В одном воплощении FcRn-связывающий димер может связываться с FcRn со связывающей способностью, которая по меньшей мере в 2 раза, например по меньшей мере в 3 раза, например по меньшей мере в 4 раза, например по меньшей мере в 5 раз, например по меньшей мере в 6 раз, например по меньшей мере в 7 раз, например по меньшей мере в 8 раз, например по меньшей мере в 9 раз, например по меньшей мере в 10 раз, например по меньшей мере в 25 раз, например по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз выше, чем у соответствующей первой мономерной единицы или второй мономерной единицы в отдельности. Данное соотношение может быть справедливо как при pH 6,0 и pH 7,4, так и только при pH 6,0 или только при pH 7,4.

В некоторых воплощениях, как объясняется ниже, FcRn-связывающий димер ингибирует связывание IgG с FcRn. В таких воплощениях указанный FcRn-связывающий димер может связываться с FcRn, так что способность FcRn-связывающего димера блокировать связывание IgG с FcRn по меньшей мере в 2 раза выше, например по меньшей мере в 3 раза выше, например по меньшей мере в 4 раза выше, например по меньшей мере в 5 раз выше, например по меньшей мере в 10 раз выше, например по меньшей мере в 15 раз выше, например по меньшей мере в 20 раз выше, например по меньшей мере в 25 раз выше по сравнению с блокирующей способностью соответствующей первой или второй мономерной единицы в отдельности.

В некоторых воплощениях указанный FcRn-связывающий димер может связываться с FcRn, так что значение MFI взаимодействия между FcRn и FcRn-связывающим димером по меньшей мере в 2 раза выше, например по меньшей мере в 3 раза выше, например по меньшей мере в 4 раза выше, например по меньшей мере в 5 раз выше, например по меньшей мере в 10 раз выше по сравнению со значением MFI взаимодействия между FcRn и соответствующей первой или второй мономерной единицей в отдельности.

В некоторых воплощениях указанный FcRn-связывающий димер может связываться с FcRn, так что значение KD взаимодействия между FcRn и FcRn-связывающим димером по меньшей мере в 2 раза ниже, например по меньшей мере в 3 раза ниже, например по меньшей мере в 4 раза ниже, например по меньшей мере в 5 раз ниже, например по меньшей мере в 10 раз ниже, например по меньшей мере в 25 раз ниже, например по меньшей мере в 50 раз ниже, например по меньшей мере в 100 раз ниже, например по меньшей мере в 1000 раз ниже по сравнению со значением KD взаимодействия между FcRn и соответствующей первой или второй мономерной единицей в отдельности.

В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, который способен связываться с FcRn при pH 6,0, так что значение KD взаимодействия составляет самое большее 1×10-7 М, например самое большее 1×10-8 М, например самое большее 1×10-9 М, например самое большее 1×10-10 М, например самое большее 1×10-11 М, например самое большее 1×10-12 М. FcRn-связывающий димер по данному воплощению будет связывать или оставаться связанным с FcRn при кислых значениях pH, таких как pH 6,0, например в эндосомах. Если такой полипептид окажется во все более и более кислой внутриклеточной среде, он вновь вернется на плазматическую мембрану благодаря своему взаимодействию с FcRn и, таким образом, избежит деградации.

В одном воплощении значение KD взаимодействия между FcRn-связывающим димером и FcRn при pH 7,4 превышает значение KD указанного взаимодействия при pH 6,0. Таким образом, FcRn-связывающий полипептид будет связываться с FcRn при pH 6,0 с более высокой аффинностью, чем при pH 7,4. В одном воплощении значение KD указанного взаимодействия при pH 7,4 по меньшей мере в 2 раза выше, например по меньшей мере в 5 раз выше, например по меньшей мере в 10 раз выше, например по меньшей мере в 25 раз выше, например по меньшей мере в 50 раз выше, например по меньшей мере в 100 раз выше, например по меньшей мере в 1000 раз выше, чем значение KD указанного взаимодействия при pH 6,0.

Как упоминалось выше, для анализа взаимодействия между FcRn-связывающим димером и FcRn можно использовать FACS-анализ. Так, можно оценивать взаимодействие между FcRn-связывающим димером и FcRn при pH 6,0 и pH 7,4 и сравнивать значение MFI при pH 6,0 и pH 7,4, как описано в экспериментальной части ниже. Полученное более высокое относительное значение MFI соответствует более высокой аффинности, а более низкое относительное значение MFI соответствует более низкой аффинности, при условии, что указанные значения MFI сравнивают в том же самом эксперименте. Так, в одном воплощении FcRn-связывающий димер связывается FcRn при pH 6,0 с более высокой аффинностью, чем при pH 7,4, например по меньшей мере на 10% выше, например по меньшей мере на 20% выше, например по меньшей мере на 35% выше, например по меньшей мере на 50% выше, например по меньшей мере на 100% выше.

В одном воплощении значение KD взаимодействия между FcRn-связывающим димером и FcRn при pH 7,4 составляет по меньшей мере 1×10-10 М, например по меньшей мере 1×10-9 М, например по меньшей мере 1×10-8 М, например по меньшей мере 1×10-7 М, например по меньшей мере 1×10-6 М, например по меньшей мере 1×10-5 М. В некоторых воплощениях единственным критерием взаимодействия между FcRn-связывающим димером и FcRn при pH 7,4 является то, что FcRn-связывающий димер, который связался с FcRn в более кислых условиях, быстрее отсоединяется от FcRn при повышении значения pH.

В альтернативном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, у которого KD указанного взаимодействия при pH 7,4 является таким же или более низким, чем KD указанного взаимодействия при pH 6,0. FcRn-связывающий димер согласно данному воплощению будет связываться или оставаться связанным с FcRn в услоыиях с кислым pH (т.е. будет иметь достаточно низкую скорость диссоциации при pH 6,0, что не позволит произойти высвобождению), например в эндосоме, а также в среде с нейтральным или слегка щелочным pH, например на плазматической мембране. В более конкретном воплощении значение KD указанного взаимодействия при pH 7,4 по меньшей мере в 2 раза ниже, например по меньшей мере в 5 раз ниже, например по меньшей мере в 10 раз ниже, например по меньшей мере в 50 раз ниже, например по меньшей мере в 100 раз ниже, чем значение KD указанного взаимодействия при pH 6,0.

В другом воплощении предложен FcRn-связывающий димер, который способен связываться с FcRn при pH 7,4, так что значение KD взаимодействия составляет самое большее 1×10-7 М, например самое большее 1×10-8 М, например самое большее 1×10-9 М, например самое большее 1×10-10 М, например самое большее 1×10-11 М, например самое большее 1×10-12 М. FcRn-связывающий димер согласно данному воплощению будет связываться или оставаться связанным с FcRn в течение более продолжительного времени при нейтральных или слегка щелочных значениях pH, таких как pH 7,4, например на плазматической мембране. Термин «оставаться связанным» обозначает взаимодействие, характеризуемое низкой скоростью диссоциации в заданных условиях.

В общем, специалисту в области техники известно, что значение KD взаимодействия определяют как отношение между скоростью диссоциации (koff) и скоростью ассоциации (kon). Так, высокое значение KD может быть следствием либо высокого koff, либо низкого kon, либо и того, и другого, и наоборот, низкое значение KD может быть следствием либо низкого koff, либо высокого kon, либо и того, и другого.

Специалист в области техники поймет, что можно осуществить различные модификации и/или добавления к FcRn-связывающему димеру согласно любому описанному здесь аспекту для оптимизации полипептида для конкретного практического применения, без отклонения от сущности данного изобретения.

Например, в одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, как описано здесь, в котором по меньшей мере одна из указанных первой и второй мономерных единиц содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на C-конце и/или N-конце. Такой полипептид следует рассматривать, как полипептид, который имеет один или более дополнительных аминокислотных остатков в самом первом и/или самом последнем положении в полипептидной цепи по меньшей мере одной из указанных первой и второй мономерных единиц. Так, по меньшей мере одна из указанных мономерных единиц FcRn-связывающего димера согласно данному описанию может содержать любое подходящее число дополнительных аминокислотных остатков, например по меньшей мере один дополнительный аминокислотный остаток. Каждый дополнительный аминокислотный остаток может быть добавлен отдельно или совместно, например для улучшения или упрощения получения, очистки, стабилизации in vivo или in vitro, присоединения или выявления полипептида. Такие дополнительные аминокислотные остатки могут содержать один или несколько аминокислотных остатков, добавленных для химического присоединения. Одним из таких примеров является добавление остатка цистеина. Такие дополнительные аминокислотные остатки могут также создавать «метку» для выделения или выявления полипептида, такие как His6-метка или «myc» (с-myc)-метка или «FLAGw-метка для взаимодействия с антителами, специфичными в отношении метки, или металл-аффинной хроматографии (IMAC) в случае гексагистидиновой метки.

Как обсуждено выше, дополнительные аминокислоты можно присоединять к FcRn-связывающему димеру или к любой из указанных первой и второй мономерных единиц или к обеим из них посредством химической конъюгации (с применением известных методов органической химии) или любым другим способом, таким как экспрессия FcRn-связывающего димера в виде слитого белка или присоединения любым другим образом, напрямую или через линкер, например аминокислотный линкер, как обсуждено выше.

Как обсуждено выше, дополнительные аминокислоты могут, например, содержать один или более доменов полипептида. Дополнительный полипептидный домен может придавать FcRn-связывающему димеру другую функцию, например такую как другая связывающая функция или ферментативная функция, или токсическая функция, или функция передачи флуоресцентного сигнала, или их комбинацию.

Так, во втором аспекте данного описания предложен слитый белок или конъюгат, содержащий первую группировку, состоящую из FcRn-связывающего димера согласно первому аспекту, и вторую группировку, состоящую из полипептида, обладающего желаемой биологической активностью. В другом воплощении указанный слитый белок или конъюгат может дополнительно содержать дополнительные группировки, имеющие желаемые биологические активности, которые могут быть такими же, как биологическая активность второй группировки, или отличаться от нее.

В одном воплощении указанного слитого белка или конъюгата общий размер молекулы меньше предельного размера для эффективного почечного клиренса при введении субъекту-млекопитающему.

В другом воплощении указанного слитого белка или конъюгата общий размер молекулы больше предельного размера для эффективного почечного клиренса при введении субъекту-млекопитающему.

В одном воплощении указанного слитого белка или конъюгата период полувыведения указанного слитого белка или конъюгата in vivo дольше, чем период полувыведения in vivo полипептида, обладающего желаемой биологической активностью, самого по себе.

Неограничивающие примеры желаемой биологической активности включают терапевтическую активность, связывающую активность и ферментативную активность.

В одном воплощении указанная желаемая биологическая активность представляет собой связывающую активность с выбранной мишенью.

Одним из примеров такой связывающей активности является связывающая активность, которая увеличивает период полувыведения слитого белка или конъюгата in vivo. Такой слитый белок или конъюгат может содержать по меньшей мере одну дополнительную группировку. В одном конкретном воплощении указанная мишень представляет собой альбумин, связывание с которым увеличивает период полувыведения указанного слитого белка или конъюгата in vivo. В одном воплощении указанная альбумин-связывающая активность обеспечивается альбумин-связывающим доменом (ABD) белка G стрептококка или его производным. Например, указанный слитый белок или конъюгат, содержащий по меньшей мере одну дополнительную группировку, может содержать [FcRn-связывающий димер] - [альбумин-связывающую группировку] - [группировку, обладающую аффинностью к выбранной мишени]. Кроме того, следует принимать во внимание, что указанный слитый белок или конъюгат может содержать альбумин-связывающую группировку или группировку, связывающую другую мишень, расположенную между двумя связывающими FcRn мономерными единицами, образующими FcRn-связывающий димер, как описано здесь, и, таким образом, в качестве неограничивающего примера, могут быть расположены следующим образом: [связывающая FcRn мономерная группировка] - [альбумин-связывающая группировка] - [связывающая FcRn мономерная группировка] - [группировка, обладающая аффинностью к выбранной мишени] или следующим образом: [связывающая FcRn мономерная группировка] - [группировка, обладающая аффинностью к выбранной мишени] - [связывающая FcRn мономерная группировка] - [альбумин-связывающая группировка]. Следует понимать, что группировки в составе слитого белка или конъюгата могут свободно располагаться в любом порядке от N-конца к C-концу полипептида. В одном воплощении указанный период полувыведения in vivo увеличен по меньшей мере в 10 раз, например по меньшей мере в 25 раз, например по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 75 раз, например по меньшей мере в 100 раз по сравнению с периодом полувыведения in vivo слитого белка или конъюгата самого по себе.

В одном воплощении, когда комплекс между мишенью и слитым белком или конъюгатом согласно данному описанию образуется (или сохраняется) при кислых значениях pH, таких как pH 6,0, мишень избегает элиминации, происходящей посредством деградации в лизосомах. Таким образом, период полувыведения мишени увеличивается. Увеличение периода полувыведения предполагает, что скорость элиминации мишени ниже при взаимодействии с указанным слитым белком или конъюгатом, чем скорость элиминации молекулы-мишени в отсутствие указанного слитого белка или конъюгата. Кроме того, в данном воплощении желательно, чтобы связывание мишени со слитым белком или конъюгатом не мешало существенным образом функции мишени.

С другой стороны, когда при кислых значениях pH комплекс между мишенью и слитым белком или конъюгатом согласно данному описанию не сохраняется или не образуется, мишень поступает во внутриклеточные лизосомы, где подвергается деградации.

В одном воплощении предложен слитый белок или конъюгат, где скорость элиминации выбранной нежелательной мишени у субъекта повышена. Усиленная элиминация нежелательной мишени означает повышенную скорость элиминации мишени из тела многоклеточного организма по сравнению с «нормальной» скоростью элиминации молекулы-мишени самой по себе, то есть без предварительного взаимодействия со слитым белком или конъюгатом.

В другом воплощении связывание выбранной нежелательной мишени может инактивировать функцию мишени, таким образом блокируя ее биологическую активность в ситуациях, когда это желательно. Такая биологическая активность может, например, представлять собой активацию или блокирование рецепторов или ферментативную или, в ином случае, токсическую или нежелательную активность. Такой нежелательной мишенью может быть эндогенный гормон, фермент, цитокин, хемокин или мишень, имеющая некоторую другую биологическую активность. Посредством инактивирующего связывания мишени биологическая активность блокируется до тех пор, пока мишень не поступит на деградацию и не высвободится при низком значении pH, а связывающий мишень слитый белок не вернется в циркуляцию. Такая рециркуляция слитого белка, связывающего мишень (посредством его FcRn-связывающей группировки), позволяет «катализировать» удаление более чем одной молекулы выбранной нежелательной мишени.

Нежелательными мишенями могут, например, быть чужеродные белки и соединения или естественным образом экспрессируемые белки, уровень которых в плазме повышается при медицинских состояниях, когда терапевтический эффект может быть достигнут посредством элиминации указанного белка. Нежелательная мишень не обязательно равномерно распределена в плазме, но может концентрироваться в определенных участках, например вокруг опухоли или в местах воспаления.

Неограничивающие примеры мишеней выбраны из группы, состоящей из аллергенов, амилоидов, антител, аутоантигенов, факторов свертывания крови, гормонов, опухолевых клеток, молекул лекарств, цитокинов, хемокинов, протеаз, медиаторов гиперчувствительности, провоспалительных факторов, токсинов, таких как бактериальные токсины и яды змей, загрязнителей, металлов и антиоксидантов.

При определенных условиях, например при некоторых видах раковых заболеваний, желательно удалять эндогенные молекулы, например VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), PDGF (фактор роста тромбоцитов), HGF (фактор роста гепатоцитов) и другие стимулирующие рост гормоны. Такие молекулы могут также служить мишенями для функции связывания указанного слитого белка или конъюгата.

При других условиях, например при некоторых иммунологических заболеваниях, может быть желательным транзиторное удаление эндогенных молекул, таких как определенные интерлейкины или TNF (фактор некроза опухолей). Такие молекулы могут также служить мишенями для функции связывания указанного слитого белка или конъюгата.

В одном воплощении вторая группировка, обладающая желаемой биологической активностью, представляет собой терапевтически активный полипептид. Неограничивающими примерами терапевтически активных полипептидов являются биомолекулы, такие как молекулы, выбранные из группы, состоящей из ферментов, например альгазидазы α и β, глюкоцереброзидазы, ларонидазы, арилсульфатазы, аглюкозидазы-α, аспарагиназы, фактора VII, фактора VIII, фактора IX и фактора Ха; гормонов и факторов роста, например гормона роста, трансформирующего фактора роста-β2, эритропоэтина, инсулина, инсулин-подобного фактора роста-1, миостатина, фактора роста костной ткани и глюкагон-подобного пептида-1; хемокинов, например CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL27, XCL1 и CXC3CL1; и цитокинов, например интерлейкина (IL)-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-22, IL-27, интерферона (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, фактора некроза опухоли (TNF), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), макрофагального CSF и гранулоцитарно/макрофагального CSF.

Специалисту в области техники понятно, что FcRn-связывающий димер согласно первому аспекту может быть полезен в слитом белке или в качестве партнера по конъюгации с любой другой группировкой. Таким образом, приведенный выше перечень терапевтически активных полипептидов не следует рассматривать как ограничивающий каким-либо образом.

Изобретение также предусматривает другие возможности создания слитых белков или конъюгатов. Так, FcRn-связывающий димер согласно первому аспекту изобретения может быть ковалентно связан со второй или дополнительной группировкой или группировками, которые проявляют другие функции дополнительно к связыванию с мишенью или вместо связывания с мишенью. Одним примером является слияние одного или более FcRn-связывающих димеров и ферментативно активных полипептидов, служащих рецептором или эффекторной группировкой.

Применительно к приведенному выше описанию слитых белков или конъюгатов, включающих FcRn-связывающий димер согласно изобретению, следует отметить, что обозначение первой, второй и последующих группировок употребляется в целях ясности для различения между FcRn-связывающим димером согласно изобретению с одной стороны, и группировками, проявляющими другие функции, с другой стороны. Данные обозначения не относятся к фактическому порядку различных доменов в полипептидной цепи слитого белка или конъюгата. Так, например, указанная первая группировка может без ограничений располагаться на N-конце, в середине или на C-конце слитого белка или конъюгата. Более того, FcRn-связывающий димер согласно данному описанию может содержать вторую группировку, расположенную между двумя связывающими FcRn мономерными единицами FcRn-связывающего димера.

Концентрация полумаксимального ингибирования (IC50) является показателем эффективности вещества при ингибировании конкретной количественно характеризуемой биологической или биохимической функции. Данный количественный показатель указывает, сколько конкретного вещества необходимо для ингибирования определенной биологической функции на 50%, и является общеупотребительным в области техники. В одном конкретном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, слитый белок или конъюгат, как определено здесь, способный блокировать связывание IgG с FcRn, так что концентрация полумаксимального ингибирования (IC50) блокирования составляет самое большее 1×10-8 М, например самое большее 6×10-9 М, например самое большее 4×10-9 М, например самое большее 1×10-9 М, например самое большее 1×10-10 М, например самое большее 1×10-11 М. В одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, слитый белок или конъюгат, как определено здесь, способный блокировать связывание IgG с FcRn, так что концентрация полумаксимального ингибирования (IC50) блокирования по меньшей мере в 10 раз меньше, например по меньшей мере в 100 раз меньше, например по меньшей мере в 1000 раз меньше по сравнению с IC50 блокирования соответствующей первой или второй мономерной единицей в отдельности.

Ингибирование может происходить вследствие связывания FcRn-связывающего димера, слитого белка или конъюгата с той же или по меньшей мере частично перекрывающейся областью FcRn, что и в случае IgG. В альтернативном варианте FcRn-связывающий димер, слитый белок или конъюгат могут связываться с другой областью FcRn, чем IgG, но создавать пространственное препятствие связыванию IgG с FcRn. Так, скорость элиминации или клиренса IgG из системы циркуляции будет повышаться вследствие усиленной деградации IgG в лизосомах, поскольку опосредованная FcRn рециркуляция IgG будет полностью или частично недоступна, поскольку сайты связывания FcRn будут заняты FcRn-связывающим димером согласно данному изобретению. Другими словами, введение FcRn-связывающего димера, слитого белка или конъюгата согласно данному изобретению будет усиливать катаболизм циркулирующих IgG-антител.

В одном воплощении значение KD взаимодействия между FcRn-связывающим димером, слитым белком или конъюгатом и FcRn ниже, чем значение KD указанного взаимодействия между IgG и FcRn. Данное соотношение может быть справедливо при pH 6,0 и pH 7,4, или только при pH 6,0.

Вышеупомянутые аспекты также охватывают полипептиды, в которых FcRn-связывающий димер согласно первому аспекту или FcRn-связывающий димер, содержащийся в слитом белке или конъюгате согласно второму аспекту, дополнительно содержит метку, такую как метка, выбранная из группы, состоящей из флуоресцентных красителей и металлов, хромофорных красителей, хемилюминесцентных соединений и биолюминесцентных белков, ферментов, радионуклидов и радиоактивных частиц. Такие метки, например, можно применять для выявления полипептида.

В других воплощениях меченый FcRn-связывающий димер присутствует в виде группировки в составе слитого белка или конъюгата, также содержащего вторую группировку, обладающую желаемой биологической активностью и/или функцией связывания, как описано выше. В некоторых случаях метка может быть присоединена только к FcRn-связывающему димеру (например, к одной, двум или к обеим из указанных первой и второй мономерных единиц), а в некоторых случаях и к FcRn-связывающему димеру, и ко второй группировке конъюгата или слитого белка. Кроме того, возможно, что метка присоединена только ко второй группировке, но не к связывающей FcRn группировке. Так, в еще одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, содержащий вторую группировку, где указанная метка присоединена только ко второй группировке.

Когда упоминается меченый полипептид, это следует понимать как ссылку на все аспекты FcRn-связывающего димера согласно данному описанию, включая слитые белки и конъюгаты, содержащие FcRn-связывающий димер и вторую и возможные дополнительные группировки. Так, меченый полипептид может содержать только FcRn-связывающий димер и, например, терапевтический радионуклид, который может быть хелатирован или ковалентно связан с FcRn-связывающим димером, или содержать FcRn-связывающий димер, терапевтический радионуклид и вторую группировку, такую как малая молекула, обладающая желаемой биологической активностью, например обеспечивающая терапевтическую эффективность.

В воплощениях, где FcRn-связывающий димер, слитый белок или конъюгат являются радиоактивно меченными, такой радиоактивно меченный полипептид может содержать радионуклид. Большинство радионуклидов являются металлами по природе, используются в ионизированной форме и обычно не способны образовывать стабильные ковалентные связи с элементами, присутствующими в белках и пептидах. По этой причине мечение белков и пептидов радиоактивными металлами осуществляют с использованием хелаторов, то есть многозубчатых лигандов, которые образуют с ионами металлов нековалентные соединения, называемые хелатами. В воплощении FcRn-связывающего димера, слитого белка или конъюгата встраивание радионуклида возможно благодаря обеспечению хелатирующей среды, посредством которой радионуклид может координироваться, подвергаться хелатированию или образовывать комплекс с полипептидом.

Одним из примеров хелатора является хелатор полиаминополикарбоксилатного типа. Можно выделить два класса таких полиаминополикарбоксилатных хелаторов: макроциклические и ациклические хелаторы.

В одном воплощении FcRn-связывающий димер, слитый белок или конъюгат содержит хелатирующую среду, обеспечиваемую полиаминополикарбоксилатным хелатором, присоединенным к FcRn-связывающему димеру через тиоловую группу остатка цистеина или эпсилон-аминогруппу остатка лизина. В альтернативном варианте полиаминополикарбоксилатный хелатор может быть присоединен к любой части слитого белка или конъюгата согласно данному описанию, например ко второй или последующей группировке указанного слитого белка или конъюгата.

Наиболее часто используемыми макроциклическими хелаторами для радиоизотопов индия, галлия, иттрия, висмута, радиоактивных актиноидов и радиоактивных лантаноидов являются различные производные DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты). В одном воплощении хелатирующая среда FcRn-связывающего димера, слитого белка или конъюгата обеспечивается DOTA или его производным. Более конкретно, в одном воплощении хелатирующие полипептиды, охватываемые данным изобретением, получают при помощи реакции производного DOTA, 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-трис-уксусной кислоты-10-малеимидоэтилацетамида (малеимидомоноамида-DOTA) с указанным полипептидом.

Кроме того, в качестве хелаторов также можно использовать 1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусную кислоту (NOTA) и ее производные. Так, в одном воплощении предложен FcRn-связывающий димер, слитый белок или конъюгат, где полиаминополикарбоксилатный хелатор представляет собой 1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусную кислоту или ее производное.

Наиболее часто используемыми ациклическими полиаминополикарбоксилатными хелаторами являются различные производные DTPA (диэтилентриамин-пентауксусной кислоты). Так, полипептиды, имеющие хелатирующую среду, обеспечиваемую диэтилентриамин-пентауксусной кислотой или ее производными, также входят в объем данного изобретения.

В дополнительном воплощении FcRn-связывающий димер, полученный рекомбинантно посредством экспрессии полинуклеотида или синтетически, конъюгирован с одним или более синтетическими полимерами, например, для увеличения его гидродинамического радиуса. Для этого часто используют полиэтиленгликоль (PEG, ПЭГ), но в области техники также применяли и другие полимеры. Такое «ПЭГилирование» можно применять для увеличения размера FcRn-связывающего димера, слитого белка или конъюгата согласно данному описанию до размера, превышающего пороговый для эффективной почечной экскреции.

В одном воплощении синтетический полимер конъюгирован с одним или более синтезированными химическим путем FcRn-связывающими димерами. С тем же самым синтетическим полимером могут быть конъюгированы и другие функциональные группы. Если FcRn-связывающий димер и другие компоненты синтезированы химическим путем, нет необходимости получать какой-либо из компонентов в биологической системе, если это не желательно.

В предпочтительном воплощении один или более полученных синтетическим или биологическим способом FcRn-связывающих димеров конъюгированы с синтетическим полимером для достижения размера, превышающего размер, ассоциированный с эффективным почечным клиренсом, и используются для блокирования связывания IgG с FcRn. Для сайт-специфического конъюгирования можно использовать единственный цистеин в мономерной единице FcRn-связывающего димера, например расположенный на C-конце цистеин, встроенный для этой цели. В случае разветвленного синтетического полимера, для повышения авидности и, следовательно, блокирующей способности с одним и тем же полимером могут быть конъюгированы более двух связывающих FcRn группировок.

В третьем аспекте данного изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий FcRn-связывающий димер или слитый белок согласно данному описанию. Данное изобретение также охватывает способ получения FcRn-связывающего димера или слитого белка, как описано выше, включающий экспрессию полинуклеотида; вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, и клетку-хозяина, содержащую вектор экспрессии.

Изобретение также охватывает способ получения FcRn-связывающего димера или слитого белка, включающий культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, позволяющих указанному полипептиду экспрессироваться с вектора экспрессии, и выделение полипептида.

В альтернативном варианте FcRn-связывающий димер или слитый белок согласно данному изобретению можно получать при помощи небиологического пептидного синтеза с использованием аминокислот и/или производных аминокислот, имеющих защищенные реакционноспособные боковые цепи, причем небиологический пептидный синтез включает

- пошаговое присоединение аминокислот и/или производных аминокислот для образования FcRn-связывающего димера или слитого белка, имеющего защищенные реакционноспособные боковые цепи,

- удаления защитных групп с реакционноспособных боковых цепей FcRn-связывающего димера или слитого белка и

- фолдинг FcRn-связывающего димера или слитого белка в водном растворе.

В четвертом аспекте изобретения предложена композиция, содержащая FcRn-связывающий димер, слитый белок или конъюгат согласно данному описанию и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент или носитель. В одном воплощении указанная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный активный агент, например по меньшей мере два дополнительных активных агента, например по меньшей мере три дополнительных активных агента. Неограничивающими примерами дополнительных активных агентов, которые могут оказаться полезными в такой комбинации, являются иммуносупрессорные агенты, противовоспалительные агенты, антимикробные агенты и ферменты.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция выполнена с возможностью введения способом, выбранным из группы, состоящей из перорального введения, интраназального введения, легочного введения, вагинального введения, ректального введения, внутривенной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутримышечной инъекции, подкожной инъекции и внутрикожной инъекции.

В данном описании термин «системное введение» относится к способу введения, при котором представляющее интерес вещество попадает в систему кровообращения, так что воздействие оказывается на весь организм. Специалисту в области техники известно, что системное введение можно осуществлять посредством энтерального введения (абсорбции лекарственного средства в желудочно-кишечном тракте) или парентерального введения (обычно инъекции, инфузии или имплантации).

В одном воплощении указанная композиция выполнена с возможностью системного или местного введения. В некоторых воплощениях можно применять системное введение указанной композиции. В другом воплощении указанная композиция выполнена с возможностью местного введения. Например, местное введение может быть поверхностным, в виде мази, пасты, пены или крема. В другом воплощении указанная композиция выполнена с возможностью введения через слой эндотелия или эпителия. В этом случае может осуществляться трансцитоз композиции через указанный слой.

В одном воплощении скорость поглощения композиции, содержащей слитый белок или конъюгат согласно данному описанию, выше, чем скорость поглощения полипептидов, соответствующих второй или последующим группировкам, самих по себе. В одном воплощении скорость поглощения по меньшей мере в 2 раза выше, например по меньшей мере в 5 раз выше, например по меньшей мере в 10 раз выше, например по меньшей мере в 25 раз выше, чем скорость поглощения второй или последующих группировок самих по себе.

С учетом приведенного выше описания следует понимать, что FcRn-связывающий димер, слитый белок или конъюгат или композиция согласно данному описанию могут, например, быть полезными в качестве терапевтического агента и/или в качестве средства увеличения периода полувыведения in vivo партнера по слиянию и/или в качестве средства увеличения скорости элиминации нежелательных мишеней.

Так, в пятом аспекте данного изобретения предложен FcRn-связывающий димер, слитый белок, конъюгат или композиция согласно данному описанию для применения в качестве лекарственного средства.

В связанном с ним шестом аспекте данного изобретения предложен способ лечения или профилактики субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадию введения терапевтически или профилактически активного количества FcRn-связывающего димера, слитого белка, конъюгата или композиции согласно данному описанию.

В одном воплощении любого их этих двух последних аспектов лекарственное средство или способ предназначены для снижения уровня IgG у субъекта, нуждающегося в этом.

В одном воплощении любого из указанных двух последних аспектов лекарственное средство или способ предназначены для лечения или профилактики, в которых используют способность FcRn-связывающего димера по меньшей мере частично блокировать связывание IgG с FcRn, например для лечения или профилактики, при которых желателен усиленный катаболизм IgG антител.

В другом воплощении, когда используют блокирующую IgG способность, введение FcRn-связывающих димеров согласно данному описанию повышает эффективность лекарственного средства путем блокирования антител, проявляющих свойства, направленные против лекарственного средства. В частности, таким способом можно улучшить действие лекарственных средств, подвергающихся клиренсу антителами, или против которых вырабатываются нейтрализующие антитела, путем введения FcRn-связывающих димеров перед введением лекарственного средства, представляющего интерес.

В другом воплощении, когда используют блокирующую IgG способность, введение FcRn-связывающих димеров согласно данному описанию снижает неблагоприятное воздействие антител путем их удаления или уменьшения времени их циркуляции в кровотоке субъекта. Например, радиоактивно меченные или конъюгированные с токсином антитела можно удалять путем последующего введения FcRn-связывающих димеров согласно данному описанию. В альтернативном варианте, в случаях, когда нежелательные токсические эффекты возникают как реакция на лекарственное средство, представляющее собой используемое в терапевтических целях антитело, такой нежелательный эффект может быть ослаблен или нейтрализован путем последующего введения FcRn-связывающего димера для удаления таких антител или ограничения времени их циркуляции.

В одном воплощении условием, при котором может быть показано такое лечение или профилактика, является аутоиммунное состояние. В качестве неограничивающих примеров указанных состояний следует упомянуть острый диссеминированный энцефаломиелит (ADEM), острый некрозирующий геморрагический лейкоэнцефалит, болезнь Аддисона, агаммаглобулинемию, гнездную алопецию, амилоидоз, ANCA (антитела к цитоплазме нейтрофилов)-ассоциированный васкулит, анкилозирующий спондилит, нефрит, вызываемый анти-GBM (клубочковая базальная мембрана) / анти-ТВМ (базальная мембрана канальцев) антителами, антифосфолипидный синдром (APS), аутоиммунный ангионевротический отек, аутоиммунную апластическую анемию, аутоиммунную дизавтономию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунную гиперлипидемию, аутоиммунный иммунодефицит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха (AIED), аутоиммунный энцефалит с поражением лимбической системы, аутоиммунный миокардит, аутоиммунный панкреатит, аутоиммунную ретинопатию, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру (АТР), аутоиммунное заболевание щитовидной железы, аутоиммунные невропатии, связанные с крапивницей, аксональные и анальные, болезнь Бало, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, болезнь Кастлемана, целиакию, болезнь Шагаса, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию (CIDP), хронический рецидивирующий мультифокальный остеомиелит (CRMO), синдром Черга-Штраусса, рубцующийся пемфигоид/доброкачественный пемфигоид слизистой, болезнь Крона, синдром Когана, болезнь холодовых агглютининов, врожденную блокаду сердца, миокардит Коксаки, болезнь CREST (кальциноз, синдром Рейно, нарушение моторики пищевода, склеродактилия и телеангиэктазия), эссенциальную смешанную криоглобулинемию, демиелинизирующие невропатии, герпетиформный дерматит, дерматомиозит, болезнь Девика (нейромиелит зрительного нерва), дилатационную кардиомиопатию, дискоидную волчанку, синдром Дресслера, эндометриоз, эозинофильный ангиоцентрический фиброз, эозинофильный фасцит, приобретенный буллезный эпидермолиз, нодозную эритему, экспериментальный аллергический энцефаломиелит, синдром Эванса, фиброзирующий альвеолит, гигантоклеточный артериит (височный артериит), гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, гранулематоз с полиангиитом (GPA; Вегенера), болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, энцефалит Хашимото, тиреоидит Хашимото, гемолитическую анемию, пурпуру Геноха-Шенлейна, гестационный герпес, гипогаммаглобулинемию, идиопатический тубулоинтерстициальный нефрит с гипокомплементемией, идиопатическую мембранозную нефропатию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), IgA-нефропатию, IgG4-связанное заболевание, IgG4-связанное склерозирующее заболевание, иммунорегуляторные липопротеины, воспалительную аневризму аорты, воспалительную псевдоопухоль, миозит с тельцами включений, инсулинозависимый диабет (1 типа), интерстициальный цистит, ювенильный артрит, ювенильный диабет, синдром Кавасаки, опухоль Кюттнера, синдром Ламберта-Итона, лейкоцитокластический васкулит, плоский лишай, склеротический лишай, деревянистый конъюнктивит, болезнь линейных цепей IgA (LAD), болезнь Лайма, хронический фиброз средостения, болезнь Меньера, микроскопический полиангиит, синдром Микулича, смешанную болезнь соединительных тканей (MCTD), язву Мурена, синдром Морвана, болезнь Мухи-Хабермана, пемфигоид слизистых оболочек, многоочаговый фибросклероз, рассеянный склероз, тяжелую миастению, миозит, нарколепсию, нейромиелит зрительного нерва (Девика), нейромиотонию (синдром Исаакса), нейтропению, рубцующийся пемфигоид зрачка, нейрит зрительного нерва, болезнь Ормонда (ретроперитонеальный фиброз), палиндромный ревматизм, PANDAS (детские аутоиммунные нейропсихиатрические расстройства, ассоциированные со стрептококковой инфекцией), паранеопластическую дегенерацию мозжечка, парапротеинемические полинейропатии, пароксизмальную ночную гемоглобинурию (PNH), синдром Парри-Ромберга, синдром Персонейджа-Тернера, pars planitis (периферический увеит), гестационный пемфигоид, обыкновенную пузырчатку, периаортит, периартериит, периферическую нейропатию, околовенозный энцефаломиелит, пернициозную анемию, синдром POEMS (полинейропатия, органомегалия, моноклональная гаммапатия, кожные изменения), нодозный полиартериит, полиартрит, аутоиммунные полигландулярные синдромы типа I, II и III, ревматическая полимиалгия, полимиозит, постинфарктный синдром, постперикардиотомный синдром, дерматит, вызываемый прогестероном, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, псориаз, псориатический артрит, идиопатический фиброз легких, гангренозную пиодермию, истинную эритроцитарную аплазию, болезнь Рейно, рефлекторную симпатическую дистрофию, синдром Рейтера, рецидивирующий полихондрит, синдром «беспокойных ног», ретроперитонеальный фиброз (болезнь Ормонда), ревматическую лихорадку, ревматоидный артрит, тиреоидит Риделя, саркоидоз, синдром Шмидта, склерит, склеродермию, синдром Шегрена, аутоиммунную реакцию, направленную на антигены спермы и яичек, синдром мышечной скованности, подострый бактериальный эндокардит (SBE), синдром Сусака, симпатическую офтальмию, артериит Такаясу, системную красную волчанку (SLE), височный артериит/гигантоклеточный артериит, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТРР), синдром Толосы-Ханта, поперечный миелит, язвенный колит, недифференцированное заболевание соединительной ткани (UCTD), увеит, васкулит, везикулобуллезный дерматоз, витилиго, макроглобулинемию Вальденстрема и тепловую идиопатическую гемолитическую анемию.

В другом воплощении пятого и шестого аспектов состоянием, при котором может быть показано такое лечение или профилактика, является аллоиммунное состояние. В качестве неограничивающих примеров указанных состояний следует отметить несовпадение донора при трансплантации, обусловленное антителами против HLA; аллоиммунную тромбоцитопению плода и новорожденного FNAIT (или неонатальную аллоиммунную тромбоцитопению NAITP или NAIT или NAT, или аллоиммунную тромбоцитопению вследствие антигенной несовместимости плода и матери, FMAITP или FMAIT).

В другом воплощении пятого и шестого аспектов состояние, при котором может быть показано такое лечение или профилактика, выбрано из группы, состоящей из аутоиммунных полиэндокринных синдромов 1 типа (APECED, или синдрома Уитакера) и 2 типа (синдрома Шмидта), генерализованной алопеции, миастенического криза, тиреотоксического криза, заболеваний глаз, ассоциированных с тиреоидной патологией, тиреоидной офтальмопатии, аутоиммунного диабета, энцефалита и/или энцефалопатии, ассоциированных с аутоантителами, листовидной пузырчатки, буллезного эпидермолиза, герпетиформного дерматита, хореи Сиденгама, острой моторной аксональной нейропатии (AMAN), синдрома Миллера-Фишера, мультифокальной моторной нейропатии (MMN); опсоклонуса; воспалительной миопатии; синдрома Исаакса (аутоиммунной нейромиотонии), паранеопластических синдромов и энцефалита с поражением лимбической системы.

В другом воплощении пятого и шестого аспектов состояние, при котором может быть показано такое лечение или профилактика, выбрано из эпилепсии и судорог.

В другом воплощении предложен FcRn-связывающий димер, слитый белок, конъюгат или композиция согласно данному описанию для применения в блокировании или удалении нежелательной мишени из циркуляции. В одном воплощении указанная нежелательная мишень выбрана из группы, включающей аллергены, амилоиды, антитела, аутоантигены, факторы свертывания крови, гормоны, опухолевые клетки, молекулы лекарственных средств, цитокины, хемокины, медиаторы гиперчувствительности, провоспалительные факторы, токсины, такие как бактериальные токсины и яды змей, загрязнители, металлы и антиоксиданты.

Несмотря на то, что изобретение описано с указанием различных приведенных в качестве примера аспектов и воплощений, специалисты в области техники поймут, что можно осуществлять различные изменения и заменять эквиваленты их элементами, при этом оставаясь в рамках изобретения. Кроме того, можно осуществлять множество модификаций для адаптации конкретной ситуации или молекулы к идеям изобретения, при этом оставаясь в рамках изобретения. Таким образом, изобретение не ограничивается каким-либо конкретным рассмотренным воплощением, но охватывает все воплощения, находящиеся в рамках приложенной формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 представлен перечень аминокислотных последовательностей примеров связывающих FcRn полипептидов в мономерой форме (SEQ ID NO: 1-367) и связывающих FcRn полипептидов в димерной форме (SEQ ID NO: 368-376), а также аминокислотные последовательности варианта альбумин-связывающего полипептида РР013 (SEQ ID NO: 377), связывающего Taq полимеразу Z варианта Z03638 (SEQ ID NO: 378), αFcRn человека (SEQ ID NO: 379), αFcRn мыши (SEQ ID NO: 384), β2-микроглобулина человека (SEQ ID NO: 380), β2-микроглобулина мыши (SEQ ID NO: 381), αFcRn человека (SEQ ID NO: 382), когда он представлен человеческим FcRn-eGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок), и αFcRn мыши (SEQ ID NO: 383), когда он представлен мышиным FcRn-eGFP. Предсказанные FcRn-связывающие мотивы (ВМ) FcRn-связывающих полипептидов согласно данному описанию располагаются между остатком 8 и остатком 36 в последовательностях SEQ ID NO: 1-367. Аминокислотные последовательности полипептидов длиной 49 аминокислотных остатков (BMod), которые, как предсказано, составляют полный трехспиральный пучок в составе каждого из этих Z вариантов, располагаются между остатком 7 и остатком 55.

На Фиг. 2А-2Д показано связывание с FcRn человека при pH 6,0 и диссоциация при pH 6,0 и 7,4 для Z вариантов, несущих His6-метку, и для IgG, как описано в Примере 3. Наложенные сенсограммы, полученные с использованием прибора Biacore, демонстрирующие инъекцию при pH 6,0 с последующей диссоциацией при pH 6,0 (сплошная линия) и инъекции при pH 6,0 с последующей диссоциацией при pH 7,4 (пунктирная линия), приведены для: (A) Z07918 (SEQ ID NO: 1), (Б) Z07960 (SEQ ID NO: 4), (В) Z10109 (SEQ ID NO: 3), (Г) Z10193 (SEQ ID NO: 2) и (Д) IgG.

На Фиг. 3 показаны точечные диаграммы, полученные при анализе связывания FcRn-связывающего Z варианта с клетками HeLa, экспрессирующими человеческий (верхняя панель) и мышиный (нижняя панель) FcRn-eGFP, методом проточной цитометрии, как описано в Примере 4. Из-за гетерогенной экспрессии FcRn-eGFP у клеток HeLa гейты для клеток строили по уровню экспрессии FcRn-eGFP. Клетки в гейте Н считали FcRn-eGFP-отрицательными, а клетки в гейте I считали положительными. Инкубация с Z вариантами, меченными Alexa Fluor® 647, приводила к популяциям, положительным как по Alexa Fluor® 647, так и по eGFP, в то время как инкубация с буфером (контроль-буфер) не приводила. На Фиг. 3 показано, что все три варианта Z07960 (SEQ ID NO: 4), Z07930 (SEQ ID NO: 6) и Z07918 (SEQ ID NO: 1) связываются с FcRn человека и FcRn мыши. На оси у показана интенсивность Alexa Fluor® 647, а на оси х показана активность eGFP.

На Фиг. 4 показаны значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) Z07960 (SEQ ID NO: 4), Z07930 (SEQ ID NO: 6) и Z07918 (SEQ ID NO: 1), меченных Alexa Fluor® 647, которую измеряли в исследовании связывания клеток, как описано в Примере 4. На диаграмме (А) показана MFI клеток HeLa, трансдуцированных человеческим FcRn-eGFP, а на диаграмме (Б) показана MFI клеток HeLa, трансдуцированных мышиным FcRn-eGFP.

На Фиг. 5 показаны точечные диаграммы, полученные при анализе связывания меченных Alexa Fluor® 647 мышиных или человеческих IgG с клетками HeLa, экспрессирующими человеческий (верхняя панель) и мышиный (нижняя панель) FcRn-eGFP, методом проточной цитометрии, как описано в Примере 5. Из-за гетерогенной экспрессии FcRn-eGFP в клетках HeLa гейты для клеток строили по количеству FcRn-eGFP на клеточной поверхности. Клетки в гейте М считали FcRn-eGFP-отрицательными, а клетки в гейте N считали положительными. Связывание 100 нМ меченных Alexa Fluor® 647 человеческих или мышиных IgG с клетками HeLa, трансдуцированными FcRn, показано на левой панели (0 нМ). На Фиг. показано, что связывание IgG блокировалось Z07918, несущим His6-метку (SEQ ID NO: 1), дозозависимым образом (1, 10, 100 и 1000 нМ). На оси у показана интенсивность Alexa Fluor® 647, а на оси х показана активность eGFP.

На Фиг. 6 показаны значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) при связывании FcRn с IgG, меченными Alexa Fluor® 647, в присутствии различных концентраций Z07918 с His6-меткой (SEQ ID NO: 1) на: (А) клетках HeLa, трансдуцированных человеческим FcRn-eGFP, и (Б) клетках HeLa, трансдуцированных мышиным FcRn-eGFP, как описано в Примере 5. На Фиг. 6 показано дозозависимое блокирование связывания IgG-FcRn под воздействием Z варианта.

На Фиг. 7А-7 В показана кинетика связывания трех Z вариантов с FcRn человека при pH 6,0, как описано в Примере 6, с использованием прибора Biacore. Приведены сенсограммы для серии концентраций (A) Z11948 (SEQ ID NO: 354), (Б) Z11946 (SEQ ID NO: 355) и (В) Z11947 (SEQ ID NO: 356), соответственно, слитых с альбумин-связывающим полипептидом РР013 (SEQ ID NO: 377), а также для Z варианта Z03638, использованного в качестве контрольной молекулы (SEQ ID NO: 378; не специфический в отношении FcRn). Кинетику связывания анализировали по кривым для 640 нМ (пунктирная линия), 160 нМ (точечная пунктирная линия) и 40 нМ (сплошная серая линия) с использованием модели связывания 1:1 по Лангмюру. Кинетические параметры и аффинности, рассчитанные по аппроксимированным кривым (сплошные черные линии), приведены в Таблице 6.

На Фиг. 8 показаны фармакокинетические профили для трех Z вариантов, связывающих FcRn, слитых с альбумин-связывающим полипептидом РР013, полученные, как описано в Примере 6. Все Z варианты Z11947 (SEQ ID NO: 356, незаштрихованные квадраты), Z11946 (SEQ ID NO: 355, незаштрихованные треугольники) и Z11948 (SEQ ID NO: 354, незаштрихованные ромбы) демонстрировали увеличенный период полувыведения по сравнению с отрицательным контролем Z03638-PP013 (незаштрихованные круги).

На Фиг. 9 показано блокирование взаимодействия IgG с человеческим FcRn в присутствии His6-Z07918 (SEQ ID NO: 1; черные круги), IVIg (серые квадраты) и SCIg (серые треугольники), соответственно, которое исследовали, как описано в Примере 10.

На Фиг. 10 показано, что блокирование взаимодействия IgG-FcRn специфическими в отношении FcRn Z вариантами у мышей приводит к снижению уровней IgG. Как описано далее в Примере 11, мыши получали ежедневно пять инъекций носителя (+), слитого с ABD Z варианта Z07918-РР013 (незаштрихованный квадрат) и Z11948 (SEQ ID NO: 354; заштрихованный круг). Концентрацию эндогенного IgG определяли при помощи ELISA. Концентрацию IgG у отдельных мышей через 24, 72, 120 и 168 ч соотносили с уровнем в момент времени 0 ч и, таким образом, представляли результаты в процентах от IgG в момент времени 0 ч.

На Фиг. 11 показаны значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) меченных Alexa Fluor® 647 димерных и мономерных полипептидов, связывающхся с трансфицированными человеческим FcRn-eGFP клетками HeLa, полученные, как описано в Примере 13. (А) Димеры Z11948-(G4S)3-Z11948 (SEQ ID NO: 369) и Z11948-(G4S)-Z11948 (SEQ ID NO: 368) и соответствующий мономер Z варианта, Z07918 (SEQ ID NO: 1), связывание с FcRn при pH 6 (черные столбики) и pH 7,4 (белые столбики). (Б) Мономеры первичного Z варианта Z07918 (SEQ ID NO: 1) и мономеры зрелых Z вариантов Z13583 (SEQ ID NO: 23), Z13621 (SEQ ID NO: 44), Z13654 (SEQ ID NO: 65) и Z13674 (SEQ ID NO: 75), связывание с FcRn при pH 6 (черные столбики) и pH 7,4 (белые столбики).

На Фиг. 12 показано блокирование связывания IgG человека с FcRn человека димерными и мономерными полипептидами, которое исследовали, как описано в Примере 14. (А) Димеры Z11948-(G4S)3-Z11948 (SEQ ID NO: 369) и Z11948-(G4S)-Z11948 (SEQ ID NO: 368); соответствующий мономер Z варианта, Z07918 (SEQ ID NO: 1), SCIg и IVIg. (Б) Мономеры первичного Z варианта Z07918 (SEQ ID NO: 1) и мономеры зрелых Z вариантов Z13583 (SEQ ID NO: 23) и Z13621 (SEQ ID NO: 44).

На Фиг. 13 показано pH-зависимое связывание полипептидов с hFcRn, которое исследовали методом ELISA, как описано в Примере 17. (А) Связывание указанных полипептидов при pH 6. (Б) Связывание указанных полипептидов при pH 7,4. При обоих значениях pH у димерных полипептидов (ZAZ####) наблюдали более эффективное связывание по сравнению с мономерным Z вариантом (Z13621).

На Фиг. 14 показано снижение уровней hIgG у трансгенных по FcRn мышей, получавших димерные полипептиды, как описано в Примере 20. (А) Снижение уровней hIgG было одинаково эффективным как при расположении альбумин-связывающего домена РР013 (SEQ ID NO: 377) между двумя Z группировками (ZAZ3715; SEQ ID NO: 371), так и при расположении РР013 на C-конце полипептида (ZZA3716; SEQ ID NO: 372). (Б) Одинаковое снижение уровней hIgG было получено с полипептидами ZAZ3869 (SEQ ID NO: 374), ZAZ3870 (SEQ ID NO: 375) и ZAZ3871 (SEQ ID NO: 376).

На Фиг. 15 показано дозозависимое снижение уровней hIgG у мышей NMRI, получавших димерные полипептиды ZAZ3715 (SEQ ID NO: 371) и ZAZ3824 (SEQ ID NO: 373), как описано в Примере 21.

На Фиг. 16 показаны сывороточные концентрации ZAZ3715 (SEQ ID NO: 371) и ZAZ3824 (SEQ ID NO: 373), соответственно, измеренные в том же исследовании катаболизма IgG, которое представлено на Фиг. 15.

На Фиг. 17 приведено изображение геля SDS-PAGE (полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия), на котором показаны исходные и мутированные FcRn-связывающие Z варианты до (0) и через 2 недели после (2w) проведения теста на стабильность. Дорожка 1: Z11948 (0), дорожка 2: Z11948 (2w), дорожка 3: Маркер мол. массы, дорожка 4: Z17347 (0), дорожка 5: Z17347 (2w), дорожка 6: Z17348 (0), дорожка 7: Z17348 (2w). Маркер молекулярной массы (Mw) представлял собой предварительно окрашенный белковый стандарт Novex® Sharp (216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3,5 кДа). Диагональные полосы, заметные на Фиг. 17 , являются артефактом, отпечатком второго геля, который окрашивался в том же контейнере.

На Фиг. 18 показано связывание с FcRn человека и яванского макака при pH 6,0, как описано в Примере 25. Показаны наложенные сенсограммы, полученные на приборе Biacore, представляющие ответ на инъецирование 90 нМ Z варианта, несущего His6-метку, вдоль поверхности с адсорбированным hFcRn (черные линии) и cFcRn (серые линии) для: (A) Z13578 (сплошная линия) и Z18632 (пунктирная линия), (В) Z13616 (сплошная линия) и Z18633 (пунктирная линия) и (С) Z13621 (сплошная линия) и Z18634 (пунктирная линия).

Примеры

Краткое описание

В следующих Примерах изложена разработка новых молекул Z вариантов, нацеленных на неонатальный Fc рецептор (FcRn). Z варианты были получены с использованием технологии фагового дисплея. Гены, кодирующие описанные здесь FcRn-связывающие полипептиды, и соответствующие аминокислотные последовательности приведены на Фиг. 1 и обозначены идентификаторами SEQ ID NO: 1-353. Предсказанные FcRn-связывающие мотивы (ВМ) описанных здесь FcRn-связывающих полипептидов располагаются между остатком 8 и остатком 36 в последовательностях SEQ ID NO: 1-353. Кроме того, исследовали свойства связывания с FcRn и способность блокировать связывание IgG с FcRn указанных полипептидов в димерной форме.

Пример 1

Получение αFcRn человека и β2-микроглобулина человека (В2М)

В данном Примере внеклеточный домен (ECD) αFcRn человека (SEQ ID NO: 379) в комплексе с β2-микроглобулином человека (SEQ ID NO: 380) (комплекс обозначен как FcRn) и β2-микроглобулин человека в не связанной в комплекс форме (обозначен как В2М) получили в виде растворимых белков. Человеческие FcRn и В2М, полученные в данном Примере, использовали для отбора фагов, анализов ELISA и Biacore в Примерах 2 и 3.

Материалы и методы

Конструирование плазмид, содержащих гены αFcRn человека и β2-микроглобулина человека для применения при совместной экспрессии: Гены, кодирующие αFcRn человека (Genbank ВС008734.2) и β2-микроглобулин человека (В2М) (Genbank ВС032589.1), получили из OpenBiosystems. Фрагмент гена, кодирующий аминокислоты 24-290 αFcRn человека (αFcRnECD) (SEQ ID NO: 379), амплифицировали, используя ПЦР с перекрывающимися праймерами, для получения конструкции, состоящей из: сайта attB1/последовательности Козак, за которыми располагался ген, кодирующий лидерную последовательность каппа-цепи Ig, hFcRnECD, GS-линкер и flag-метку, за которыми располагался сайт attB2. Создали аналогичную конструкцию, содержащую фрагмент гена, кодирующий аминокислоты 21-119 В2М человека (SEQ ID NO: 380), однако flag-метку заменили на His6-метку. Конструкции встроили в плазмиду pDONOR221 (Invitrogen, кат. номер 12536-017) посредством рекомбинации с использованием системы Gateway (Invitrogen, кат. номер 11789020, смесь ферментов Gateway® BP Clonase® II) согласно рекомендациям производителя. После подтверждения правильности последовательностей конструкцию αFcRnECD человека встроили в 2K7bsd (Suter et al. (2006) Stem Cells 24: 615-623) посредством многосайтового клонирования Gateway вместе с плазмидой pENTR-CMV, содержащей промотор (Tai et al. (2012) PLoS One 7(9): е46269), с получением вектора 2K7bsd-CMV-hFcRnECD-Конструкцию гена В2М встроили аналогичным способом в 2K7neo (Suter et al., см. выше), с получением вектора 2K7neo-CMV-hB2M.

Клеточные культуры, получение рекомбинантных лентивирусных векторов и встраивание генов в клеточную линию SKOV-3: Клеточные линии HEK293T и SKOV-3 получили из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки выращивали при 37°C в инкубаторе с влажной атмосферой в присутствии 5% CO2. Полная среда для клеточной линии HEK293T представляла собой среду Игла в модификации Дюльбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1% раствора антибиотика-противогрибкового агента (АА) и 1% раствора заменимых аминокислот в минимальной поддерживающей среде MEM (NEAA). Полная среда для клеточной линии SKOV-3 представляла собой среду МакКоя 5А с добавлением 10% FBS и 1% АА.

Плазмиды 2K7bsd-CMV-hFcRnECD и 2K7neo-CMV-hB2M по отдельности совместно сотрансфицировали с оболочкой VSV-G и пакующей плазмидой gag/pol в клетки HEK293T с использованием трансфекции с хлоридом кальция (Zufferey et al. (1997) Nat Biotechnol 15(9): 871-5; Jakobsson et al. (2006) J Neurosci Res 84: 58-67). Супернатанты культуры HEK293, содержащие сформированные лентивирусные частицы с трансгенами αFcRnECD человека и В2М человека, соответственно, очищали от дебриса путем центрифугирования и фильтрования. Для последовательной трансдукции клеток SKOV-3 использовали два типа лентивирусных частиц. Клетки, успешно интегрировавшие оба гена αFcRnECD и В2М, отбирали путем добавления в культуральную среду бластицидина (Invitrogen) и G418 сульфата (Invitrogen) при пассажах клеток в течение двух недель. Полученную стабильно трансдуцированную клеточную линию SKOV-3 обозначили как SKOV-3 hFcRnECD/hB2M.

Экспрессия рекомбинантного FcRn человека: Клетки SKOV-3, соэкспрессирующие человеческие αFcRnECD и В2М с образованием FcRn человека, размножали и высаживали по 1,5×107 клеток во флаконы HYPERFlask (Corning) в 560 мл полной ростовой среды. Через пять суток, когда клетки оседали и увеличивались в числе, среду заменяли на полную ростовую среду без FBS. Через пять суток культивирование прекращали, а супернатант собирали, пропускали через 45 мкм фильтр и замораживали при -80°C.

Очистка рекомбинантного FcRn человека с помощью хроматографии с применением IgG человека Очистку белка осуществляли в системе Explorer (GE Healthcare). 1 мл IgG человека (Pharmacia) в 0,2 М NaHCO3, 0,5 М NaCl pH 8,3 в концентрации 10 мг/мл связывали с 1 мл активированной NHS (N-гидроксисукцинимид) HP колонкой HiTrap (GE Healthcare) согласно инструкции изготовителя. Супернатант клеток SKOV-3, содержащую рекомбинантный FcRn человека, размораживали и доводили pH до 5,8 с помощью HCl. Затем супернатант наносили порциями по 100 мл на колонку, предварительно уравновешенную 20 мМ Bis-Tris pH 5,8. Колонку промывали 20 мл 20 мМ Bis-Tris pH 5,8 и элюировали фракциями по 1 мл с помощью 50 мМ Tris, pH 8,1. Замену буфера на PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, 10 мМ фосфат, 137 мМ NaCl, 2,68 мМ KCl, pH 7,4) производили с помощью диализа.

SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг: Чистоту элюированных фракций после очистки белка анализировали при помощи SDS-PAGE с использованием реагента для окрашивания GelCode Blue Stain (Pierce) и набора для окрашивания SilverXpress® Silver (Invitrogen). Вестерн-блоттинг проводили с использованием нитроцеллюлозных мембран Amersham Hybond™-C Extra (GE Healthcare). Мембрану блокировали 5% обезжиренным сухим молоком (Semper) в TBS+T (50 мМ основание Trizma, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween-20, pH 8) в течение 1 часа, затем зондировали смесью кроличьего поликлонального антитела к FCGRT (Atlas Antibodies) в концентрации 0,15 мкг/мл и кроличьего поликлонального антитела к В2М (Atlas Antibodies) в концентрации 0,23 мкг/мл в TBS+T. Затем мембрану инкубировали со стабилизированным антителом козы против иммуноглобулинов кролика, конъюгированным с пероксидазой хрена (Pierce) в разведении 1:10000 в TBS+T. После добавления субстрата ТМВ (Pierce) получали изображение мембраны на Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare). Для проявления Hyperfilm использовали проявитель GBX developer и фиксатор GBX fixer (Sigma-Aldrich).

Получение не связанной в комплекс формы В2М человека: В2М человека получали в Е. coli. Экспрессию и очистку выполняли по существу как описано Sandalova et al. (2005) Acta Chryst F61: 1090-1093 и et al. (2001) J Immunol 166: 7327-7334. Очищенный белок, состоящий из аминокислот 21-119 человеческого В2М, в мочевине подвергали рефолдингу в присутствии аргинина следующим образом: 0,5 мг В2М быстро добавляли к 2 мл буфера для рефолдинга (20 мл 1 М Tris-HCl pH 8,0, 16,87 г L-аргинина (забуференного HCl), 0,8 мл 0,5 М EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 61 мг GSSG (окисленный глутатион), 307 мг GSH (восстановленный глутатион) и воды milli-Q до конечного объема 200 мл, pH 8,0 с добавлением ингибитора протеаз (Roche, кат. номер 11873580001)). Процедуру рефолдинга проводили при 4°C в течение 4 часов. У прошедшего рефолдинг белка В2М заменяли буфер на PBS с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare).

Результаты

Конструирование плазмид, содержащих гены αFcRn человека и β2-микроглобулина человека для применения при совместной экспрессии: Гены, кодирующие внеклеточный домен α-цепи человеческого FcRn (αFcRnECD) и человеческий В2М, встраивали в лентивирусные плазмиды для переноса 2K7bsd и 2K7neo. соответственно. В обоих случаях встроенный ген находился под контролем промотора CMV. Гены удлиняли таким образом, чтобы полученные белки имели лидерную последовательность каппа цепи Ig на N-конце нацеливания белка для экспорта через эндоплазматический ретикулум в культуральную среду (сигнальная последовательность отщеплялась при секреции). Кроме того, αFcRnECD имел C-концевую спейсерную последовательность, за которой следовала FLAG-метка для возможного выявления. В2М человека имел C-концевую спейсерную последовательность, за которой следовала His6-метка для возможного выявления. Спейсерную последовательность добавляли для увеличения доступности метки. Лентивирусные переносящие плазмиды также содержали гены устойчивости к двум разным антибиотикам для обеспечения отбора клеток, в которые были вставлены обе конструкции.

Экспрессия и очистка рекомбинантного FcRn человека: Гены, кодирующие αFcRnECD и В2М, встраивали в геном SKOV-3 с использованием лентивирусов, и полученный белок FcRn секретировался в культуральную среду. Для захвата только FcRn, у которого сохранилось pH-зависимое связывание IgG, использовали аффинную хроматографию с иммобилизованным IgG, где рецептор захватывали при pH 5,8 и элюировали при pH 8,1. Захваченный белок элюировали в трех фракциях.

SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг: Для определения присутствия двух пептидных цепей (αFcRnECD и В2М) полученного белка FcRn и для анализа чистоты элюированного материала элюированные фракции анализировали методом SDS-PAGE. При окрашивании геля красителем GelCode Blue были выявлялены две полосы с молекулярной массой 12 и 36 кДа, соответственно. Это приблизительно соответствует теоретическим молекулярным массам негликозилированных пептидных цепей 12 кДа для В2М и 31 кДа для αFcRnECD-Часть белка, представленная αFcRnECD, содержит один сайт гликозилирования, таким образом, предполагают, что ее молекулярная масса должна превышать 31 кДа. Гель также окрашивали серебром для повышения чувствительности и, возможно, выявления примесей. В первой элюированной фракции выявили полосу приблизительно 66 кДа, которая могла соответствовать BSA (бычий сывороточный альбумин), возникающему в результате прикрепления клетки. Общее количество белка, выделенного во фракциях 2 и 3, соответствовало 1,4 мг/л культуральной среды. Проведенный анализ объединенного вещества методом вестерн-блоттинг продемонстрировал по существу только две основные полосы и очень слабую дополнительную полосу менее 12 кДа, которая могла соответствовать продукту деградации.

Пример 2

Отбор Z вариантов, связывающих FcRn, и связывание в ELISA

В данном Примере FcRn человека использовали в качестве мишени для отбора методом фагового дисплея с использованием фаговой библиотеки Z вариантов. У выбранных клонов секвенировали ДНК, продуцировали в периплазматической фракции Е. coli и анализировали относительно FcRn в ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).

Материалы и методы

Биотинилирование белка-мишени FcRn и В2М: FcRn человека и В2М человека, полученные, как описано в Примере 1, биотинилировали с использованием биотина No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, кат. номер 21327) в молярном избытке 31 × (FcRn) и 10 × (В2М), соответственно, согласно рекомендациям производителя. Реакции проводили при комнатной температуре (RT) в течение 30 мин. Последующую замену буфера на PBS осуществляли с помощью кассет для диализа Slide-a-lyzer (Pierce, кат. номер 66380, MWCO (порог отсечения молекулярной массы) 10000 для FcRn, и Pierce, кат. номер 66333, MWCO 3500 для В2М), согласно инструкциям производителя.

Отбор Z вариантов, связывающих FcRn, методом фагового дисплея. Для отбора Z вариантов, связывающих FcRn, использовали библиотеку случайных вариантов белка Z, экспонированную на бактериофаге, сконструированную в фагмиде pAY02592, по существу как описано et al. (2007) J Biotechnol, 128: 162-183. В данной библиотеке альбумин-связывающий домен (ABD, GA3 белка G штамма Streptococcus G148) использовали в качестве партнера по слиянию с Z вариантами. Библиотека была обозначена Zlib006Naive.ll, а ее размер составил 1,5×1010 элементов библиотеки (Z вариантов). Клетки Е. coli RRIΔM15 ( et al., (1982) Nucleic Acids Res 10: 5765-5772), хранившиеся в глицерине, содержащие фагмидную библиотеку Zlib006Naive.ll, инокулировали в 20 л среды определенного состава, не содержащей пролина [дикалия гидрофосфат 7 г/л, тринатрия цитрат дигидрат 1 г/л, урацил 0,02 г/л, YNB (не содержащая аминокислот дрожжевая азотная основа Difco™, Becton Dickinson) 6,7 г/л, глюкозы моногидрат 5,5 г/л, L-аланин 0,3 г/л, L-аргинина моногидрохлорид 0,24 г/л, L-аспарагина моногидрат 0,11 г/л, L-цистеин 0,1 г/л, L-глутаминовая кислота 0,3 г/л, L-глутамин 0,1 г/л, глицин 0,2 г/л, L-гистидин 0,05 г/л, L-изолейцин 0,1 г/л, L-лейцин 0,1 г/л, L-лизина моногидрохлорид 0,25 г/л, L-метионин 0,1 г/л, L-фенилаланин 0,2 г/л, L-серин 0,3 г/л, L-треонин 0,2 г/л, L-триптофан 0,1 г/л, L-тирозин 0,05 г/л, L-валин 0,1 г/л], с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Культивирование осуществляли при 37°C в ферментере (Belach Bioteknik, BR20). Когда клетки достигали оптической плотности 0,75 при 600 нм (OD600), приблизительно 2,6 л культуры инфицировали с использованием хелперного фага M13K07 (New England Biolabs, кат. номер N0315S) в 10 × молярном избытке. Клетки инкубировали в течение 30 минут, после чего ферментер заполняли до 20 л TSB-YE (триптический соевый бульон-дрожжевой экстракт; 30 г/л TSB (триптический соевый бульон), 5 г/л дрожжевого экстракта) с добавлением 100 мкМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) для индуцирования экспрессии и 25 мкг/мл канамицина и 12,5 мкг/мл карбенициллина и культивировали при 30°C в течение 22 ч. Клетки в культуре осаждали путем центрифугирования при 15900 g. Фаговые частицы преципитировали из супернатанта двукратно в PEG/NaCl (полиэтиленгликоль/хлорид натрия), фильтровали и растворяли в PBS и глицерине, как описано et al., см. выше. Фаги хранили при -80°C до применения.

Отбор против биотинилированного FcRn человека осуществляли в четырех циклах, разбитых на две разные цепочки. Приготовление резерва фагов и процедуру отбора осуществляли по существу, как описано в WO 2009/077175 для отбора против другой биотинилированной мишени. Амплификацию фага между циклами отбора осуществляли путем инфицирования фагом Е. coli RRIΔM15, затем культивирования в растворе следующим образом. Элюированный фаг и хелперный фаг M13K07 в 10 × избытке по сравнению с бактериями использовали для одновременного инфицирования бактерий в log фазе при 37°C в течение 30 мин без вращения и затем в течение 30 мин при медленном вращении. Перед инфицированием бактерии выращивали до log фазы в среде определенного состава, не содержащей пролин, описанной выше. Инфицированные бактерии осаждали посредством центрифугирования при 4300 g в течение 10 мин и ресуспендировали в 200 мл среды TSB+YE, дополненной 0,1 мМ IPTG, 25 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл ампициллина и культивировали при 30°C в течение ночи для получения фага.

Буфер для отбора содержал 100 мМ фосфата натрия и 150 мМ хлорида натрия, доведенных до pH 5,5 соляной кислотой, с добавлением 0,1% желатина и 0,1% Tween-20. При отборе в буфер для отбора добавляли человеческий сывороточный альбумин (HSA, Albucult, Novozymes) в конечной концентрации 1,5 мкМ. Для уменьшения количества неспецифически связывающихся вариантов осуществляли предварительный отбор путем инкубации фаговых частиц с покрытыми стрептавидином Dynabeads® М-280 Streptavidin (SA-гранулы, Dynal, кат. номер 112.06) в течение 1 часа при комнатной температуре. Вторую предварительную селекцию осуществляли в течение 30 мин при комнатной температуре против В2М человека, иммобилизованного на иммунопробирках (Nunc, кат. номер 444474). 5 мкг/мл В2М человека в карбонатном буфере (Sigma, кат. номер 068K8214) иммобилизовали на пробирке при 7°C в течение более 1 ч. После двукратного промывания водопроводной водой пробирки блокировали PBS с 0,5% казеина (Sigma, кат. номер С8654) в течение 30 мин при комнатной температуре перед применением. Все пробирки и гранулы, используемые в отборе, предварительно блокировали PBS с 0,1% желатина. Отбор осуществляли в растворе при комнатной температуре, затем осуществляли захват комплексов мишень-фаг на SA-гранулах, где использовали 1 мг гранул на 2,9 мкг биотинилированного FcRn. В 1 цикле отбора использовали 100 нМ биотинилированного FcRn и проводили две отмывки по две минуты каждая с помощью буфера для отбора. В последующих циклах применяли повышенную жесткость с использованием пониженной концентрации мишени и увеличенного числа промывок: 50 нМ/5 отмывок, 25 нМ/8 отмывок и 10 нМ/12 отмывок в циклах 2, 3 и 4, соответственно. После отмывок связанный фаг элюировали, используя две различных процедуры в двух цепочках отбора: 1) 500 мкл 0,1 М глицин-HCl, pH 2,2, с последующей немедленной нейтрализацией 50 мкл 1 М Tris-HCl, pH 8,0, и 450 мкл PBS, или 2) 500 мкл 100 мМ фосфата натрия и 150 мМ хлорида натрия, pH 8,0 с нейтрализацией 500 мкл PBS.

Секвенирование: ПЦР-фрагменты амплифицировали из отдельных колоний, используя стандартную программу ПЦР и праймеры AFFI-21 (5'-tgcttccggctcgtatgttgtgtg (SEQ ID NO: 385)) и AFFI-22 (5'-cggaaccagagccaccaccgg (SEQ ID NO: 386)). Секвенирование амплифицированных фрагментов выполняли с использованием биотинилированного олигонуклеотида AFFI-72 (5'-биотин-cggaaccagagccaccaccgg (SEQ ID NO: 387)) и набора для секвенирования BigDye® Terminator v3.1 Cycle (Applied Biosystems) согласно протоколу производителя. Продукты реакций секвенирования очищали путем связывания с магнитными гранулами, покрытыми стрептавидином (Detach Streptavidin Beads, Nordiag, кат. номер 2012-01), с использованием Magnatrix 8000 (Magnetic Biosolution) и анализировали на генетическом анализаторе ABI PRISM® 3130xl (РЕ Applied Biosystems).

Получение Z вариантов для ELISA: Секвенированные Z варианты получали путем инокуляции отдельных отобранных колоний в 10 мл среды TSB-YE с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и 0,1 мМ IPTG и инкубации в течение 24 ч при 37°C. Клетки осаждали путем центрифугирования, ресуспендировали в 2 мл PBST (PBS с добавлением 0,05% Tween-20), замораживали при -80°C и размораживали в водяной бане для высвобождения периплазматической фракции клеток. Процедуру замораживания-оттаивания повторяли семь раз и затем осаждали клетки путем центрифугирования. Супернатант периплазматического экстракта содержал Z варианты в виде слияний с ABD, экспрессированные как AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG ( et al., см. выше). Z##### обозначает отдельные Z варианты длиной 58 аминокислотных остатков.

Анализ KD Z вариантов методом ELISA: Связывание Z вариантов с FcRn анализировали методом ELISA. Половину площади 96-луночных планшетов для ELISA покрывали 2 мкг/мл антитела козы против ABD (собственного производства), разведенного до 2 мкг/мл в буфере для покрытия (50 мМ карбоната натрия, pH 9,6) при 4°C в течение ночи. Раствор антитела сливали и лунки блокировали 100 мкл PBSC (PBS с добавлением 0,5% казеина) в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Блокирующий раствор удаляли, а в лунки добавляли 50 мкл периплазматического раствора, разведенного 1:4, и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре при медленном встряхивании. Растворы сливали и лунки промывали четыре раза либо 0,05% буфером РСТ, pH 6,0 (фосфатно-цитратный буфер Мак-Илвейна, pH 6,0, с добавлением 0,05% Tween-20) или 0,05% буфером РСТ, pH 7,4 (фосфатно-цитратный буфер Мак-Илвейна, pH 7,4, с добавлением 0,05% Tween-20). В лунки добавляли белок-мишень, биотинилированный FcRn человека, в серии разведений 1:3 в концентрациях от 2 мкг/мл (45 нМ) до 0,3 нг/мл (6,9 пМ) в буфере РСС с pH 6,0 или pH 7,4, (фосфатно-цитратный буфер Мак-Илвейна, pH 6,0 или pH 7,4, с добавлением 0,5% казеина), соответственно. Планшеты инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре с последующими отмывками, как описано выше. Конъюгат стрептавидина и HRP (Thermo Scientific, кат. номер N100) разводили 1:30000 в буфере РСС с pH 6,0 или pH 7,4, соответственно, и добавляли в лунки с последующей инкубацией в течение 45 мин. После отмывки, как описано выше, в лунки добавляли 50 мкл субстрата ImmunoPure ТМВ (Thermo Scientific, кат. номер 34021) и планшеты проявляли согласно рекомендациям производителя. Измеряли поглощение при 450 нм с помощью считывающего устройства для многолуночных планшетов Victor3 (Perkin Elmer). Связывание Z варианта с нерелевантным белком использовали в качестве отрицательного контроля, а пустую пробу создавали, пропуская периплазматическую стадию. Z вариант, который связывался с FcRn в предварительном эксперименте (Z07918, SEQ ID NO: 1), использовали в качестве положительного контроля. Полученные значения анализировали с помощью программы GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) и нелинейной регрессии для определения аффинности (KD) взаимодействий.

Анализ специфичности Z вариантов методом ELISA: В другом эксперименте ELISA тестировали специфичность Z вариантов в отношении 2 мкг/мл биотинилированных человеческих белков В2М, PSMA (собственного производства) и IgG (поликлональные, Pharmacia) и буфера РСС с pH 6,0 или pH 7,4, соответственно. Исследование проводили при pH 6,0 и pH 7,4, соответственно, как описано выше. На стадии белка-мишени в лунки добавляли биотинилированные белки или буфер вместо FcRn.

Результаты

Отбор Z вариантов, связывающих FcRn, методом фагового дисплея: Индивидуальные клоны получили после четырех циклов отбора посредством фагового дисплея против биотинилированного человеческого FcRn.

Секвенирование: Осуществляли секвенирование клонов, выбранных случайным образом на четвертом раунде отбора. Каждому Z варианту был присвоен уникальный идентификационный номер #####, и отдельные варианты были обозначены как Z#####. Аминокислотные последовательности Z вариантов длиной 58 аминокислотных остатков представлены на Фиг. 1 как SEQ ID NO: 1-16 и SEQ ID NO: 353.

Выведенные FcRn-связывающие мотивы у данных Z вариантов располагаются между остатком 8 и остатком 36 в последовательностях SEQ ID NO: 1-16 и SEQ ID NO: 353 на Фиг. 1. Аминокислотные последовательности полипептидов длиной 49 аминокислотных остатков (BMod), которые, как предсказано, составляют полный трехспиральный пучок в составе каждого из этих Z вариантов, располагаются между остатком 7 и остатком 55.

ELISA с Z вариантами: В Е. coli были получены шестнадцать клонов в виде слитых белков с ABD. Периплазматические фракции использовали в ELISA против серии разведения FcRn человека. Клоны были представлены: Z07909 (SEQ ID NO: 13), Z07918 (SEQ ID NO: 1), Z07930 (SEQ ID NO: 6), Z07960 (SEQ ID NO: 4), Z10109 (SEQ ID NO: 3), Z10111 (SEQ ID NO: 8), Z10127 (SEQ ID NO: 12), Z10129 (SEQ ID NO: 9), Z10140 (SEQ ID NO: 5), Z10141 (SEQ ID NO: 10), Z10145 (SEQ ID NO: 15), Z10152 (SEQ ID NO: 14), Z10156 (SEQ ID NO: 11), Z10161 (SEQ ID NO: 16), Z10183 (SEQ ID NO: 7) и Z10193 (SEQ ID NO: 2). При pH 6,0 определили значения KD для всех вариантов, а при pH 7,4 - для трех вариантов (Таблица 2). У тринадцати вариантов данные для анализа KD при pH 7,4 получены не были. Ни один из шестнадцати вариантов не демонстрировал неспецифического связывания при исследовании против В2М, IgG или PSMA человека.

н.о. - не определяется.

Пример 3

Получение и характеризация Z вариантов, связывающих FcRn

В данном Примере в E. coli получили семнадцать Z вариантов, очистили и исследовали против человеческого FcRn в Biacore. Подгруппу указанных вариантов также исследовали против мышиного FcRn. Для исследования вторичной структуры в подгруппе Z вариантов использовали спектроскопию кругового дихроизма (CD).

Материалы и методы

Субклонирование Z вариантов: ДНК семнадцати Z вариантов, связывающих FcRn (SEQ ID NO: 1-16 и SEQ ID NO: 353), амплифицировали из вектора библиотеки pAY02592. Для конструирования мономерных молекул Z вариантов с N-концевой His6-меткой применяли стратегию субклонирования с использованием стандартных методов молекулярной биологии (по существу как подробно описано в WO 2009/077175 для Z вариантов, связывающих другую мишень). Фрагменты Z генов субклонировали в экспрессирующий вектор pAY01448, что приводило к кодируемой последовательности MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD.

Кроме того, вариант Z07918 (SEQ ID NO: 707), связывающийся с FcRn, но начинающийся с аминокислот АЕ вместо VD и обозначенный как Z11948 (SEQ ID NO: 1060), клонировали в виде гомодимерных конструкций с двумя разными линкерами между Z вариантами и с последующей C-концевой His6-меткой. Для этого использовали стандартные методы молекулярной биологии, включая амплификацию ДНК, рестрикцию соответствующими рестрикционными ферментами и лигирование ДНК. Два линкера получили от Thermo Fisher Scientific. Фрагменты Z генов субклонировали в экспрессирующий вектор (рЕТ-26 origin, Novagen), что приводило к кодируемой последовательности [Z#####]-GT-(G4S)-PR-[Z#####]-LEHHHHHH и [Z#####]-GT-(G4S)3-[Z#####]-LEHHHHHH, соответственно.

Культивирование и очистка: Клетки E. coli BL21(DE3) (Novagen) трансформировали плазмидами, содержащими фрагмент гена каждого соответствующего Z варианта, связывающего FcRn, и культивировали при 37°C в 800 или 1000 мл среды TSB-YE с добавлением 50 мкг/мл канамицина. При OD600, равной 2 для индуцирования экспрессии добавляли IPTG в кон