Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СОКУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ IN VITRO МОДЕЛИ ГЕМАТО-ЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА

Настоящее изобретение относится к клеточной биотехнологии, а именно касается способа со культивирования клеток для создания моделей гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для изучения транспорта и токсичности лекарственных средств in vitro.

В частности, заявляемое изобретение может быть реализовано в высокопроизводительных скринингах способности проникновения ксенобиотиков и лекарственных средств через ГЭБ.

Заявляемое решение может быть использовано в более широкой области для изучения миграции клеток или для исследования влияния различных химических веществ на клетки в условиях in vitro.

Из уровня техники известен патент WO 9105038, в котором описана модель ГЭБ, состоящая из конфлюентного монослоя микроваскулярных эндотелиальных клеток из любого позвоночного, культивируемых на пористой мембране в среде обогащенной факторами, выделяемыми астроцитами, или сокультивируемых с астроцитами, находящимися в нижнем компартменте.

Из уровня техники известен патент WO 2007072953, в котором описывается модель, состоящая из эндотелиальных клеток, культивируемых в присутствии перицитов и астроцитов. В данной модели первичные микроваскулярные эндотелиальные клетки мозга крысы высаживаются на верхнюю поверхность мембраны, а перициты культивируются на обратной стороне мембраны; первичные астроциты высаживают на дно нижнего компартмента.

Из уровня техники известен патент US 2008044847, описывающий модель, в которой первичные микроваскулярные эндотелиальные клетки мозга или эндотелиальные клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток, культивируются совместно с нейрональными прогениторными клетками.

Недостатками вышеописанных способов является использование в них первичных культур видов отличных от человека, что может вызывать видоспецифические различия в проницаемости и других свойствах этих ^{моделей. К тому же использование первичных культур является трудоемким процессом и требует высокой экспертизы, что делает эти способы малопригодными для высокопроизводительного скрининга.}

Другими недостатками способов является культивирование в статических условиях, что не отражает физиологических условий, в которых эндотелий сосудов подвергаются воздействию касательного напряжения.

Наиболее близким решением является способ, описывающий трехмерную трубчатую структуру с постоянным потоком питательной среды, имитирующим физиологическое касательное напряжение в кровеносных сосудах (WO 03025206) (прототип). В этой динамической модели используются различные монокультуры и совместное культивирование клеток различного типа, а именно эндотелиальных клеток мозга крысы, астроцитов крысы и эндотелиальных клеток мозга человека. Недостатком модели является использование одновременно только двух типов клеток, эндотелиальных клеток и астроцитов.

Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в преодолении перечисленных выше недостатков посредством разработки способа сокультивирования клеток до момента образования каждым типом клеток сплошного монослоя с последующим изучением сформированной клеточной модели in vitro, в т.ч. в динамическом режиме ростовой среды.

Поставленная задача реализуется следующим образом:

Готовят необходимое количество мембранных вставок Transwell для 96-луночного планшета:

- покрывают нижнюю сторону мембраны раствором ВКМ (35 мкл/вставку) следующего состава: коллаген IV (20 мкг/мл) + агрин (4 мкг/мл) + энтактин (4 мкг/мл) + ламинин 511 (5 мкг/мл) + ламинин 411 (5 мкг/мл) в DPBS (Са2+/Mg2+) (фиг. 1);

- покрывают верхнюю сторону мембраны раствором ВКМ (35 мкл/вставку) следующего состава: ламинин 211(10 мкг/мл) в DPBS (Ca2+/Mg2+).

Планшеты с покрытыми ВКМ мембранными вставками хранят в асептических условиях при +2°С - +8°С до 4 недель. К мембранам добавляют 1xDPBS (Ca⁺⁺/Mg⁺⁺), чтобы предотвратить пересыхание мембран с ВКМ.

Для покрытия нижней стороны мембраны ВКМ или для посева клеток на нижнюю сторону мембраны, мембранную вставку Transwell переворачивают в лунке планшета вверх дном, наносят каплю (~35 мкл) раствора ВКМ или суспензии клеток, закрывают крышкой или пленкой Parafilm для предотвращения испарения среды, ставят в CO₂-инкубатор на достаточное время для формирования ВКМ или для прикрепления клеток.

Дифференцировка iPS клеток

Дифференцировку клеток проводят в соответствии с детально описанным протоколом [Lippmann ES, 2012] (фиг. 1). Засевают iPS клетки линии IMR90 - 4 в 6-луночные планшеты в плотности 10000-15600 клеток/см² в питательной среде Е8, содержащей 10 мкМ Y-27632 (День -1). Примерно через 24 часа после посева клеток меняют среду на Е6 питательную среду (День 0) для индукции дифференцировки. Меняют среду каждые 24 часа. Дифференцирут клетки в Е6 среде в течение 4 дней. Далее, меняют среду на ЕС питательную среду с добавлением 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ ретиноевой кислоты (RA), инкубируют48 часов. После этого отбирают ЕС питательную среду, промывают клетки один раз DPBS и инкубируют с Аккутазой 20-25 минут. Осаждают клетки центрифугированием и далее пересаживают на слой Перицитов для селективной адгезии (3 пункт). Пересаживают клетки для селекции в отношении 1 лунка 6-луночного планшета с незрелыми дифференцированными клетками на 3 мембранных вставки (12-луночного планшета) или 24 мембранных вставки (96-луночного планшета).

Сокультивирование iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов для формирования клеточной модели ГЭБ (фиг. 2).

Засевают перициты на нижнюю поверхность мембраны, покрытой ВКМ, в плотности 2,5*10⁵ клеток/см², в полной питательной среде (DMEM + 10% FBS). Ставят на 2 часа в СО₂-инкубатор для прикрепления клеток. После этого, меняют среду на ЕС питательную среду, инкубируют еще 24 часа. Засевают незрелые (Immature) iPS-EC клетки (пункт 2) на слой из перицитов (в отношении 1 лунка 6-дуночного планшета с незрелыми iPS-EC клетками на 24 мембранные вставки 96-луночного планшета) в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Дают клеткам прикрепиться в течение 2 часов в СО₂-инкубаторе. После этого, переверачивают мембранные вставки в лунках в их нормальное положение (дном вниз), и засевают астроциты на верхнюю (внутреннюю) сторону мембранной вставки в плотности 2,5*10⁵ клеток/см², в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Инкубируют 24 часа в ЕС питательной среде с добавлением bFGF и ретиноевой кислоты. Через 24 часа меняют среду на ЕС питательную среду без добавок, инкубируют еще 24 часа.

В результате формируется плотный клеточный барьер с физиологически релевантными значениями TEER (>2000 Ω⋅см²), которые сохраняются длительное время (более 3 дней).

Для наилучшего понимания сущности заявляемого изобретения ниже представлен перечень материалов и оборудования, используемых в настоящем описании:

«Трансвелл» («Transwell») - емкость для выращивания клеток или клеточных моделей, которые используются в микрофлюидных устройствах при проведении исследований клеточных моделей. Трансвеллы имеют форму цилиндра или усеченного конуса, объем от 100±25 мкл до 1,5±0,15 мл, верхний диаметр от 4,26±0,50 ммдо 24±0,5 мм, нижний диаметр от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм, высоту от 6±0,5 мм до 20±0,5 мм, дно выполнено в виде пористой мембраны с диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм и плотностью пор от 1×105 до 1×108 пор на 1 см². Трансвеллы могут быть выполнены из полиэстера, поликарбоната или политетрафторэтилена. Из уровня техники известны Трансвеллы фирмы Corning Inc. В настоящем изобретении используются Трансвеллы с толщиной мембраны 10 μm, материал мембраны поликарбонат (PC), диаметр пор в мембране 3 μm.

Клетки для сокультивирования: iPS(IMR)-EC (клетки микроваскулярного эндотелия головного мозга человека, дифференцированные из iPS клеток линии IMR90-4) (WiCell); imHBVP (иммортализованные перициты головного мозга человека) (Celther); fHA-hTERT (иммортализованные астроциты человека) (abm).

Культуральный пластик (Corning): Т25 флаконы; 6-луночныепланшеты; 96-луночные планшеты с мембранными вставками Transwell; 96-луночные планшеты.

Компоненты клеточной модели ГЭБ: Мембранные вставки Transwell для 96-луночного планшета.

Поверхность PC мембраны, обращенная в сторону нижнего отсека лунки ("сосудистый отсек"), покрыта следующими компонентами ВКМ: коллаген IV + агрин + энтактин + ламинин (411+511), для адгезии к поверхности мембраны перицитов и iPS-EC эндотелиальных клеток.

Поверхность PC мембраны, обращенная в сторону верхнего отсека лунки ("мозговой отсек"), покрыта следующими компонентами ВКМ: ламинин 211 для адгезии к поверхности мембраны астроцитов.

Компоненты ВКМ для клеточной модели ГЭБ: Ламинин 511 (BioLamina), Ламинин 411 (BioLamina), Коллаген IV (MERCK), Агрин (R&D Systems), Энтактин (R&D Systems), Ламинин 211 (BioLamina).

Компоненты ВКМ для моно-культур клеток:

Культивирование, поддержание iPS клеток - Matrigel (Corning);

Дифференцировка iPS клеток (со стадии селекции) - Коллаген IV (MERCK); Фибронектин (Sigma-Aldrich); fHA-hTERT; Внеклеточный матрикс - Applied Cell Extracellular Matrix (G422) (ABM).

Культуральная среда (средаи компоненты от Thermo Fisher Scientific, Sigma Aldrich, R&D Systems или ABM):

Питательная среда для iPS и iPS-EC клеток: E8 питательная среда с добавлением или без 10 мкМ Y-27632; Е6 питательная среда; ЕС питательная среда с добавлением или без 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ ретиноевой кислоты;

Питательная среда для imHBVP - DMEM с добавлением 10% FBS и антибиотиков (если необходимо);

Питательная среда для fHA-hTERT - Prigrow IV (abm) с добавлением 10% FBS.

Культуральная среда (для сокультивирования iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов): ЕС питательная среда.

Диссоциирующие растворы: Stem Pro Аккутаза (для imHBVP клеток и iPS-ЕС клеток перед стадией селекции); Версен (для iPS клеток); Трипсин/ЭДТА (для fHA-hTERT клеток).