Результат интеллектуальной деятельности: КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ МЫШИ МЕХ-73, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ВАКЦИНЫ

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и касается клеточной линии меланомы мыши МЕХ-73, предназначенной для разработки вакцины. Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются одним из способов лечения онкологических заболеваний. Принцип данного способа основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Опухолевая линия МЕХ-73 может быть предложена как безопасный иммуногенный субстрат для разработки препарата применяемого для лечения и профилактики меланомы у человека и млекопитающих (кошки, собаки и др.).

Цель изобретения - получение новой клеточной линии меланомы мыши и использование ее в разработке противоопухолевой вакцины.

Опухолевая линия возникла спонтанным мутированием из меланомы мыши В16 в процессе длительного пересева. Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в Специализированной коллекции культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» Института Цитологии РАН под номером РККК (П) 777Д.

Морфологические признаки клеточной линии МЕХ-73.

Культура представлена двумя пулами клеток: эпителиоидные - 23,3%, фибробластоподобные - 76,7%. Эпителиоидные клетки имеют полиморфное строение. Ядерно-цитоплазматическое соотношение смещено в сторону цитоплазмы. Хроматин в ядре слабо конденсирован, распределен равномерно. Фигур митоза не наблюдается. Цитоплазма негомогенная. Фибробластоподобные клетки имеют полиморфное строение. Значительная часть клетки занята ядром с мелко конденсированными зернами хроматина. Фигуры митоза наблюдаются крайне редко. 43,5% клеток содержат пигмент.

Генетический анализ клеточной линии МЕХ-73.

1. Выявлено присутствие мышиных генов раковых маркеров в хромосомной ДНК: mage А-1, GP100, тирозиназы, her2/neu, раково-эмбрионального антигена.

2. Выявлены белковые продукты экспрессии генов Her2/neu, тирозиназы, GP100.

Культуральные свойства клеточной линии МЕХ-73.

Опухолевые клетки культивируют в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, в культуральных флаконах (Costar). Клетки растут в виде прилипающего к пластику фибробластоподобного монослоя. Клетки снимаются с использованием 0,25% трипсина/ЭДТА. Концентрация клеток при посеве - 40000 кл/см², периодичность рассева - 1 раз в 5-7 дней.

Кариотипирование. Цитогенетический анализ МЕХ-73 выявил перестроенный кариотип, большей частью состоящий из акроцентрических хромосом, характерных для мыши, Mus museums. Клетки характеризуются околодиплоидным числом хромосом, разброс по числу хромосом варьирует от 39 до 43, в 67% клеток модальное число хромосом равно 41. Кариотип клеток стабилен, соответствует кариотипу исходного вида Mus museums.

ПЦР-анализ клеточной линии МЕХ-73. В линии клеток МЕХ-73 присутствуют девять микросателлитов, маркирующих восемь разных хромосом мыши. Праймеры для амплификации микросателлитов видоспецифичны для мыши.

Условия криоконсервации.

Состав среды для криоконсервации: 90% инактивированная фетальная бычья сыворотка, 10% DMSO, концентрация клеток - 1,0 млн/мл. Заморозка производится в программном замораживателе при понижении температуры на 1°/мин. Хранение клеточной линии происходит в жидком азоте при -196°С. Размораживание производится в водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания, определенная методом исключения трипанового синего и составляет 80%.

Контаминация. При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Пример 1. Культивирование клеточной линии МЕХ-73.

МЕХ-73 перевивается на самках и самцах мышей линии C57Bl/6 подкожным введением. Доза перевивки - 2×10⁵-5×10⁵ живых клеток в физиологическом растворе. Перевиваемость 100%. Средняя продолжительность жизни животных равна 21-31 день. При подкожной имплантации опухоль растет в виде солидного образования, при внутрибрюшинной - в виде множественных мелких узелков, выстилающих брюшную полость.