Результат интеллектуальной деятельности: Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, и может быть использовано для культивирования бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079, который составляет основу кормовой добавки «Энзимспорин».

Определенный набор питательных веществ необходим микроорганизмам для проявления их полезных свойств [1]. Для получения полноценного питания (азотистые соединения, углеводы, микро- и макроэлементы, другие биологически активные вещества) необходимо, на основании индивидуальных особенностей микроорганизмов, проводить исследования по подбору состава питательных сред [2]. Для повышения биологической активности микроорганизмов в настоящее время все чаще используют дешевые питательные среды, на их основе разрабатывают более совершенные технологии с целью значительного повышения продуктивности бактериальных культур. В состав питательной среды входят различные компоненты.

Неорганические соли используются в питательных средах как дополнительный источник N, Р, О, S, Н. Микроорганизмы лучше усваивают азот в восстановленной форме, остальные элементы - в окисленной форме. В качестве источника азота используют горох шлифованный по ГОСТ 6201-68. Однако, данных по использованию гороха шлифованного для приготовления сред для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 не найдено.

Для оптимизации питательной среды для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079, были выбраны следующие неорганические соли: фосфат калия и карбонат кальция и горох шлифованный.

Известна питательная среда [3] для культивирования Bacillus subtilis следующего состава (г/л):

фосфат калия однозамещенный - 0,2-0,4;

сульфат аммония - 1.0-3.0;

цитрат натрия - 1.0-3.0;

сернокислая медь - 0.001-0.01;

сернокислый цинк - 0.002-0.005;

сернокислое железо - 0.0001-0.001;

хлористый кальций - 0.09-0.2;

сернокислый магний - 0.1-0.5;

сернокислый марганец - 0.01-0.1;

пептон - 2.0-8.0;

мальтоза - 1.0-5.0;

вода - остальное

Недостатком данной среды является многокомпонентность.

Известна аналогичная питательная среда [4] для культивирования Bacillus subtilis следующего состава (г/л):

1. Пептон - 12.0;

2. Дрожжевой экстракт - 5.0;

3. Натрий хлористый - 5.0;

4. Вода водопроводная до 1 л;

5. Канамицин - 50 мг/л;

6. Агар-Агар - 20.0;

7. Вода водопроводная до 1 л

Питательную среду формируют в емкости в виде слоя, на который укладывают полупроницаемую мембрану, например, целлофановую пленку. Сверху на пленку наносят посевную дозу штамма бактерий. Культивирование осуществляют в термостате при температуре 34-37°С в течение 20-24 ч. Далее емкость переносят в термостат с температурой 6-10°С и выдерживают при этой температуре в течение суток до образования спор бактерий.

Недостатком данной среды является то, что в состав среды входит канамицин - антибиотический препарат группы аминогликозидов. Для его приобретения требуется оформление разрешающих документов. Так же используется трудоемкая технология посева микроорганизмов.

Недостатком данной среды является то, что, пересев культуры на твердой среде нужно осуществлять каждые 15, максимум 30 дней. Это требует затрат сред, реактивов, энергоресурсов и рабочего времени.

Целью предлагаемого изобретения является увеличение количества бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 и срока хранения культуры на твердой среде, посредством культивирования на жидкой и твердой (агаризованной) питательной среде. Поставленная цель достигается тем, что в питательную среду, содержащую питательную основу и дистиллированную воду, вносится несколько неорганических солей (карбонат кальция и фосфат калия) и горох шлифованный, предварительно обработанный.

В качестве исходного штамма использовали штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-12079, который представляет собой светло-коричневый сухой порошок из лиофильно высушенных бактерий штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-12079. Содержание спор составляет 5×10⁹ КОЕ/г. Навеску спор взвешивали в стерильных условиях на аналитических весах, погрешность которых составляет 0,0002 г.

Из спор готовили суспензию в колбу Эрленмейера объемом 50 мл, содержащую жидкую питательную среду, которую готовят при следующем соотношении компонентов (г/л): пептон ферментативный - 15, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 5, горох шлифованный, предварительно обработанный, в различных количествах, неорганическая соль в различных количествах (см. таблица 2), остальное - дистиллированная вода.

Для использования гороха шлифованного требуется его предварительная обработка. Горох шлифованный, в количестве 100 г/л промыть водопроводной водой, помесить во флакон емкостью 1 литр, и довести до литра дистиллированной водой. Закрыть флакон пробкой герметично. Затем автоклавировать в течении 1 часа при 2 Bar. После автоклавирования остудить до комнатной температуры и дважды процедить через два слоя марли. Полученный после обработки горох соединить с остальными компонентами среды и довести до 1 л дистиллированной водой. Значение рН 7,0-7,2. Стерилизация при 1,1 атм. в течение 45 мин. Полученная среда имеет светло-желтый цвет, «чистый» запах и незначительный осадок. Охлаждали до комнатной температуры.

Затем вносили 5 г спор. Микроорганизмы (штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-12079) выращивали в колбах с жидкой средой в шейкер-инкубаторе «Innova 44» при 250 об/мин (эксцентриситет 5 см) и температуре 37°С в течение 24 часов. Такие условия являются оптимальными для Bacillus subtilis. Для сохранения посевного материала и подсчета колоний, после культивирования на жидкой среде, осуществляли посев на твердую питательную среду, которую готовили при следующем соотношении компонентов: пептон ферментативный - 15, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 5, горох шлифованный, предварительно обработанный, в различных количествах, неорганическая соль в различных количествах (см таблица 1), агар - 18, остальное - дистиллированная вода. Значение рН 7,0-7,2. Стерилизация при 1,1 атм. в течение 40 мин. инкубированные производиться 24 ч, температура 37°С в термостате. Затем осуществляли хранение посевного материала в течение 3-5 месяцев при температуре + 4-8°С.

Для выявления количества микроорганизмов использовали стандартный метод десятикратных разведений, с высевом в стерильных условиях в чашки Петри на твердую питательную среду,

После чего чашки с посевами инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов. В качестве контрольной пробы проводилось культивирование на средах без добавления солей и гороха шлифованного, предварительно обработанного. Для достоверности все опыты были проведены в семикратной повторности. Для культивирования использовали питательные среды (табл. 2).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Влияние фосфата калия (K₃PO₄).

Данные культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 на средах, содержащих различные концентрации фосфата калия, представлены в таблице 3.

Из приведенных данных видно, что максимальный достоверный рост количества колоний Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 наблюдался в средах с содержанием фосфата калия 0,50 г/л соли. Дальнейшее увеличении концентрации не меняет численность микроорганизмов. Для удешевления среды используем минимальную концентрацию соли, которая дает увеличение численности. Добавление фосфата калия в концентрации 0,5 г/л достоверно увеличивает количество микроорганизмов относительно контроля.

Пример 2. Влияние карбоната кальция (СаСО₃).

Данные культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 на средах, содержащих карбонат кальция, представлены в таблице 4.

Добавление карбоната кальция в питательную среду в концентрации 1,0 г/л достоверно увеличивает количество микроорганизмов относительно контроля.

Пример 3. Влияние гороха шлифованного, предварительно обработанного.

Данные культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 в среде, содержащей, горох шлифованный, предварительно обработанный представлены в таблице 5.

При концентрации гороха шлифованного, предварительно обработанного в питательной среде 50 мл/л, наблюдалось увеличение количества колоний Bacillus subtilis ВКПМ В-12079. При дальнейшем увеличении концентрации численность колоний увеличивается, но твердая среда становится мутной от осадка гороха, что делает затруднительным просмотр колоний на среде. Таким образом, 50 мл/л является оптимальной концентрацией для работы со средой.

Пример 4. Влияние гороха шлифованного, предварительно обработанного, фосфата калия и карбоната кальция на численность микроорганизмов в процессе культивирования

Были выбраны концентрации выше перечисленных ингредиентов, которые максимально увеличивают численность бактерии и качество среды. Таким образом, увеличение количества Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 достигается внесением в питательную среду: 50 мл / гороха шлифованного, предварительно обработанного; 1,0 г/л карбоната кальция; 0,5 г/л фосфата калия. Наблюдаем синергетический эффект взаимодействия компонентов (табл. 6).

Хранение посевного материала на среде с добавление гороха шлифованного, предварительно обработанного, карбоната кальция и фосфата калия возможно в течении 3-4 месяца при температуре + 4-8°С.

Литература

Биотехнология. Под ред. А.А. Баева. М.: Наука, 1984. 309 с.

1. White A., Handler P., Smith Е.L. Principles of biochemistry. Baltimore: The Johns Hopkins University School of Medicine, 1974. 1051 p.

2. Леляк А.И., Костровский В.Г., Рязанкина О.И. и др. Способ получения бактериального препарата на основе Bacillus subtilis // Патент РФ №2105562, заявлено 14.06.1995, опубл. 27.02.1998.