СПОСОБЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ, ВКЛЮЧАЮЩИХ БИФИДОБАКТЕРИИ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение предоставляет способы приготовления ферментированных пищевых продуктов, включающих виды Bifidobacterium. Настоящее изобретение дополнительно предоставляет продукты, приготовленные при помощи этих способов, а также инокуляты, применяемые в этих способах.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В соответствии с определением, утвержденным в совместной консультации Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций/Всемирной организации здравоохранения (FAO/ВОЗ) по поводу полезных и питательных свойств порошкового молока с живыми кисломолочными бактериями, проведенной в 2001 году, пробиотики представляют собой «живые микроорганизмы, которые при введении в адекватном количестве обеспечивают благоприятное воздействие на здоровье реципиента». Пробиотики широко доступны в форме пищевых продуктов и добавок, включая ферментированные молочные продукты. Наиболее распространенные пробиотики в молочных продуктах представляют собой род Lactobacillus или род Bifidobacterium, несмотря на то, что также идентифицированы пробиотики рода Escherichia, Enterococcus, Bacillus, Propionibacterium и Saccharomyces.

Bifidobacterium в норме присутствуют в составе микробиоты кишечника и представляют собой одни из наиболее известных и хорошо описанных видов пробиотиков. Основными видами, присутствующими в толстом кишечнике человека, являются Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum ssp infantis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum. Бактерии рода Bifidobacteria широко применяются в имеющихся в продаже пробиотических пищевых продуктах, таких как ферментированные молочные продукты, включая сыр, йогурт, замороженный йогурт и ферментированное молоко.

Как определено в упомянутых ранее руководствах FAO/ВОЗ, пробиотики представляют собой живые бактерии. Более того, суточное потребление по меньшей мере от 10⁸ до 10⁹ жизнеспособных клеток рекомендуют в качестве минимальной дозы для обеспечения благоприятного эффекта (Silva et al, J. Appl. Microbiol. 97 (2004) 29-37). Следовательно, необходимо не только гарантировать наличие утвержденного количества пробиотика при приготовлении продукта, но также его поддержание в течение периода хранения продукта. Эти требования ставят задачи перед производителем пробиотических молочных продуктов, содержащих Bifidobacteria, поскольку Bifidobacteria обладают плохой протеолитической активностью и медленно растут в молоке. Более того, жизнеспособность Bifidobacteria в ферментированных молочных продуктах ограничена из чувствительностью к кислотному pH. Это имеет в частности отношение к йогуртовым продуктам, поскольку в таких продуктах может повышаться кислотность во время периода хранения, что описывается термином «пост-окисление»; что может влиять на жизнеспособность Bifidobacteria, соответственно. На выживаемость Bifidobacteria во время хранения также влияют другие факторы, такие как температура и содержание кислорода, а также содержание молочной и уксусной кислоты. И наконец, продемонстрировано, что рост Bifidobacteria ингибируется совместным культивированием с типичными заквасочными культурами, которые применяют при приготовлении ферментированных молочных продуктов, таких как йогурты.

Применение относительно высокого количества Bifidobacteria в инокуляте, а также стимуляторов роста, можно использовать для усиления размножения и поддержания пробиотических популяций. Стимуляторы роста, известные в области техники, включают дрожжевой экстракт, казеиновые гидролизаты, аминокислоты, а также другие микронутриенты и микроэлементы. Цистеин был раскрыт в качестве стимулятора роста и поддержания популяций Bifidobacterium в заявке на патент PCT/FR2006/001688, в то время как марганец был предложен в качестве стимулятора роста для Bifidobacterium animalis subsp. lactis штамма CHCC5445 в заявке на патент EP 2380446. В этой ЕР заявке было продемонстрировано, что марганец усиливает окисление/рост Bifidobacterium animalis subsp. lactis штамма CHCC5445 в молоке, но только при условии обогащения молока подходящим количеством пептидов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предоставляет способ приготовления ферментированного молочного продукта, включающий ферментацию смеси, включающей молоко, Bifidobacterium animalis subsp. animalis и/или Bifidobacterium breve, а также соединение марганца. Неожиданно в этой заявке раскрыто, что добавление соединения марганца способно стимулировать рост указанных подвидов Bifidobacterium в молоке, не требуя при этом обогащения пептидами.

Изобретение дополнительно предоставляет продукты, получаемые посредством этих способов, а также применения соединений марганца в культуре Bifidobacterium animalis subsp. animalis и/или Bifidobacterium breve.

В дополнение, вариант осуществления настоящего изобретения предоставляет инокулят для приготовления ферментированных молочных продуктов, включающий соединение марганца и Bifidobacterium из Bifidobacterium animalis subsp. animalis и/или Bifidobacterium breve.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Как применяют в этой заявке, термин «CNCM I-» с последующим номером, состоящим из четырех цифр, используют для обозначения штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, CNCM, Париж, Франция) в соответствии с Будапештской конвенцией под учетным номером, соответствующим указанному четырехзначному коду, например, CNCM I-4602 или CNCM I-4321.

Как применяют в этой заявке, термин «стабильная композиция» должен обозначать композицию, в которой не наблюдается выпадение осадка и/или отделение сыворотки.

Как применяют в этой заявке, термин «х% (мас./мас.)» эквивалентен «х г на 100 г».

Как применяют в этой заявке, термин «ферментированное молоко» должен обозначать продукт или композицию, полученную из молока путем окисляющего действия по меньшей мере одного вида молочнокислой бактерии.

Как применяют в этой заявке, термин «вязкий» должен обозначать твердое или полутвердое вещество, которое можно поглощать при помощи ложки или другого инструмента.

Как применяют в этой заявке, термин «ферментация» должен обозначать метаболизм вещества бактериями дрожжами или другими микроорганизмами.

Как применяют в этой заявке, термин «кое» или «КОЕ» должен представлять собой аббревиатуру термина «колониеобразующая единица».

Как применяют в этой заявке, термин «в свободной форме» должен обозначать отсутствие связи с другими аминокислотами при помощи пептидной связи в пептидах, полипептидах или белках.

Как применяют в этой заявке, указание на бактериальные штаммы или виды должно обозначать включение функционально эквивалентных бактерий, полученных из них, таких как, мутанты, вариантные или генетически измененные бактерии, не ограничиваясь ими. Эти мутанты или генетически измененные штаммы могут представлять собой штаммы, где один или более эндогенный (-ые) ген (-ы) родительского штамма мутировали, например, для изменений некоторых их метаболических свойств (например, способность ферментировать сахара, их резистентность кислотности, их выживаемость при прохождении желудочно-кишечного тракта, их пост-окислительные свойства или их продукция метаболитов). Они также могут представлять собой штаммы, полученные в результате генетического изменения родительского штамма для добавления одного или более гена (-ов), представляющих интерес, например, с целью добавления генетически измененным штаммам дополнительных физиологических свойств или для обеспечения экспрессии белков, представляющих терапевтический или профилактический интерес, который имеется желание осуществить при помощи данных штаммов. Эти мутанты или генетически измененные штаммы можно получить из родительского штамма при помощи стандартных техник для случайного или сайт-направленного мутагенеза и генетического изменения бактерии, или при помощи способов техники, известных как «геномный шаффлинг». В настоящем тексте штаммы, мутанты и варианты, полученные от родительских видов или штамма, считаются включенными посредством ссылки в указанные родительские виды или штамм, например, следует считать, что фразы «Bifidobacterium animalis subsp. animalis» и «штамм CNCM I-4602» включают штаммы, мутанты и варианты, полученные из них.

Как применяют в этой заявке, термин «дрожжевой экстракт» должен обозначать концентраты растворимых соединений дрожжевых клеток. В этом отношении можно дать ссылку в частности на статью «Yeast extracts: production, properties and components», написанную Rolf Sommer (9th International Symposium on Yeasts), из которой взята информация, приведенная далее.

Дрожжевые экстракты в основном получают путем аутолиза, т.е., гидролиза клетки, который проводится без добавления других энзимов. Дрожжевой экстракт или дрожжевой аутолизат используют в основном в производстве ферментных препаратов, а также в промышленности переработки сельскохозяйственной продукции. Основное сырье, которое используют для получения дрожжевого экстракта, составляют дрожжи с высокой концентрацией белков (штаммы Saccharomyces cerevisiae), культивируемые на средах на основе мелассы, или дрожжи, полученные из пива, из которого удалили горечь (штаммы Saccharomyces cerevisiae или Saccharomyces uvarum). Другое используемое сырье составляют дрожжи, такие как Kluyveromyces fragilis (ферментированные на молочной сыворотке) или Candida utilis (культивированные на отходах, богатых углеводами, полученных из лесозаготовительной промышленности, или на этаноле) или также специальные штаммы хлебопекарских дрожжей, которые применяют с целью получения дрожжевого экстракта, содержащего 5'-нуклеотиды.

Способы приготовления дрожжевого экстракта известны в области техники, аутолиз представляет собой процесс диссоциации, наиболее часто применяемый для производства. Во время этого процесса дрожжи разрушаются своими эндогенными энзимами. Процесс аутолиза можно инициировать при помощи осмотического шока или контролируемой температуры, что вызовет гибель клетки без активации эндогенных энзимов (в частности протеаз). Температура, контролируемое значение pH и продолжительность аутолиза являются определяющими факторами в стандартизированном процессе аутолиза. Путем добавления солей или энзимов (например, протеаз или смеси протеаз и пептидаз) по аналогии со «стандартным» аутолизом можно контролировать деградацию белка дрожжевых клеток.

В качестве альтернативы аутолизу, дрожжевой экстракт можно получать путем термолиза (например, путем кипячения дрожжей в воде при 100°C), плазмолиза (обработки концентрированными растворами хлорида натрия при температуре ниже 100°C) и механической деградации (гомогенизация под действием высокого давления или измельчение). Растворимые соединения отделяют от нерастворимых клеточных стенок и концентрируют при помощи испарительного аппарата с перемешиванием или при помощи испарителя с падающими пленками с последующими опциональными стадиями фильтрации, концентрации под действием частичного вакуума и быстрой стерилизации.

Способы изобретения

Настоящее изобретение предоставляет способ приготовления ферментированного молочного продукта, включающий следующие стадии:

i) предоставления смеси, включающей:

a) молоко

b) по меньшей мере один вид бактерий, включающий по меньшей мере один вид Bifidobacteria, выбираемый из группы, состоящей из Bifidobacterium animalis subsp. animalis и Bifidobacterium breve,

c) соединение марганца

ii) ферментации этой смеси для предоставления ферментированного молочного продукта.

Следует понимать, что соединение марганца из пункта ii) относится к марганцу, который находится вне клетки Bifidobacteria, т.е., не входит в клетку Bifidobacteria. Предпочтительно смесь включает по меньшей мере приблизительно 30% (мас./мас.) молока, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50% (мас./мас.) молока и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70% (мас./мас.) молока. Предпочтительно указанное молоко является растительным и/или животным молоком, более предпочтительно соевым, миндальным, овсяным, конопляным, кокосовым, рисовым, козьим, овечьим, верблюжьим, молоком кобылиц или коровьим молоком, и наиболее предпочтительно является коровьим молоком. Предпочтительно указанное молоко (виды молока) подвергаются тепловой обработке, обычно пастеризуются, для обеспечения стерильности. Предпочтительно эта обработка производится перед приготовлением ферментированного молочного продукта.

Предпочтительно указанная смесь включает один или более видов обезжиренного, частично обезжиренного молока или молока нормальной жирности. Предпочтительно это молоко или виды молока могут находиться жидкой форме, в форме порошка и/или в концентрированной форме. В одном варианте осуществления эта смесь дополнительно включает сливки. В одном варианте осуществления это молоко или виды молока могут быть обогащены или усилены дополнительными молочными компонентами или другими питательными веществами, такими как витамины, минералы, микроэлементы или другие микронутриенты, не ограничиваясь ими.

Соединение марганца может представлять собой любое подобное соединение, подходящее для употребления животным или человеком, которое утилизируется бифидобактериями. Обычно соединение марганца может представлять собой марганцевую соль или раствор. В частности является предпочтительным, чтобы соединение марганца представляло собой марганцевую соль, такую как ацетат, карбонат, хлорид, растворимый цитрат, глюконат, ортофосфат, двухосновный фосфат, сульфат или оксид. В частности является предпочтительным, чтобы соединение марганца представляло собой MnCl₂ и/или MnSO₄.

Предпочтительно количество соединения марганца в этой смеси i) находится между приблизительно 1 и 100 мг/л, более предпочтительно между приблизительно 5 и 65 мг/л. Предпочтительно количество соединения марганца в этой смеси предпочтительно составляет по меньшей мере 1 мг/л, 5 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л, 25 мг/л, 30 мг/л, 35 мг/л, 40 мг/л, 45 мг/л, 50 мг/л, 55 мг/л, 60 мг/л, 65 мг/л или больше.

Предпочтительно количество Bifidobacteria в этой смеси i) составляет 10⁶ -10⁸ кое/г, более предпочтительно 10⁶ -10⁷ кое/г. В одном варианте осуществления Bifidobacterium представляет собой Bifidobacterium animalis subsp. animalis, предпочтительно штамм CNCM I-4602. В альтернативном варианте осуществления Bifidobacterium представляет собой Bifidobacterium Breve, предпочтительно штамм CNCM I-4321.

В частности является предпочтительным, чтобы ферментированное молоко в соответствии с изобретением было получено путем окислительного действия по меньшей мере одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или более штаммов молочнокислых бактерий. Соответственно в одном варианте осуществления смесь i) дополнительно включает по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или более штаммов молочнокислых бактерий.

Выбор подходящих штаммов молочнокислых бактерий находится в компетенции специалиста в области техники, и обычно они представляют собой термофильные молочнокислые бактерии. Примеры молочнокислых бактерий, которые можно применять, включают без ограничений Lactobacilli (например, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbruckei, в частности L. delbruckei subsp bulgaricus или lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus); Streptococci (например, Streptococcus thermophilus); Lactococci (например, Lactococcus lactis, typically Lactococcus lactis subsp. lactis или Lactococcus lactis subsp. cremoris). Обычно можно применять смесь или объединение множества видов молочнокислых бактерий, обычно смесь или объединение лактобактерий (Lactobacillus) и стрептококков (Streptococcus). Для приготовления йогурта обычно используют Lactobacillus bulgaricus (также называемую Lactobacillus delbruckei subsp. bulgaricus) и Streptococcus thermophilus, опционально с дополнительными микроорганизмами, которые представляют собой без ограничений пробиотические виды или другие виды, которые могут обеспечить желаемые органолептические и другие свойства композиции, например, Lactococcus lactis.

В дополнительном варианте осуществления молочнокислые бактерии могут дополнительно включать пробиотические бактерии. Пробиотические бактерии известны специалисту в области техники. Примеры пробиотических бактерий включают некоторые Bifidobacteria и Lactobacilli, такие как Bifidobacterium brevis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus easel paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii, Lactobacillus brevis и Lactobacillus fermentum.

Соответственно, в одном варианте осуществления смесь i) дополнительно включает множество видов молочнокислых бактерий, включающих либо один, либо оба вида Streptococcus thermophilus и/или Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. В дополнительном варианте осуществления смесь i) дополнительно включает множество видов молочнокислых бактерий, включающих Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Lactococcus lactis.

Предпочтительно общее количество молочнокислых бактерий в этой смеси i) составляет приблизительно 10⁶ -10⁸ кое/г, более предпочтительно приблизительно 10⁶ -10⁷ кое/г. Предпочтительно количество Lactobacillus bulgaricus в этой смеси i) составляет приблизительно 10^6-10⁸ кое/г, более предпочтительно приблизительно 10^6-10⁷ кое/г. Предпочтительно количество Streptococcus thermophilus в этой смеси i) составляет приблизительно 10^6-10⁸ кое/г, более предпочтительно приблизительно 10^6-10⁷ кое/г.

Способы приготовления ферментированных молочных продуктов, таких как йогурты или аналогичные им продукты, хорошо известны в области техники. Обычно ферментированный молочный продукт изготавливают путем культивирования молока при подходящей температуре с подходящими микроорганизмами для обеспечения снижения величины pH, предпочтительно до pH равной или менее 5, предпочтительно между приблизительно 3 и 4,5; более предпочтительно между приблизительно 3,5 и приблизительно от 4,5. Величину pH можно корректировать, контролируя ферментацию микроорганизмом и останавливая ее в нужный момент, например, путем охлаждения.

Подходящие температуры для ферментации молока обычно составляют от приблизительно 36°C до приблизительно 44°C, и температуру поддерживают на протяжении периода инкубации, достаточного для обеспечения желаемого уменьшения величины pH.

Для приготовления ферментированного молочного продукта температура в начале ферментации обычно составляет от приблизительно 36°C до приблизительно 43°C, в частности от приблизительно 37°C до приблизительно 40°C, температура в конце ферментации обычно составляет от приблизительно 37°C до приблизительно 44°C, в частности от приблизительно 38°C до приблизительно 41°C. Период ферментации обычно составляет от приблизительно 6 до приблизительно 11 часов.

Далее после ферментации ферментированное молоко охлаждают. Опционально стадию промежуточного охлаждения ферментированного молока можно проводить для предоставления предварительно охлажденного ферментированного молока, имеющего температуру от приблизительно 22°C до приблизительно 4°C. Обычно время промежуточного охлаждения составляет от приблизительно 1 часа до приблизительно 4 часов, в частности от приблизительно 1 часа 30 минут до приблизительно 2 часов. Предварительно охлажденное ферментированное молоко обычно хранят до 40 часов или меньше.

Предпочтительно стадия конечного охлаждения ферментированного молока проводится таким образом, что температура в начале стадии конечного охлаждения составляет менее 22°C, а температура в конце стадии конечного охлаждения составляет от приблизительно 4°C до приблизительно 10°C. Охлажденный продукт можно затем хранить, транспортировать и/или распространять при температуре от приблизительно 1°C до приблизительно 10°C в течение по меньшей мере приблизительно 30 дней, по меньшей мере приблизительно 60 дней или по меньшей мере приблизительно 90 дней.

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления способ приготовления ферментированного молочного продукта, как определено ранее, опционально включает стадию перемешивания при давлении по меньшей мере 20 бар или проведения динамического сглаживания для получения композиции, имеющей желаемую вязкость, обычно вязкость до 20 мПа⋅с. Процедуры перемешивания или динамического сглаживания обеспечивают некоторый сдвиг композиции, который обычно обеспечивает уменьшение вязкости. Такие процедуры известны специалистам в области техники и могут осуществляться при помощи стандартного подходящего оборудования. Эту стадию обычно проводят при низкой температуре, например, при температуре от 1°C до 20°C.

Не будучи связанными какой-либо теорией, авторы изобретения считают, что применение некоторого сдвига при низкой температуре, обычно путем перемешивания при высоком давлении или путем проведения динамического сглаживания, может привести к образованию жидкого геля в композиции, что обеспечивает улучшенную стабильность даже при низкой вязкости до 20 мПа⋅с.

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления способ приготовления ферментированного молочного продукта, как определено ранее, опционально включает стадию добавления промежуточного состава до или после стадии ферментации ii), где этот промежуточный состав включает состав из фруктов и/или злаков и/или добавок, таких как ароматизаторы и/или красители. Этот промежуточный состав может в частности содержать загустители (растворимые и нерастворимые волокна, альгинаты, каррагенаны, ксантановую камедь, пектин, крахмал, в частности желатинизированный, геллановую камедь, целлюлозу и ее производные, гуаровую камедь и камедь рожкового дерева, инулин) или подсластители (аспартам, ацесульфам калия, сахарин, сукралозу, цикламат) или консерванты. Примеры ароматизаторов включают без ограничений яблочный, апельсиновый, клубничный, киви-, какао-ароматизаторы и т.д. Примеры красителей включают без ограничений бета-каротин, кармин, кошенильный красный. Более того, состав вышеуказанных фруктов может включать фрукты целиком или в кусочках или в виде желе или джема, что делает возможным, например, получение фруктовых йогуртов. Промежуточный состав также может содержать растительные экстракты (соя, рис и т.д.).

Предпочтительно ферментированный молочный продукт в соответствии с изобретением включает до приблизительно 30% (мас./мас.) этого промежуточного состава, например, до приблизительно 10%, 15%, 20%, 25% (мас./мас.).

Продукт опционально упаковывают в герметичный или герметично закрывающийся контейнер, содержащий приблизительно 50 г, 60 г, 70 г, 75 г, 80 г, 85 г, 90 г, 95 г, 100 г, 105 г, 110 г, 115 г, 120 г, 125 г, 130 г, 135 г, 140 г, 145 г, 150 г, 200 г, 300 г, 320 г или 500 г, или приблизительно 1 унцию, 2 унции, 3 унции, 4 унции, 5 унций, 6 унций или 12 унций продукта по весу. Герметизацию можно осуществлять, например, при помощи колпачка или крышки. Продукт может быть упакован либо до, либо после стадии ферментации ii). Соответственно, в одном варианте осуществления изобретение предоставляет способ изобретения, где смесь i) упаковывают до стадии ферментации ii). В альтернативном варианте осуществления упаковывают молоко, ферментированное на стадии ii).

В одном варианте осуществления изобретение предоставляет способ изобретения, где смесь i) дополнительно включает серосодержащую аминокислоту и/или дрожжевой экстракт.

Серосодержащая аминокислота предпочтительно представляет собой цистеин (L-цистеин) или метионин, а также их производные, опционально в форме соли. Обычно серосодержащая аминокислота может представлять собой моногидратированный L-цистеин гидрохлорид (моногидратированный моногидрохлорид (R)-2-амино-меркаптопропионовой кислоты) или L-метионин ((S)-2-амино-4-метилтиомасляная кислота). Предпочтительно серосодержащие аминокислоты в соответствии с изобретением применяют в восстановленной форме, т.е. сульфгидрильная группа -SH является восстановленной. Предпочтительная форма серосодержащих аминокислот, таким образом, исключает в частности цистин, окисленную форму цистеина, представляющую соединение двух цистеинов при помощи дисульфидного мостика.

Дрожжевой экстракт может находиться в форме жидкого дрожжевого экстракта (сухое вещество: от 50 до 65%); вязкого пастообразного дрожжевого экстракта (сухое вещество: от 70 до 80%); сухого порошка дрожжевого экстракта. Обычно дрожжевой экстракт, подходящий для применения в процессах ферментации, может иметь содержание белков 75%-75%, содержание натрия менее 0,5%, содержание полисахаридов менее 5%, содержание олигосахаридов менее 1% и содержание липидов менее 0,5%. Обычно содержание белков в дрожжевом экстракте, подходящее для применения в ферментации, может составлять приблизительно 35-40% свободных аминокислот; 10-15% ди-, три- и тетрапептидов (молекулярная масса < 600 Да), 40-45% олигопептидов (молекулярная масса 2000-3000 Да); 2-5% олигопептидов (молекулярная масса 3000-100000 Да).

Предпочтительно количество цистеина в этой смеси i) находится между приблизительно 1 и 100 мг/л, более предпочтительно между 5 и 75 мг/л. Предпочтительно количество дрожжевого экстракта в этой смеси i) составляет до приблизительно 0,5%.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет применение соединения марганца в культуре с по меньшей мере одним видом Bifidobacteria, включающим по меньшей мере один вид Bifidobacterium, выбираемый из группы, состоящей из Bifidobacterium animalis subsp. animalis и Bifidobacterium breve. Обычно количество применяемого соединения марганца находится между приблизительно 1 и 100 мг/л культуральной среды, более предпочтительно между приблизительно 5 и 65 мг/л, соответственно количество применяемого соединения марганца составляет по меньшей мере приблизительно 1 мг/л, 5 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л, 25 мг/л, 30 мг/л, 35 мг/л, 40 мг/л, 45 мг/л, 50 мг/л, 55 мг/л, 60 мг/л, 65 мг/л или больше.

В частности является предпочтительным, чтобы соединение марганца представляло собой марганцевую соль, обычно MnCl₂ и/или MnSO₄. Предпочтительно количество применяемых Bifidobacteria составляет приблизительно 10^6-10⁸ кое/г культуральной среды, более предпочтительно 10^6-10⁷ кое/г. В одном варианте осуществления Bifidobacteria представляют собой Bifidobacterium animalis subsp. animalis, предпочтительно штамм CNCM I-4602. В альтернативном варианте осуществления Bifidobacteria представляют собой Bifidobacterium Breve, предпочтительно штамм CNCM I-4321.

Инокулят изобретения

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет инокулят для приготовления ферментированных молочных продуктов, включающий:

i) по меньшей мере один вид бактерий, включающий по меньшей мере один вид Bifidobacteria, выбираемый из группы, состоящей из Bifidobacterium animalis subsp. animalis и Bifidobacterium breve, и,

ii) соединение марганца.

Следует понимать, что соединение марганца ii) относится к марганцу, который находится вне клетки Bifidobacteria, т.е., не входит в клетку Bifidobacteria.

Инокулят изобретения подходит для прямой инокуляции по меньшей мере одного штамма Bifidobacteria в молоке для предоставления ферментированных молочных продуктов изобретения.

В одном варианте изобретения i) и ii) могут быть предоставлены в виде смеси. В альтернативном варианте осуществления i) и ii) предоставлены в виде составного набора.

Инокулят или бактерии из него предпочтительно являются свежими, замороженными или лиофилизированными. Инокулят может быть в жидкой, сухой, высушенной распылением или в твердой форме. В частности предпочтительно, чтобы инокулят находился в жидкой форме. Обычно инокулят предоставляют в молочную смесь в количествах до приблизительно 500 мг/л.

Соединение марганца может представлять собой любое подходящее соединение для употребления животным или человеком, и которое могут утилизировать бифидобактерии. Обычно соединение марганца может представлять собой марганцевую соль или раствор. В частности предпочтительно, чтобы соединение марганца могло представлять собой марганцевую соль или раствор. В частности является предпочтительным, чтобы соединение марганца представляло собой марганцевую соль, такую как ацетат, карбонат, хлорид, растворимый цитрат, глюконат, ортофосфат, двухосновный фосфат, сульфат или оксид. В частности является предпочтительным, чтобы соединение марганца представляло собой MnCl₂ и/или MnSO₄.

Предпочтительно количество марганцевого соединения в указанном инокуляте i) составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 1%, 5%, 10% или более (мас./мас.). Обычно между приблизительно 0,1 и 20% (мас./мас.), более предпочтительно между приблизительно 1 и 13% (мас./мас.).

Предпочтительно количество Bifidobacteria в этом инокуляте i) составляет приблизительно 10^10-10¹¹ кое/г или приблизительно 10^10-10¹¹ кое/мл, когда инокулят предоставляется в жидкой форме. В одном варианте осуществления Bifidobacteria представляют собой Bifidobacterium animalis subsp. animalis, предпочтительно штамм CNCM I-4602. В альтернативном варианте осуществления Bifidobacteria представляют собой Bifidobacterium Breve, предпочтительно штамм CNCM I-4321.

В дополнительном варианте осуществления инокулят дополнительно включает по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или более штаммов молочнокислых бактерий. Выбор подходящих молочнокислых бактерий находится в компетенции специалиста, и они обычно представляют собой термофильные молочнокислые бактерии. Примеры молочнокислых бактерий, которые можно применять, включают без ограничений Lactobacilli (например, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbruckei, в частности L. delbruckei supsb. bulgaricus или lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus); Streptococci (например, Streptococcus thermophilus); Lactococci (например, Lactococcus lactis, обычно Lactococcus lactis subsp. lactis или Lactococcus lactis subsp. cremoris). Обычно можно применять смесь или объединение множества видов молочнокислых бактерий, обычно смесь или объединение лактобактерий (Lactobacillus) и стрептококков (Streptococcus). Для приготовления йогурта обычно используют Lactobacillus bulgaricus (также называемую Lactobacillus delbruckei subsp. bulgaricus) и Streptococcus thermophilus, опционально с дополнительными микроорганизмами, такими как пробиотические виды или другие виды без ограничений, которые могут обеспечить желаемые органолептические и другие свойства композиции, например, Lactococcus lactis.

В предпочтительном варианте осуществления инокулят дополнительно включает множество видов молочнокислых бактерий, включающих либо один, либо оба вида Streptococcus thermophilus и/или Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. В альтернативном варианте осуществления инокулят дополнительно включает множество видов молочнокислых бактерий, включающих Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Lactococcus lactis.

В дополнительном варианте осуществления изобретение предоставляет инокулят, дополнительно включающий iii) серосодержащую аминокислоту и/или дрожжевой экстракт.

Серосодержащая аминокислота предпочтительно представляет собой цистеин (L-цистеин) или метионин, а также их производные, опционально в форме соли. Обычно серосодержащая аминокислота может представлять собой моногидратированный L-цистеин гидрохлорид (моногидратированный моногидрохлорид (R)-2-амино-меркаптопропионовой кислоты) или L-метионин ((S)-2-амино-4-метилтиомасляная кислота). Предпочтительно серосодержащие аминокислоты в соответствии с изобретением применяют в восстановленной форме, т.е. сульфгидрильная группа -SH является восстановленной. Эта предпочтительная форма серосодержащих аминокислот, таким образом, исключает в частности цистин, окисленную форму цистеина, представляющую соединение двух цистеинов при помощи дисульфидного мостика.

Дрожжевой экстракт может быть в форме жидкого дрожжевого экстракта (сухое вещество: от 50 до 65%); вязкого пастообразного дрожжевого экстракта (сухое вещество: от 70 до 80%); сухого порошка дрожжевого экстракта. Обычно дрожжевой экстракт, подходящий для применения в процессах ферментации, может иметь содержание белков 75%-75%, содержание натрия менее 0,5%, содержание полисахаридов менее 5%, содержание олигосахаридов менее 1% и содержание липидов менее 0,5%. Обычно содержание белков в дрожжевом экстракте, подходящее для применения в ферментации, может составлять приблизительно 35-40% свободных аминокислот; 10-15% ди-, три- и тетрапептидов (молекулярная масса < 600 Да), 40-45% олигопептидов (молекулярная масса 2000-3000 Да); 2-5% олигопептидов (молекулярная масса 3000-100000 Да).

Наборы

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет набор (т.е., готовое изделие) для приготовления ферментированных молочных продуктов, состоящий из:

i) Емкости, содержащей по меньшей мере один вид бактерий, включающих по меньшей мере один вид Bifidobacteria, выбираемый из группы, состоящей из Bifidobacterium animalis subsp. animalis и Bifidobacterium breve, и,

ii) Емкости, содержащей соединение марганца.

Опционально набор дополнительно включает цистеин, дрожжевой экстракт и/или молочнокислые бактерии.

Соответственно, набор опционально дополнительно включает iiia) Емкость, содержащую серосодержащую аминокислоту. Набор опционально включает iiib) Емкость, содержащую дрожжевой экстракт.

Серосодержащая аминокислота предпочтительно представляет собой цистеин (L-цистеин) или метионин, а также их производные, опционально в форме соли. Обычно серосодержащая аминокислота может представлять собой моногидратированный L-цистеин гидрохлорид (моногидратированный моногидрохлорид (R)-2-амино-меркаптопропионовой кислоты) или L-метионин ((S)-2-амино-4-метилтиомасляная кислота). Предпочтительно серосодержащие аминокислоты в соответствии с изобретением применяют в восстановленной форме, т.е. сульфгидрильная группа -SH является восстановленной. Эта предпочтительная форма серосодержащих аминокислот, таким образом, исключает в частности цистин, окисленную форму цистеина, представляющую соединение двух цистеинов при помощи дисульфидного мостика.

Дрожжевой экстракт может находиться в форме жидкого дрожжевого экстракта (сухое вещество: от 50 до 65%); вязкого пастообразного дрожжевого экстракта (сухое вещество: от 70 до 80%); сухого порошка дрожжевого экстракта. Обычно дрожжевой экстракт, подходящий для применения в процессах ферментации, может иметь содержание белков 75%-75%, содержание натрия менее 0,5%, содержание полисахаридов менее 5%, содержание олигосахаридов менее 1% и содержание липидов менее 0,5%. Обычно содержание белков в дрожжевом экстракте, подходящее для применения в ферментации, может составлять приблизительно 35-40% свободных аминокислот; 10-15% ди-, три- и тетрапептидов (молекулярная масса < 600 Да), 40-45% олигопептидов (молекулярная масса 2000-3000 Да); 2-5% олигопептидов (молекулярная масса 3000-100000 Да).

Набор опционально дополнительно включает iiic) Емкость, содержащую по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или более штаммов молочнокислых бактерий. Выбор подходящих штаммов молочнокислых бактерий находится в компетенции специалиста, и они обычно представляют собой термофильные молочнокислые бактерии. Примеры молочнокислых бактерий, которые можно применять, включают без ограничений Lactobacilli (например, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbruckei, в частности L. delbruckei supsb. bulgaricus или lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus); Streptococci (например, Streptococcus thermophilus); Lactococci (например, Lactococcus lactis, обычно Lactococcus lactis subsp. lactis или Lactococcus lactis subsp. cremoris). Обычно можно применять смесь или объединение множества видов молочнокислых бактерий, обычно смесь или объединение лактобактерий (Lactobacillus) и стрептококков (Streptococcus). Для приготовления йогурта обычно используют Lactobacillus bulgaricus (также называемую Lactobacillus delbruckei subsp. bulgaricus) и Streptococcus thermophilus, опционально с дополнительными микроорганизмами, такими как пробиотические виды или другие виды без ограничений, которые могут обеспечить желаемые органолептические и другие свойства композиции, например, Lactococcus lactis.

В предпочтительном варианте осуществления эти молочнокислые бактерии включают либо один, либо оба вида Streptococcus thermophilus и/или Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. В альтернативном варианте осуществления эти молочнокислые бактерии включают множество видов молочнокислых бактерий, включающих Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Lactococcus lactis.

Опционально составной набор может дополнительно включать инструкции для применения i) и ii) с целью приготовления ферментированных молочных продуктов.

Ферментированные молочные продукты изобретения

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет ферментированные молочные продукты, получаемые посредством способов изобретения или изготавливаемых при помощи инокулята изобретения. Продукт в соответствии с изобретением является подходящим для употребления или приема, предпочтительно внутрь. Соответственно препарат включает или состоит из съедобного вещества. В частности является предпочтительным, чтобы продукты изобретения практически не содержали патогенных или токсикогенных веществ. Продукт в соответствии с изобретением может представлять собой фармацевтический препарат, питательный продукт и/или пищевой продукт.

Предпочтительно ферментированный молочный продукт включает, преимущественно включает или состоит из молока, которое подвергается тепловой обработке, эквивалентной по меньшей мере пастеризации, предпочтительно эта тепловая обработка проводится перед приготовлением ферментированного молочного продукта.

Обычно молоко пастеризуют при помощи следующих последовательных стадий:

1) стадии стандартизации жировых веществ сырого материала для получения стандартизированного вещества,

2) стадии обогащения стандартизированного вещества, полученного в предыдущей стадии, сухим веществом, для получения обогащенного вещества,

3) стадии предварительного нагревания вещества, полученного в предыдущей стадии, для получения исходного вещества,

4) стадии пастеризации и выдержки исходного вещества, полученного в предыдущей стадии, для получения пастеризованного и выдержанного вещества,

5) опционально стадии гомогенизации пастеризованного и выдержанного вещества, полученного в предыдущей стадии, для получения пастеризованного, выдержанного и опционально гомогенизированного вещества,

6) стадии начального охлаждения пастеризованного, выдержанного и гомогенизированного вещества, полученного в предыдущей стадии, для получения пастеризованного исходного вещества, которое было выдержано, опционально гомогенизировано и охлаждено.

Как применяют в этой заявке, термин «стандартизация жировых веществ» обозначает стадию приведения количества жиров, присутствующих в исходном веществе, к предварительно определенному уровню. Обогащение сухим веществом включает добавление белков и жировых веществ с целью модификации плотности закваски.

Как применяют в этой заявке, термин «выдержка» обозначает быструю термизацию молока и делает возможным уничтожение вегетативной микрофлоры, включая патогенные формы бактерий. Обычно продолжительность составляет от 4 до 10 минут, в частности от 5 до 8 минут и в частности составляет приблизительно 6 минут.

Как применяют в этой заявке, термин «гомогенизация» обозначает дисперсию жировых веществ в молокоподобном веществе с образованием небольших жировых частиц. Гомогенизацию проводят, например, при давлении от 100 до 280 бар, в частности от 100 до 250 бар, в частности от 100 до 200 бар, в частности приблизительно при 200 бар. Эта стадия гомогенизации является полностью опциональной. В частности она отсутствует в процессе приготовления продуктов с 0% содержанием жировых веществ.

Предпочтительно ферментированный молочный продукт включает в количестве больше приблизительно 0,3 г на 100 г по весу свободной молочной кислоты, более предпочтительно больше приблизительно 0,7 г или 0,6 г на 100 г по весу свободной молочной кислоты. Предпочтительно ферментированный молочный продукт включает содержание белков, по меньшей мере эквивалентное таковому в молоке или видах молока, из которых он получен, предпочтительно в количестве по меньшей мере приблизительно 2,5%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 3% или 3,5% (мас./мас.). Предпочтительно ферментированный молочный продукт имеет pH, равный 5 или меньше, предпочтительно в диапазоне между приблизительно 3 и приблизительно 4,5, и более предпочтительно между приблизительно 3,5 и приблизительно 4,5.

Предпочтительно ферментированный молочный продукт имеет вязкость менее 200 мПа⋅с, более предпочтительно менее 100 мПа⋅с и наиболее предпочтительно менее 60 мПа⋅с при 10°C и скорости сдвига 64 с^-1. Ферментированный молочный продукт в соответствии с изобретением предпочтительно представляет собой продукт, выбираемый из группы, включающий йогурт, йогурт термостатного производства, йогурт с нарушенным сгустком, жидкий йогурт, йогуртовый напиток, замороженный йогурт, кефир, пахту, творог, сметану, молодой сыр и сыр. В одном варианте осуществления ферментированный молочный продукт в соответствии с изобретением представляет собой питьевой ферментированный молочный продукт, более предпочтительно ферментированный молочный напиток, такой как йогуртовый напиток, кефир и т.д. без ограничений. В альтернативном варианте осуществления молочный продукт в соответствии с изобретением представляет собой ферментированный молочный продукт, который является вязким, такой как йогурт термостатного производства или йогурт с нарушенным сгустком или их аналоги.

Предпочтительно ферментированный молочный продукт в соответствии с изобретением можно хранить, транспортировать и/или распространять при температуре от 1°C до 10°C в течение по меньшей мере приблизительно 30 дней, по меньшей мере приблизительно 60 дней или по меньшей мере приблизительно 90 дней с момента упаковки, при которых продукт останется подходящим для употребления.

Предпочтительно ферментированный молочный продукт включает по меньшей мере 10⁶, более предпочтительно по меньшей мере 10⁷ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий рода Bifidobacteria в соответствии с изобретением на грамм (г) продукта в соответствии с изобретением. Предпочтительно также продукт в соответствии с изобретением включает по меньшей мере приблизительно 10¹¹, более предпочтительно по меньшей мере 10¹⁰ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий рода Bifidobacteria в соответствии с изобретением на грамм (г) продукта в соответствии с изобретением. В одном варианте осуществления Bifidobacteria представляют собой Bifidobacterium animalis subsp. animalis, предпочтительно штамм CNCM I-4602. В альтернативном варианте осуществления Bifidobacteria представляют собой Bifidobacterium Breve, предпочтительно штамм CNCM I-4321.

Предпочтительно ферментированный молочный продукт представляет собой упакованный продукт, который включает по меньшей мере 10⁶, более предпочтительно по меньшей мере 10⁷ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий рода Bifidobacteria в соответствии с изобретением на грамм (г) продукта в соответствии с изобретением в результате хранения, транспортировки и/или распространения при температуре от 1°C до 10°C в течение по меньшей мере приблизительно 30 дней, по меньшей мере приблизительно 60 дней или по меньшей мере приблизительно 90 дней с момента упаковки.

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления ферментированный молочный продукт дополнительно включает промежуточный состав, включающий состав из фруктов и/или злаков и/или добавок, таких как ароматизаторы и/или красители. Этот промежуточный состав может в частности содержать загустители (растворимые и нерастворимые волокна, альгинаты, каррагенаны, ксантановую камедь, пектин, крахмал, в частности желатинизированный, геллановую камедь, целлюлозу и ее производные, гуаровую камедь и камедь рожкового дерева, инулин) или подсластители (аспартам, ацесульфам калия, сахарин, сукралозу, цикламат) или консерванты. Примеры ароматизаторов включают без ограничений яблочный, апельсиновый, клубничный, киви-, какао-ароматизаторы и т.д. Примеры красителей включают без ограничений бета-каротин, кармин, кошенильный красный. Более того, состав вышеуказанных фруктов может включать фрукты целиком или в кусочках или в виде желе или джема, что делает возможным, например, получение фруктовых йогуртов. Предпочтительно ферментированный молочный продукт в соответствии с изобретением включает до приблизительно 30% (мас./мас.) этого промежуточного состава, например, до приблизительно 10%, 15%, 20%, 25% (мас./мас.).

Предпочтительно ферментированный молочный продукт в соответствии с изобретением предоставляется в герметичном или герметично закрывающемся контейнере, содержащем приблизительно 50 г, 60 г, 70 г, 75 г, 80 г, 85 г, 90 г, 95 г, 100 г, 105 г, 110 г, 115 г, 120 г, 125 г, 130 г, 135 г, 140 г, 145 г, 150 г, 200 г, 300 г, 320 г или 500 г, или приблизительно 1 унцию, 2 унции, 3 унции, 4 унции, 5 унций, 6 унций или 12 унций продукта по весу.

ПРИМЕРЫ

Целью настоящих экспериментов являлось определение действия обогащения марганцем на ферментацию молока бифидобактериями.

Материалы и методы

Восстановленное молоко изготавливают путем смешивания 112 г сухого обезжиренного молока (Arla Foods) с литром смягченной воды. Моногидрат сульфата марганца (II) (MnSO₄) и моногидрат L-цистеин гидрохлорида предоставляет компания Sigma-Aldrich. Дрожжевой экстракт предоставляет компания AES laboratoire. Молочная среду подвергают автоклавированию при 115°C в течение 15 минут перед инокуляцией.

Штаммы бифидобактерий предоставлены в замороженном виде. Bifidobacterium animalis subsp. animalis CNCM I-4602 и Bifidobacterium breve CNCM I-4321 предоставлена компанией Danone. Bifidobacterium animalis subsp. lactis ʺBB12ʺ предоставлена компанией Chr. Hansen. Штаммы вносят в среду восстановленного молока после разморозки при 0,01% об. (приблизительно 5×10⁶ кое/мл). Для культур Bifidobacterium animalis subsp. Animalis среда восстановленного молока содержит добавку в виде 2 г/л декстрозы с целью обеспечения сопоставимого с Bifidobacterium breve и BB12 времени окисления.

Ферментацию проводят при 37°C и мониторируют при помощи определения pH.

Пример 1: Обогащение среды восстановленного молока марганцем.

Восстановленное молоко готовят и ферментируют, используя B. animalis, B. breve или BB12, как описано ранее. Наблюдается, что добавление MnSO₄ к восстановленному молоку уменьшает время достижения pH 5,5 для B. animalis animalis и B. breve, но не для BB12. При содержании 5 мг/л и 65 мг/л наблюдается 7% уменьшение времени достижения pH 5,5 для B. animalis subsp. animalis, и наоборот, для BB12 наблюдается увеличение времени достижения pH 5,5 на более чем 10% при обоих вариантах обогащения марганцем. Для B. breve тестирование обогащения марганцем проводят только при концентрации 65 мг/л, результаты чего говорят о небольшом уменьшении времени достижения pH 5,5.

Таблица 1: Добавление MnSO₄ уменьшает время достижения pH 5,5 для избранных бифидобактерий.

Пример 2: Обогащение среды восстановленного молока MnSO₄ в сочетании с цистеином.

Восстановленное молоко готовят и ферментируют, используя B. animalis subsp. animalis, B. breve или BB12, как описано ранее. Как в Примере 1, наблюдается, что добавление к восстановленному молоку MnSO₄ в сочетании с цистеином уменьшает время достижения pH 5,5 для B. animalis subsp. animalis и B. breve, но не для BB12.

Таблица 2: Добавление MnSO₄ в сочетании с цистеином уменьшает время достижения pH 5,5 для избранных бифидобактерий.

Пример 3: Обогащение среды восстановленного молока дрожжами.

Добавление дрожжевого экстракта дополнительно уменьшает время достижения pH 5,5 для B. animalis animalis, как при применении в присутствии MnSO₄ в сочетании с цистеином, так и при добавлении к восстановленному молоку в качестве отдельной добавки.