КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ LACTOBACILLUS CASEI ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К РАСПРОСТРАНЕННЫМ ИНФЕКЦИОННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Данное изобретение относится к композициям для улучшения устойчивости к распространенным инфекционным заболеваниям.

Распространенные инфекционные заболевания (CID), определенные как инфекции нижних и верхних дыхательных путей и гастроэнтерит, являются эндемичными в общей популяции, вызывая значительную степень дискомфорта.

Различные типы распространенных инфекционных заболеваний в каждой категории и основные связанные с ними симптомы, используемые для диагностики, суммированы в таблице 1 ниже.

В 2002 году простуда была ответственна за миллионы дней пропуска работы и школы, и несет ответственность за 27 миллионов визитов врачей в США (Greenberg, 2002), в то время как Feeney показал, что респираторные расстройства и гастроэнтерит несут ответственность за 50-60% всех случаев отсутствия на рабочем месте в Лондоне (Feeney A et al., 1998). Кроме того, инфекции верхних дыхательных путей являются ведущей причиной нецелесообразного применения антибиотиков для детей и взрослых, приводя к увеличению распространения резистентности к антибиотикам. Наконец, для некоторых инфекций, таких как простуда, вызываемых риновирусами, нет одобренных антивирусных лекарственных средств (Greenberg, 2002). Итак, распространенные инфекции представляют большой интерес в контексте здравоохранения и социально-экономических последствий.

По причине своего действия на иммунную систему стресс является одним из факторов, которые могут участвовать в повышении риска инфицирования. В действительности, исследования показывали, что психологический стресс может подавлять иммунный ответ, вызывая дисрегуляцию различных сигналов. Демонстрировали некоторые "пути", посредством которых иммунная система модулируется психологическим стрессом. Например, существует прямая иннервация первичной и вторичной лимфоидной ткани вегетативной нервной системой. Данные "пути" действуют посредством продуцирования биологических медиаторов, которые взаимодействуют с клеточными компонентами иммунной системы и действуют на них (Yang EV & Glaser R., 2000). Таким образом, Yang и Glaser демонстрировали, что психологические стрессоры обладают способностью модулировать клеточный иммунный ответ, что может приводить к повышению индивидуальной восприимчивости к инфекционным патогенам (Yang EV & Glaser R., 2000).

Некоторые ситуации и действия могут вызывать стресс, среди них рабочая активность представляет особый интерес. В действительности, влияние стрессовых условий работы на инфекции демонстрировали в исследованиях, в особенности проводимых на посменных рабочих. В эпидемиологических исследованиях демонстрировали, что случаи простуды, гриппоподобных заболеваний и гастроэнтерита отличаются среди работников с разным режимом работы. Посменная работа значительно ассоциирована с более высокой заболеваемостью всеми тремя распространенными инфекциями (Mohren DC et al., 2002). В нескольких исследованиях сообщали о подавлении функции иммунитета в отношении посменной работы, что может объяснять повышение восприимчивости к инфекциям (Curti R et al., 1982; Kobayashi F et al., 1997).

Среди продуктов, потенциально активных против распространенных инфекций, пробиотики демонстрировали интересные эффекты, в особенности на взрослых работников. Например, показано, что Lactobacillus reuteri ATCC55730 уменьшает кратковременный отпуск по болезни, вызванный респираторными или желудочно-кишечными инфекциями, и, таким образом, улучшает благоприятные для здоровья условия на рабочем месте (Tubelius et al. 2005). В других исследованиях противоинфекционное действие пробиотиков коррелировало с модуляцией параметров иммунной системы. Для взрослых показано, что смесь пробиотиков (т.е. Lactobacillus gasseri PA 16/8, Bifidobacterium longum SP 07/3 и Bifidobacterium bifidum MF 20/5) снижает тяжесть и длительность простудных инфекций и количество дней связанной с ними лихорадки. В данном исследовании улучшение исхода заболевания ассоциировано со значительным повышением количества цитотоксических и супрессорных CD8 T-клеток в группе, принимавшей пробиотики (De Vrese et al., 2005).

DANONE разрабатывал молочный напиток с пробиотиками, ACTIMEL^®, содержащий Lactobacillus casei DN-114 001, а также характерные йогуртовые культуры (Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilus).

Сообщали, что потребление ACTIMEL^® обладает положительным воздействием на исход желудочно-кишечных заболеваний. У посещавших центры дневного пребывания детей, добавление ACTIMEL^® снижало заболеваемость острой диареей по сравнению с контрольной группой с добавлением йогурта (Pedone et al., 2000). С такой же диетой у детей также наблюдали значительное снижение продолжительности острой диареи (Pedone et al., 1999, Agarwal et al., 2001).

В другом исследовании (Cobo Sanz et al., 2006) дети от 3 до 12 лет, получавшие Actimel 2 раза в день в течение 20 недель, демонстрировали тенденцию снижения продолжительности и заболеваемости некоторыми инфекционными заболеваниями, в частности, инфекциями нижних дыхательных путей (бронхит или пневмония).

Также проводили исследование в популяции пожилых людей. Исследовали действие 3-недельного потребления ACTIMEL^® на заболеваемость, продолжительность и связанную с заболеваниями лихорадку при желудочно-кишечных и зимних респираторных инфекциях. В данном исследовании потребление ACTIMEL^® снижало продолжительность заболевания по сравнению с контрольной группой (Turchet et al., 2003).

Также показано, что ACTIMEL^® модулирует количество и активность некоторых иммунных клеток в нескольких популяциях, в том числе у индивидуумов, подвергнутых стрессу. Потребление ACTIMEL повышает или ингибирует понижение некоторых параметров иммунитета (общие лимфоциты, CD56⁺ клетки, т.е., естественные киллеры + цитотоксические T-клетки) у индивидуумов 18-23 лет, подвергнутых стрессу сдачи университетских экзаменов (Marcos et al., 2004). Таким же образом, на модели сильно тренированных атлетов, у которых физическая активность обладает острыми и хроническими эффектами на иммунную систему, снижение количества NK-клеток значительно ниже после потребления ACTIMEL^®, чем после потребления молока (Pujol et al., 2000). В течение 8-недельного периода потребления продукта в других исследованиях, выделяющих популяцию среднего возраста (51-58 лет), показали, что ACTIMEL^® повышает и цитотоксическую активность NK-клеток (Parra et al., 2004a; Parra et al., 2004b), и активность респираторного взрыва моноцитов (Parra et al., 2004b). Таким образом, данные результаты показывают, что ACTIMEL^® может регулировать клеточный иммунитет, в особенности врожденный, посредством увеличения размера субпопуляций или специфических активностей иммунных клеток.

Также показывали модуляцию активности NK-клеток для штамма Lactobacillus casei Shirota у новорожденных мышей, зараженных вирусом гриппа (Yasui et al., 2004), и у человека, и у пристрастившихся курильщиков (Morimoto et al. 2005), и у здоровых индивидуумов (Nagao et al. 2000; Takeda et al. 2007).

В настоящее время заявители исследуют действие ACTIMEL^® на устойчивость взрослых к распространенным инфекциям, в особенности иммунокомпетентных взрослых моложе 65 лет, работающих в стрессовых условиях. Как показано в экспериментальной части ниже, они демонстрировали, что действие потребления ACTIMEL^® выше у потребителей табака, чем у некурящих. Кроме того, заявители показали, что в общей популяции регулярный прием ACTIMEL^® приводит к более сильному иммунному ответу в случае CID, в связи с тем, что действуют NK-клетки и нейтрофильные лейкоциты.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению штамма Lactobacillus casei для получения композиции для улучшения устойчивости потребителя табака, в частности курильщика, к распространенному инфекционному заболеванию, в особенности к распространенному респираторному инфекционному заболеванию. Оно также относится к применению штамма Lactobacillus casei для получения композиции для улучшения клеточного иммунного ответа, в частности ответа NK-клеток и/или нейтрофильных лейкоцитов индивидуума в случае распространенного респираторного инфекционного заболевания, такого как ринофарингит или ларингит.

Предпочтительно, указанную композицию требуется вводить индивидууму моложе 65 лет.

По предпочтительному варианту осуществления изобретения, указанный штамм Lactobacillus casei является штаммом Lactobacillus casei ssp. paracasei, предпочтительно штамм хранится в CNCM под номером 1-1518, который описывают, например, в EP0794707 или EP1283714.

Преимущественно, указанная композиция содержит, по меньшей мере, 1×10⁵ КОЕ на миллилитр указанного штамма Lactobacillus casei, более предпочтительно, по меньшей мере, 1×10⁷ КОЕ на миллилитр указанного штамма Lactobacillus casei. Указанный штамм может являться связанным с одним или несколькими другими молочнокислыми бактериями, выбранными из рода Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus и Bifidobacterium, предпочтительными молочнокислыми бактериями, выбранными из группы, содержащей Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii подвиды bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum и/или Bifidobacterium breve. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанный штамм Lactobacillus casei связан с бактериями Lactobacillus bulgaricus и/или Streptococcus thermophilus.

В частности, указанная композиция может представлять собой питание или пищевую добавку. Предпочтительно, она является композицией кисломолочного продукта.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируют следующим дополнительным описанием, которое относится к примерам, иллюстрирующим свойства композиции, содержащей Lactobacillus casei для улучшения устойчивости к распространенным инфекционным заболеваниям.

ПРИМЕР 1: МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

1.1: Исследуемая популяция

Демографический состав

Характеристики исследуемой популяции суммированы в таблицах 2 и 3 ниже.

Исключение и предварительные отзывы из исследования

Всего 38 индивидуумов из ITT популяции (4%) отзывали до конца исследования, в то время как все индивидуумы, включенные в PP популяцию, завершали исследование (по определению).

1.2. Особенности исследовательских продуктов

Характеристики продуктов

Продукты, применяемые в течение данного исследования, принадлежат к семейству свежих молочных продуктов. Настоящее исследование проводили, применяя ACTIMEL^® в качестве активного продукта.

В таблице 5 представлена композиция активного и контрольного продуктов.

Для соблюдения двойного слепого способа оформление, упаковка и вкус активного и контрольного продукта являлись идентичными.

Активный продукт (ACTIMEL^®) является подслащенным ароматизированным кисломолочным напитком.

Контрольный продукт является подслащенным ароматизированным неферментированным подкисленным молочным продуктом.

1.3. План исследования

Описание плана исследования

Исследование проводили в 1 центре, оно являлось рандомизированным со стратификацией по типу активностей, двойным слепым, его контролировали в 2 параллельных группах: "продукт ACTIMEL^®" по сравнению с "контрольным продуктом".

На фигуре 1 показан расчет времени способов исследования (*: В зависимости от участия подгруппы в "Биологических параметрах крови").

После этапа скрининга (V1-V2) экспериментальный этап делили на 2 части: этап потребления продуктов (V2-V5: 12 недель) и последующий этап (V5-V6: 4 недель) без потребления продукта.

Для каждого индивидуума общая продолжительность исследования составляла 4,5 месяца (2 недели ограничения питания, 12-недель потребления продукта и 4 последующих недели).

Критерии оценки

Первичным критерием оценки в исследовании являлось количество всех CID, о которых индивидуум сообщал в течение 12 недельного периода потребления продукта. В данном исследовании, CID делили на 3 основные категории инфекций:

инфекции верхних дыхательных путей (URTI): ринофарингит, ларингит, синуситы, отит;

инфекции нижних дыхательных путей (LRTI): бронхит, пневмопатия и т.д.;

инфекции желудочно-кишечного тракта (GITI).

Первичные параметры оценки

Первичные:

Сравнение между группами по количеству всех CID, о которых сообщали в течение 12 недель потребления исследуемого продукта.

Вторичные:

- Сравнение между группами по количеству всех CID, о которых сообщали в течение 4 последующих недель и в течение всего этапа исследования [этап потребления + последующие мероприятия].

- Сравнение между группами по количеству URTI, или LRTI, или GITI, или каждого типа CID в течение 12 недель потребления исследуемого продукта, в течение 4 последующих недель и в течение всего этапа исследования [этап потребления + последующие мероприятия].

- Сравнение между группами по количеству индивидуумов, имеющих, по меньшей мере, 1 CID (любой тип), или 1 URTI, или LRTI, или GITI, или один тип CID (например: ринофарингит или ларингит) в течение 12 недель потребления исследуемого продукта, в течение 4 последующих недель и в течение всего этапа исследования [этап потребления + последующие мероприятия].

- Сравнение между группами по развитию гемограммы в каждой группе во время некоторых запланированных визитов и в случае CID (любой тип), или URTI, или LRTI, или GITI, или каждый тип CID в течение 12 недель потребления исследуемого продукта, в течение 4 последующих недель и в течение всего этапа исследования [этап потребления + последующие мероприятия].

- Сравнение между группами по количеству дней лихорадки в течение всех CID (любой тип), или URTI, или LRTI, или GITI, или каждого типа CID, в течение 12 недель потребления исследуемого продукта, в течение 4 последующих недель и в течение всего этапа исследования [этап потребления + последующие мероприятия].

- Сравнение между группами по развитию в каждой группе параметров иммунной системы при анализе крови во время некоторых запланированных визитов (для части индивидуумов) и дополнительных визитов в случае CID (любой тип), или URTI, или LRTI, или GITI, или каждого типа CID, в течение 12 недель потребления исследуемого продукта, в течение 4 последующих недель и в течение всего этапа исследования [этап потребления + последующие мероприятия].

1.4. Статистические способы

Статистический и аналитический планы

План статистического анализа составляли до слепого обзора. Статистический анализ объединял рекомендации Европейского Агентства Лекарственных Средств (ICH Topic E9 - шаг 4-5 февраль 1998).

Определение объема выборки

Определение объема выборки основывалось на первичном исходе: накопленное количество CID, имевших место в течение трех месяцев потребления продукта. Множественные случаи различных инфекционных заболеваний, имевших место совместно (например, инфекция верхних дыхательных путей и гастроэнтерит), подсчитывали раздельно и суммировали в случае, если они имели место в один эпизод инфицирования.

Точное количество эпизодов распространенных инфекционных заболеваний среди посменных рабочих в течение установленного периода времени прогнозировать не просто, т.к. они могут широко варьировать в зависимости от сезонных условий. Однако предполагали, что в контролируемой группе можно наблюдать в среднем 1,5 случая. В группе ACTIMEL^® ожидали 15% относительное снижение (т.е. ожидаемое среднее количество случаев составляло 1,275 в рандомизированной группе ACTIMEL^®). Предполагали, что распределение накопленного количества случаев инфицирования подчиняется распределению Пуассона с избыточной дисперсией; ожидали некоторую избыточную дисперсию, т.к. частота случаев у индивидуума не является независимой.

С ожидаемым количеством в 1,5 случая в течение периода трех месяцев в контролируемой группе и с применением регрессии Пуассона с двусторонним тестом при 5% α-уровне предполагаемой умеренной избыточной дисперсии (параметр масштаба 1.1), ожидали, что приблизительно 450 индивидуумов в каждой группе, остававшихся в исследовании в течение трех месяцев, необходимо для определения 15% снижения количества с, по меньшей мере, 80% мощностью. Ожидали 5% количество выбывания индивидуумов; таким образом, необходимо включать приблизительно 500 индивидуумов в каждой группе. Таким образом, отбирали всего 1000 индивидуумов.

ПРИМЕР 2: КЛИНИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

2.1: Количество всех CID в субпопуляции курильщиков

Как представлено в таблице 6, статистически значимое действие продукта на количество всех CID в пользу группы ACTIMEL^® в течение этапа потребления исследуемого продукта в субпопуляции курильщиков (среднее=0,6 для ACTIMEL по сравнению с 0,8 для Контроля; p=0,033 для ITT популяции), принимая во внимание то, что данное действие не наблюдали в популяции некурящих (p=0,687 для ITT популяции) (Таблица 7)

2.2: Частота CID в течение этапа потребления продукта

ПРИМЕР 3: БИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Представленные ниже результаты по всем биологическим данным получали посредством ковариационного анализа. Более точно, статистический анализ является изменением по сравнению с базовым значением, вычисленным по базовому значению (в соответствии с рекомендациями ICH). Групповое изменение выражали как: биологическую ценность CID - базовую биологическую ценность, вычисляемую для каждого индивидуума и статистической модели, применяют к доступным данным. Кроме того, базовое описание предоставляют для информации по всей ITT популяции с CID.

3.1. Клетки-естественные киллеры: NK-клетки CD16+/56+/3- изменение по сравнению с базовым значением в случае CID (параметр = NK-клетки CD16+/56+/3- абсолютное количество).

Клинически соответствующее и статистически значимо более высокое абсолютное количество NK-клеток CD16+/56+/3- наблюдали в группе ACTIMEL^® в течение этапа потребления продукта в случае CID, для всех CID (изменение по сравнению с базовым значением= +45,048 клеток/мкл для ACTIMEL^® по сравнению с -14,500 клеток/мкл для Контроля; p<0,001), для URTI (p=0,016), для LRTI (p=0,009), для ринофарингита (p=0,011) и для ларингита (p=0,032) в ITT популяции (Таблица 9)

Заявители также наблюдали (данные не приводятся):

- Клинически соответствующее и статистически значимо более высокое процентное содержание NK-клеток CD16+/56+/3- в группе ACTIMEL^® в случае CID, для всех CID в течение этапа потребления продукта (изменение по сравнению с базовым значением = +1,95% для ACTIMEL^® по сравнению с +0,08% для контроля; p=0,007, для базовых значений=10,35+/-4,67 для ACTIMEL^® по сравнению с 9,56+/-4,29 для Контроля) и для LRTI в течение всего этапа исследования (p=0,008) в ITT популяции.

- Статистически значимо более высокую литическую активность NK-клеток в группе ACTIMEL® в случае CID, для ларингита в течение этапа потребления продукта (p=0,047 для базальной активности; p=0,013 для стимулированной IL-2 активности) в ITT популяции.

Таким образом, представляется, что абсолютное количество NK-клеток (CD16+CD56+CD3-) статистически различается между группами и выше по изменению в группе ACTIMEL® по сравнению с базовым значением в случае CID. Это наблюдали в течение этапа потребления продукта для всех CID, URTI и LRTI, и ринофарингита и ларингита. Все результаты подтверждали, т.к. учитывали только образцы, собранные в течение CID (все со значимым P).

3.2. Изменение лейкоцитов и нейтрофилов по сравнению с базовым значением в случае CID в течение этапа потребления продукта

Клинически соответствующее и статистически значимо более высокое абсолютное количество лейкоцитов наблюдали в группе ACTIMEL® [изменение по сравнению с базовым значением = +1248 клеток/мкл для ACTIMEL^® по сравнению с +165 клеток/мкл для Контроля] в течение этапа потребления продукта в случае CID, для всех CID (p=0,034) и для ринофарингита (p=0,002) в ITT популяции.

Заявители также наблюдали клинически соответствующее и статистически значимо более высокое по сравнению с базовым значением абсолютное количество нейтрофилов в группе ACTIMEL® [изменение по сравнению с базовым значением = +1050 клеток/мкл для ACTIMEL^® по сравнению с +210 клеток/мкл для Контроля] в случае CID, для всех CID в течение всего этапа исследования (p=0,037) и для ринофарингита (p=0,002) в течение этапа потребления продукта в ITT популяции. В случае ринофарингита среднее изменение значения составляло +1279 клеток/мкл в группе ACTIMEL® и -231 клеток/мкл в контрольной группе для базовых значений 3740 и 3800, соответственно (Таблица 11).

Клинически соответствующее и статистически значимо более высокое процентное содержание нейтрофилов наблюдали в группе ACTIMEL® [изменение по сравнению с базовым значением = +5,3% для ACTIMEL^® по сравнению с +1,5% для Контроля] в случае CID, для всех CID в течение всего этапа исследования (p=0,038) и для ринофарингита (p=0,017) в течение этапа потребления продукта в ITT популяции (Таблица 12). Таким образом, описанное выше отклонение количества лейкоцитов является следствием изменения количества нейтрофилов, т.к. ни одна другая субпопуляция клеток в гемограмме не изменялась значимо.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В высокочувствительной к респираторным инфекциям субпопуляции, такой как курильщики, ACTIMEL^® снижает количество всех CID. В общей исследуемой популяции наблюдали статистически значимое различие (Таблица 8) в пользу ACTIMEL^® по частоте CID в течение этапа потребления продукта в исследовании (и в ITT, и в PP популяции).

В случае CID, потребление ACTIMEL^® также увеличивало время первого появления инфекции и снижало общую продолжительность связанной с ним лихорадки (только в течение всего этапа исследования для лихорадки).

Данные клинические эффекты связаны с действием ACTIMEL^® на некоторые субпопуляции иммунных клеток, т.к. ACTIMEL^® значительно повышает количество лейкоцитов, нейтрофилов и NK-клеток в крови.

Действие ACTIMEL^® на иммунологические показатели согласуются с его наблюдаемой способностью улучшать клинические исходы в случае CID, и это может составлять интересную основу результатов для дальнейшего исследования механизмов действия ACTIMEL^®.