Результат интеллектуальной деятельности: КОРМОВАЯ ДОБАВКА ДЛЯ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ

Изобретение относится к отрасли сельского хозяйства и может быть использовано в кормлении сельскохозяйственной птицы, в частности цыплят-бройлеров.

Известно изобретение относящееся к фармацевтике, а именно к молекулам растительного происхождения (кумарина или скополетина) в качестве ингибитора системы кворум сенсинга LuxI/LuxR типа у бактерий [1].

В данном изобретении изучалась возможность усиления анти-кворум эффекта кумарина и его производных при их сочетании с антибиотиками из группы аминогликозидов (канамицином, гентамицином, амикацином и др.). При этом данное усиление идет за счет синергетического действия антибиотика, при котором нарушается образование регуляторных молекул (АГЛ).

Известен способ индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является штамм BACILLUS CEREUS IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациентов при исследовании на дисбактериоз кишечника [2].

Отличительным признаком этого способа является то, что осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе с последующим высевом по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества условнопатогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Для подтверждения эффективности заявляемого изобретения проведено исследование возможности связывания и ферментативной деградации сигнальных молекул системы «кворум сенсинга» пробиотическими микроорганизмами рода Bacillus. При выполнении данного фрагмента исследования тестированы восемь штаммов рода Bacillus (В. subtilis 7048, В. subtilis 534, В. clausii, В. subtilis 12 В, В. subtilis 7092, В. licheniformis, В. cereus АТСС 14893, В. subtilis 5020), являющихся активным началом ветеринарных и медицинских пробиотических препаратов. Анти-кворум активность внеклеточных продуктов микроорганизмов рода Bacillus оценена остаточными количествами автоиндукторов системы «кворум сенсинга» (ацилированных гомосерин лактонов; АГЛ), количественно тестированными в тестах индукции биолюминесценции E. coli pAL103 и биосинтеза пигмента виолацеина C. violaceum CV026 (фиг. 1). При этом минимальный анти-кворум эффект выявлен при тестировании клеточной биомассы В. licheniformis и В. clausii, а максимальный - у В. cereus АТСС 14893.

Проведена идентификация генетических и молекулярных детерминант, определяющих анти-кворум активность пробиотиков.

Объектом поиска явился ген aiiA, кодирующий N-ацил-гомосерин лактоназу (ЕС: 3.1.1.81), отщепляющую от исходной молекулы АГЛ лактонное кольцо. С использованием двух пар модифицированных (вырожденных) праймеров aiiA1 и aiiA2 проведена амплификация целевого участка геномов восьми исследуемых микроорганизмов рода Bacillus. Положительный результат амплификации зарегистрирован только для В. cereus АТСС 14893, клеточная биомасса которого проявляет наиболее выраженную способность к инактивации АГЛ (фиг. 2). На фигуре 2 изображено: Ряд №1: 1 - B. subtilis 7092 (ВТ1/ВТ2); 2 - В. clausii (aiiA1/aiiA2); 3 - В. clausii (aiiAF/aiiAR); 4 - В. clausii (aiiA 240B1-F/aiiA 240B1-R); 5 - B. clausii (AI96-up/AI96-down); 6 - B. clausii (BT1/BT2); 7 - B. subtilis 7048 (aiiA1/aiiA2); 8 - B. subtilis 7048 (aiiAF/aiiAR); 9 - B. subtilis 7048 (aiiA 240B1-F/aiiA 240B1-R); 10 - B. subtilis 7048 (AI96-up/AI96-down); 11 - B. subtilis 7048, (BT1/BT2); 12 - B. licheniformis (aiiA1/aiiA2); 13 - B. licheniformis (aiiAF/aiiAR); 14 - B. licheniformis (aiiA 240B1-F /aiiA 240B1-R); 15 - B. licheniformis (AI96-up/AI96-down); 16 - B. licheniformis (BT1/BT2).

Ряд №2: 1 - B. subtilis 12B (AI96-up/AI96-down); 2 - B. subtilis 12B (BT1/BT2); 3 - B. cereus (aiiA1/aiiA2); 4 - B. cereus (aiiAF/aiiAR); 5 - B. cereus (aiiA 240B1-F /aiiA 240B1-R); 6 - B. cereus (AI96-up/AI96-down); 7 - B. cereus (BT1/BT2); 8 - B. subtilis 5020 (aiiA1/aiiA2); 9 - B. subtilis 5020 (aiiAF/aiiAR); 10 - B. subtilis 5020 (aiiA 240B1-F /aiiA 240B1-R); 11 - B. subtilis 5020 (AI96-up/A196-down); 12 - B. subtilis 5020 (BT1/BT2); 13 - B. subtilis 7092 (aiiA1/aiiA2); 14 - B. subtilis 7092 (aiiAF/aiiAR); 15 - B. subtilis 7092 (aiiA 240B1-F/aiiA 240B1-R); 16 - B. subtilis 7092(AI96-up/AI96-down).

Таким образом, результаты проведенного исследования позволили объяснить высокий уровень анти-кворум активности биомассы пробиотического штамма В. cereus АТСС 14893 присутствием внеклеточного фермента N-ацил-гомосерин лактоназы, синтезируемой под контролем гена aiiA. Одновременно полученный результат сформировал основу для решения поставленой задачи, связанной с переносом генов (фрагментов ДНК), ответственных за анти-кворум активность пробиотических штаммов рода Bacillus, в широкий круг грамположительных и грамотрицательных хозяев (фиг. 3). На фигуре 3 изображено: 1 ряд - В. cereus IP5832; 2 ряд - клонированные клетки Е. coli XL1-Blue; 3 ряд - CV 026 с ГСЛ; слева - направо: концентрация ГСЛ.

Клонирование гена aiiA из В. cereus АТСС 14893 в клетках Е. coli создает основу для эффективного переноса анти-кворум активности представителям нормобиоценоза сельскохозяйственных животных и человека.

При проведении работ использован штамм Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), входящий в состав пробиотических препаратов. Первичное выделение микроорганизмов осуществляли на LB-агар (Sigma-Aldrich, США), дальнейшее культивирование проводили в LB-бульоне при температуре 37±1°C с динамическим мониторингом роста при 545 нм (ОП545). После 72 часов бактериальную биомассу отделяли центрифугированием в течение 10 минут при 12000 g (MiniSpin, Eppendorf, Германия), а полученные супернатанты стерилизовали через стерильную шприцевую фильтрующую насадку, СА (ацетат целлюлозы), (Membrane Solutions, США) с диаметром пор 0,22 мкм.

В дальнейшем с целью апробации препарата с изучаемым штаммом был проведен опыт на цыплятах-бройлерах кросса Арбор Айкрес в условиях вивария ФГБНУ «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук». Для эксперимента было отобрано 18 голов 9-дневных цыплят-бройлеров, которых методом аналогов, как по возрастным, так и по весовым признакам разделили на 2 группы (n=9) со средней живой массой 214 г. Во время эксперимента вся подопытная птица находилась в одинаковых условиях содержания. Микроклимат в помещении соответствовал требованиям ВНИТИП.

Кормление и поение птицы осуществлялось групповым методом. Основной рацион (ОР) для подопытной птицы в ходе исследований составлялся с учетом рекомендаций ВНИТИП [3]. Кормление подопытной птицы проводилось 2 раза в сутки, учет поедаемости - ежесуточно. Поение осуществлялось вволю.

Контрольная группа - ОР; опытная - ОР + штамм пробиотических препаратов Bacillus cereus IP 5832 в дозировке 4 мл/кг ж.м./сут (с уровнем микробных клеток в 1 мкл - 1*10⁹ ед.).

В ходе исследований было установлено преимущество по живой массе опытных бройлеров над контролем (табл. 1). Так на третью неделю эксперимента опытная группа характеризовалась преобладанием живой массы на 34,37 г (4,86%) в сравнении с контролем, на четвертую неделю на 129,08 г (P≤0,05) или на 7,3% и на пятую неделю на 217,96 г (Р≤0,05) или на 9,13% соответственно.

Аналогичная ситуация наблюдалась и по приростам живой массы (табл. 2). Бройлеры из опытной группы превосходили аналогов из контрольной по абсолютному приросту на 217,96 г (10%), среднесуточному на 6,23 г (10,03%).

За весь период эксперимента бройлеры опытной группы поедали корма больше на 0,23 г или 6,55%, однако расход корма на 1 кг живой массы у них был меньше на 0,04 г (2,46%) по сравнению с контролем (табл. 3).

Таким образом, применение кормовой добавки состоящей из штамма Bacillus cereus IP 5832 способствует повышению продуктивности птицы и его резистентности.

Источники информации

1. Патент на изобретение RU №2616237 Применение кумарина и его производных в качестве ингибиторов системы "кворум сенсинга" LuxI/ LuxR типа у бактерий / Д.Г. Дерябин, А.А. Толмачёва, К.С. Инчагова; опубл. 13.04.2017, Бюл. №11

2. Патент на изобретение RU №2399658 Способ индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является штамм BACILLUS CEREUS IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациентов при исследовании на дисбактериоз кишечника / Е.А. Оришак, Л.Ю. Нилова, А.Г. Бойцов; опубл. 20.09.2010 Бюл. №26

3. Рекомендации по кормлению сельскохозяйственной птицы / ВНИТИП. Под общ. Ред. В.И. Фисинина. - Сергиев Посад, 2000. - 68 с.