ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ГРИБА ЧАГА

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к питательным средам для культивирования базидиального гриба Inonotus obliquus (чага).

Березовый гриб Inonotus obliquus является лекарственным сырьем, поскольку в его состав кроме основного действующего компонента меланина, входят биологически активные соединения, такие как полисахариды, фенольные соединения, терпеноиды, стероиды, углеводы и др. (Сысоева М.А. Высокодисперсные коллоидные системы и меланин чаги: монография / М.А. Сысоева. - Казань: Изд-во КНИТУ, 2013 - 226 с.). На его основе выпускают различные препараты, которые используются для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, послеоперационного лечения злокачественных новообразований. Длительное время возобновления этого гриба в природных условиях делает актуальным разработку биотехнологий культивирования гриба чага, которое позволит заменить природное сырье. При искусственном культивировании гриба необходимо подобрать условия его выращивания, включающие выбор питательной среды, а также стимуляторов роста, которые обеспечат получение большого количества биомассы, а также целевых продуктов.

Известна питательная среда для выращивания гриба Inonotus obliquus, в состав которой входят глюкоза, дигидроортофосфат калия, гидроортофосфат калия, сульфат магния, сульфат аммония, пептон, сульфат меди, тирозин, тиамин, кукурузный экстракт (патент BY10670, C12N 1/14, С12Р 19/00, опубл. 30.06.2008).

Известна питательная среда для выращивания гриба Inonotus obliquus, в состав которой входят: глюкоза, солодовый экстракт, пептон, дрожжевой экстракт, сульфат магния, гидроортофосфат калия, дигидроортофосфат калия, тиамин-HCl, хлорид кальция, сульфат железа, сульфат марганца, сульфат цинка, сульфат меди, хлорид кобальта, гидрофосфат натрия, тетраборат калия (Kim, Y.О. Immunostimulating effect of the endo-polysaccharide produced by submerged culture of Inonotus obliquus / O.Y. Kim, et. al. // Life Sciences. - 2005. - V. 77. - P. 2438-2456).

К недостаткам известных питательных сред можно отнести многокомпонентность состава и использование большого количества неорганических веществ. Кроме того авторы не приводят количество посевного материала, что не позволяет оценить эффективность использования сред, например, по выходу биомассы и/или меланина.

В качестве прототипа выбрана питательная среда для выращивания гриба чага на основе картофельного отвара, содержащего глюкозу и дрожжевой экстракт (Cho, N.-S. Optimization of in Vitro cultivation of Inonotus obliquus / N.-S. Cho, Y.-S. Shin // Mokcae Konghak. - 2005. - V. 33. - P. 92-98.).

Недостатком данной питательной среды является получение биомассы гриба с низким выходом.

Технической проблемой предполагаемого изобретения является разработка питательной среды, которая позволит получить биомассу гриба чага с высоким выходом.

Техническая проблема решается питательной средой для выращивания гриба чага на основе картофельного отвара, содержащего глюкозу, глицин, комплекс меланина с железом и полифепан при массовой концентрации компонентов в г/л: глюкоза - 20,0; комплекс меланина с железом - 0,10-0,50; глицин - 0,10-0,50; полифепан - 0,1.

Использование предлагаемой питательной среды позволяет получать биомассу гриба чага с выходом в 2 раза большим по сравнению с прототипом.

В предлагаемой питательной среде к картофельному отвару, содержащему глюкозу, добавляют следующие стимулирующие вещества: глицин, комплекс меланина с железом и полифепан.

Глицин - это алифатическая аминокислота, содержащаяся в белках, которые выполняют функцию ферментов гриба Inonotus obliquus. Обогащение питательной среды аминокислотой глицином позволит стимулировать рост гриба и, следовательно, повысить количество биомассы, накапливаемой грибом чага.

Применение комплекса меланина с железом позволит обогатить питательную среду ионами железа, которые служат кофакторами ферментов пероксидазы и каталазы гриба Inonotus obliquus, необходимых для биосинтеза меланинов и других биологически активных веществ, а также для его активного роста. Для лучшего усвоения ионов железа применен комплекс меланина с железом, поскольку ионы железа лучше усваиваются живыми организмами, если они входят в комплексы с органическими веществами. Комплекс меланина с железом получают в результате взаимодействия свежеосажденного меланина гриба Inonotus obliquus с насыщенным раствором FeSO₄. Содержание ионов железа Fe²⁺ и Fe³⁺ в получаемом комплексе по данным рентгенофлуоресцентного анализа составляет 3,7% (Уразлина, Л.Н. Модификация меланина чаги / Л.Н. Уразлина, P.P. Гараев, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева, А.В. Пятаев // IV Международный балтийский морской форум: тез. докл. - Калининград, 2016. С. 93-94).

Полифепан - это гидролизный лигнин, который является источником фенольных соединений и лигнина, необходимых для роста гриба Inonotus obliquus.

Для получения биомассы гриба Inonotus obliquus использовали штамм SUB2092728. Предлагаемый штамм гриба был выделен тканевым методом из плодовых тел, произрастающих в Звениговском районе Республике Марий Эл и депонирован в базе данных GenBank. Штамм хранится при 4-6°С на глюкозо-картофельной среде. Гриб Inonotus obliquus SUB2092728 является аэробом, оптимальной температурой роста является 24-27°С и рН 6,0-7,0.

Питательную среду готовили следующим образом. К измельченному картофелю добавляли воду в соотношении 5:1, кипятили и фильтровали. Полученный отвар доводили водой до 1 л, разливали по флаконам объемом 500 мл и добавляли к нему компоненты питательной среды: глюкозу, комплекс меланина с железом, глицин и полифепан. Питательную среду автоклавировали при 1 атм. в течение 30 минут.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру штамма гриба Inonotus obliquus выращивали на агаризованной глюкозо-картофельной среде в течение 5-7 дней. Полученный инокулят в количестве 0,001%, засевали бактериологической петлей во флакон объемом 500 мл с питательной средой следующего состава в г/л: глюкоза - 20,0; комплекс меланина с железом - 0,1; глицин - 0,1; полифепан - 0,1. Культивирование проводили в течение 12 дней в стационарных условиях, при температуре 27±2°С. Выращенную биомассу гриба отделяли фильтрованием от культуральной жидкости, многократно промывали ее и высушивали при комнатной температуре.

Примеры 2-3 аналогичны примеру 1. Составы питательных сред приведены в таблице.

Определение выхода биомассы проводили гравиметрически. Результаты многократно проведенных экспериментов обработаны с помощью программы «Статистика 10,0» (при р=0,95, n=5) и приведены в таблице.

Анализ табличных данных показывает, что применение предлагаемой питательной среды для выращивания гриба чага приводит к увеличению выхода биомассы почти в 2 раза по сравнению с прототипом. Снижение и/или увеличение концентрации вносимых в питательную среду веществ неэффективно, поскольку не приводит к изменению выхода биомассы.

Полученная по предлагаемому способу биомасса гриба Inonotus obliquus является перспективным объектом для разработки на его основе лекарственных, косметических средств и биологически активных добавок.