Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОВОКАИНА

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к количественному определению новокаина, и может быть использовано в контрольно-аналитических лабораториях, биохимических лабораториях клиник и в практике химико-токсикологических лабораторий.

Предложен способ фотометрического или визуально-тестового определения новокаина (Коновалова О. Ю., Логинова Л. П. Особенности протекания индикаторной реакции на первичные ароматические амины в желатиновой пленке // Методы и объекты хим. анализа. 2008. Т. 3. №.2. С. 147-156), заключающийся в использовании индикаторных пленок, представляющих собой отвержденные желатиновые слои фотографических пленок «Микрат – 300», с последующей иммобилизацией реагента - п-диметиламинобензальдегида в присутствии додецилсульфата натрия и 2 М HCl. Устойчивый аналитический эффект (ярко-желтое окрашивание) обусловлен образованием основания Шиффа в массиве желатинового геля. Диапазон определяемых содержаний 71000 – 5430000 нг/мл с пределом определяемых содержаний 38000 нг/мл.

Однако, данный способ характеризуется очень низкой чувствительностью и, следовательно, недостаточной точностью определения микрограммовых количеств новокаина.

Известен также способ спектрофотометрического определения новокаина (Бакеева Р. Ф. и др. Использование наноструктурированных мицеллярных сред для модификации 5, 7-дихлор-4, 6-динитробензофуроксана при определении ароматических аминов // Вестник Казанского технологического университета. 2010. №. 10), заключающийся в прибавлении 2-кратного избытка хромогенного реагента 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана (ДХДНБФО) к определяемому веществу (соотношение молярных концентраций С_{ДХДНБФО} : С_{новокаина} = 2:1) в присутствии организованной (мицеллярной) системы для увеличения солюбилизации ДХДНБФО, в которой образуются смешанные мицеллы, включающей смесь неионного – оксиэтилированного нонилфенола (АФ_9-10) и анионного ПАВ – додецилсульфата натрия (ДДС) в соотношении α_АФ9-10 : α_ДДС = 0,75 : 0,25, а также смешанный растворитель: вода (90 % об.) – диметилсульфоксид (ДМСО) (10 % об.) с последующим фотометрированием продукта замещения ДХДНБФО новокаином (ДХДНБФОН) красно-оранжевого цвета (λ = 420 нм).

Оптимальной концентрацией ПАВ, обеспечивающей максимальную чувствительность определений новокаина, является С_ПАВ =4⋅10^-4 М (~ 4 величины ККМ), а оптимальный интервал значений рН - 2,5 – 4 ед. Предел определяемых содержаний составляет 300 нг/мл.

Недостатками данного способа являются использование малодоступного и дорогостоящего реагента и токсичного органического растворителя для приготовления его растворов. Также способ отличается недостаточно высокой чувствительностью.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ количественного определения новокаина (а.с. СССР №1529086, по кл. МПК G01N21/78, опуб. 15.12.1989), заключающийся в обработке пробы органическим реагентом – п-диметиламинокоричным альдегидом в этаноле (С = 4,5⋅10^-5 - 4,5⋅10^-4 М) в присутствии додецилсульфата натрия (С = 4⋅10^-3 - 4⋅10^-2 М) при рН среды 3-4 и дальнейшем фотометрировании полученного раствора. Диапазон определяемых содержаний составил 400 – 5600 нг/мл с пределом обнаружения 200 нг/мл.

Однако, способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Технической проблемой является разработка способа количественного определения новокаина с применением смешанных мицелл неионного и анионного поверхностно-активного вещества (ПАВ).

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения новокаина путем снижения предела его обнаружения.

Для достижения заявляемого результата в способе количественного определения новокаина, включающем обработку анализируемой пробы растворами органического реагента и додецилсульфата натрия, добавление цитратного буферного раствора, фотометрирование и определение содержания новокаина по градуировочной кривой, согласно изобретению, в качестве органического реагента используют водный раствор 4-диметиламинобензальдегида, полученный его диспергированием в растворе додецилсульфата натрия, добавляют полученную смесь 4-диметиламинобензальдегида и додецилсульфата натрия к анализируемой пробе в количестве 4 ⋅10^-4 - 2 ⋅ 10^-3 М и 3 ⋅ 10^-3 – 1,4 ⋅ 10^-2 М соответственно, а после добавления цитратного буферного раствора дополнительно к пробе добавляют водно-мицеллярный раствор Тритона Х-114 в количестве 2 ⋅ 10^-3 - 1 ⋅ 10^-2 М. и насыщенный раствор хлорида натрия в количестве 0,5 – 1,0 М, после чего отделяют центрифугированием мицеллярно-насыщенную фазу и разбавляют цитратным буферным раствором, при этом, раствор цитратного буфера используют с кислотностью 2,5 - 3,5.

Способ осуществляется следующим образом. Анализируемую пробу обрабатывают органическим реагентом, который с новокаином образует окрашенное в желтый цвет основание Шиффа. В качестве реагента выбран 4-диметиламинобензальдегид (ДМАБА) как один из наиболее селективных и доступных реагентов на первичные ариламины, плохо растворимых в воде, но хорошо в органических растворителях, альтернативой которым являются разбавленные водные растворы ПАВ с концентрацией выше критической концентрации мицеллообразования (ККМ).

Исходный раствор ДМАБА диспергируют в растворе одного из наиболее часто применяемых представителей анионных ПАВ - додецилсульфата натрия (ДДС), который увеличивает растворимость ДМАБА и стабилизирует его раствор, а также катализирует реакцию ДМАБА с новокаином.

После обработки пробы раствором ДМАБА, диспергированного в растворе ДДС, в количестве 4 ⋅10^-4 ≤ С_ДМАБА ≤ 2 ⋅10^-3 М и 3 ⋅ 10^-3 ≤ С_ДДС ≤ 1 ⋅10^-2 М, добавляют цитратный буферный раствор, поддерживающий постоянство рН (2,5 – 3,5) и способствующий максимальной стабилизации аналитической формы (основания Шиффа) и повышению сходимости результатов.

Далее к пробе добавляют Тритон Х-114 – наиболее часто применяемый представитель неионных ПАВ, удовлетворяющий требованиям, предъявляемым к таким ПАВ, для проведения экстракции на основе «точки помутнения» (cloud point extraction, CP), в количестве 2 ⋅ 10^-3 ≤ С ≤ 1 ⋅ 10^-2 М.

Важным отличительным свойством неионных ПАВ является способность их растворов подвергаться фазовому разделению при достижении температуры помутнения. При этом, гомогенный раствор разделяется на две фазы: водную, в которой неионногенное ПАВ (нПАВ) находится в концентрации ниже ККМ, и мицеллярную - обогащенную ПАВ. Температура в точке помутнения является важной характеристикой водных растворов нПАВ, зависит от многих факторов и достигает температур 20 – 25˚ С в присутствии добавок неорганических высаливателей, например NaCl.

Последний в количестве 0,5 – 1,0 М применяли для получения двухфазной системы с окрашенной в желтый цвет мицеллярно-насыщенной фазой, как наиболее доступный и дешевый высаливатель.

Полученные мицеллярные экстракты отделяют от водной фазы декантацией, разбавляют цитратным буферным раствором и фотометрируют при l = 1 см и λ_max = 469 нм.

Способ отличается комбинацией двух эффектов концентрирования в смешанных мицеллах ПАВ: псевдофазное концентрирование, осуществляемое анионным ПАВ (ДДС); концентрирование в мицеллярно-насыщенные фазы неионного ПАВ (Тритон Х-114), основанное на эффекте «cloud point» экстракции.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Для количественного определения новокаина в жидких лекарственных формах готовят исходный 1⋅ 10^-2 М раствор реагента - 4-диметиламинобензальдегида (ДМАБА) в 7 ⋅ 10^-2 М растворе анионного ПАВ додецилсульфата натрия (ДДС). Для этого навески 0,1490 г ДМАБА и 2,019 г ДДС помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют дистиллированную воду на 2/3 объема колбы, диспергируют компоненты смеси в ультразвуковой установке 5 – 10 минут. После осаждения пены ДДС доводят содержимое колбы дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают.

Построение градуировочного графика.

Точную навеску сухого препарата новокаина (гидрохлорида 2-диэтиламиноэтилового эфира п-аминобензойной кислоты) 0,0025 г помещают в мерную колбу на 25 мл и растворяют в дистиллированной воде при нагревании на водяной бане. Стандартный раствор содержит 100 мкг/мл новокаина (раствор А). Для получения раствора новокаина с концентрацией 10 мкг/мл (раствор Б) стандартный раствор разбавляют дистиллированной водой в 10 раз.

Для построения градуировочной характеристики в 10 мерных колб емкостью V_общ = 25 мл помещают отмеренные объемы 0,095 (0,95 мкг/мл); 0,2 (2 мкг/мл); 0,5 (5 мкг/мл); 1,0 (10 мкг/мл) мл раствора Б, а также 0,3 (30 мкг/мл); 0,5 (50 мкг/мл); 0,7 (70 мкг/ мл); 0,9 (90 мкг/мл); 1,1 (110 мкг/мл); 1,3 (130 мкг/мл) раствора А, в каждую колбу добавляют по 2,5 мл 1 ⋅ 10^-2 М раствора ДМАБА, приготовленного в 7 ⋅ 10^-2 М растворе ДДС. После этого доводят объем в каждой колбе до 15 - 20 мл цитратным буферным раствором с рН = 2,5 – 3,5 и перемешивают. В течение 1 минуты при комнатной температуре наблюдают развитие ярко-желтого окрашивания растворов, характерное продукту взаимодействия новокаина с ДМАБА. Далее в каждую колбу добавляют 2,5 мл 4 ⋅ 10^-2 М раствора неионного ПАВ – Тритона Х – 114, перемешивают, вносят 5 мл 20 % - ного раствора NaCl, доводят до метки буферным раствором и снова перемешивают. Наблюдают помутнение системы. Полученные гомогенные растворы помещают в центрифугу на 5 минут (число оборотов n = 3000) для ускорения образования мицеллярной фазы. После центрифугирования наблюдают образование двухфазной системы с окрашенной в ярко-желтый цвет мицеллярно-насыщенной фазой, локализующейся в нижней части расслаивающейся системы. При фотометрическом детектировании полученные мицеллярные экстракты отделяют от водной фазы декантацией, разбавляют цитратным буферным раствором (рН = 2,5 – 3,5) в соотношении 1 часть мицеллярно-насыщенной фазы и 4 части буферного раствора и измеряют оптическую плотность полученного окрашенного раствора с помощью спектрофотометра Shimadzu UV – 1800 в кювете с l = 1 см при длине волны 469 нм относительно цитратного буферного раствора. Подчинение интенсивности поглощения окрашенных растворов закону Бугера – Ламберта – Бера находятся в пределах концентраций 0,038 – 4,8 мкг/мл.

Пример 2.

Для количественного определения новокаина в ампульных 0,5% -ных растворах для инъекций готовят рабочий раствор, содержащий 100 мкг/мл, путем разбавления 0,5%-ного раствора новокаина дистиллированной водой.

Вносят 0,3 мл приготовленного раствора в колбу вместимостью 25 мл, добавляют по 2,5 мл 1 ⋅ 10^-2 М раствора ДМАБА, приготовленного в 7 ⋅ 10^-2 М растворе ДДС, доводят объем в колбе до 15 - 20 мл цитратным буферным раствором с рН = 2,5 – 3,5 и перемешивают. Далее в колбу добавляют 2,5 мл 4 ⋅ 10^-2 М раствора Тритона Х – 114, перемешивают, вносят 5 мл 20 % - ного раствора NaCl, доводят до метки буферным раствором и перемешивают. Полученные гомогенные растворы помещают в центрифугу на 5 минут (число оборотов n = 3000) для ускорения образования мицеллярной фазы. Полученные мицеллярные фазы фотометрируют аналогично примеру 1. Определение новокаина проводят по вышеописанной градуировочной характеристике.

Результаты определения приведены в таблице 1. Анализ данных, представленных в табл. 1, позволяет заключить, что предлагаемый способ определения новокаина отличается хорошей воспроизводимостью и правильностью.

Установлены оптимальные концентрации в реакционной системе: ДМАБА и ДДС (табл. 2), Тритона Х-114 (табл. 4), NaCl (табл. 5), а также оптимальный интервал рН (табл. 3). Последовательность проводимых операций аналогично примеру 2.

Как видно из табл. 2, введение в реакционную смесь 1,5 – 5,0 мл 1 ⋅ 10^-2 М раствора ДМАБА, диспергированного в 7 ⋅ 10^-2 М растворе ДДС, позволяет достигать наименьших ошибок определения новокаина не превышающих 7 - 8 %. Таким образом, оптимальные концентрации в реакционной смеси ДМАБА и ДДС составляют соответственно 4 ⋅ 10^-4 ≤ С ≤ 2 ⋅ 10^-3 М и 3 ⋅ 10^-3 ≤ С ≤ 1,4 ⋅ 10^-2 М.

Зависимость результатов определения новокаина от рН представлены в табл.3. Оптимальный интервал рН, создаваемый цитратными буферными растворами, составил 2,5 – 3,5.

Как следует из табл. 4, ошибка определения новокаина минимальна в интервале концентраций неионного ПАВ (Тритона Х – 114) 2 ⋅ 10^-3 ≤ С ≤ 1 ⋅ 10^-2 М.

Данные табл. 5 свидетельствуют о том, что в интервале концентраций 0,5 – 1,0 М высаливателя NaCl достигается наименьшая ошибка определения новокаина.

Установлены границы определяемых содержаний новокаина (l = 1 см), которые представлены в табл. 6, в интервале концентраций 0,95 – 120 мкг/ 25 мл (38 – 4800 нг/мл) с погрешностью, не превышающей 7 %, в отличие от прототипа, в котором диапазон определяемых содержаний составляет 400 – 5600 нг/мл.

Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить чувствительность определения новокаина путем снижения предела его обнаружения.