Способ стимуляции метаболизма культур клеток MDBK для репродукции вирусов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования линий клеток животных и репродукции на них вирусов.

Известен способ активации метаболизма клеток in vitro путем использования в качество активаторов сыворотки крови, белковых гидролизатов животных (см. кн. Л.П. Дьяконова «Животная клетка в культуре» М.: Спутник+, 2009, 665 с.) и растительного (см. статью Г.П. Трошкова и др.» Совершенствование технологии питательных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки. - Биотехнология. - 2006. №4. - с. 74-78) происхождения.

Известен также способ активации культур клеток путем использования биодобавки-фито-зооэкстракта из щуки и кабачков (Хазиев Л.Р. Влияние фито-зооэкстрактов на вируспродуцирующие свойства культивируемых клеток: Автореферат дисс… канд. биол. наук. - Казань, 2013. - 16 с.).

Общим недостатком известных способов является использование дорогостоящего животного и растительного сырья, сложность технологии их получения, а также возможность контаминации питательных сред микроорганизмами и прионами, содержащимися в сыворотке крови, гидролизатах тканей и органов животных.

Известен также способ активации культур клеток путем использования природного биополимера-апизана (Патент RU №2649360, МПК С08В 37/08, опубл. 02.04.2018) и пептидов, стимулирующих пролиферацию фибробластов (Патент RU №2211046, МПК А61К 38/08, опубл. 27.08.2003 - прототип). Общим недостатком этих способов является сложность промышленного синтеза.

Вместе с тем известно, что в настоящее время эффективными, стимулирующими рост средствами являются, например, рекомбинантные цитокины (интерлейкины, эритропоэтин, колониестимулирующие факторы), производные гликозаминогликанов (D-глюкуроновая кислота, N-ацетилнейраминовая кислота, глицирам), эпидермальный фактор роста, гепаринсвязывающие факторы роста и многие другие (Патент РФ 2179578, C12N 5/00 C12N 5/06 A61N 1/36. - Опубл. 20.02.2002).

Цитокины оказывают влияние практически на все клетки, воздействуя на большинство процессов, протекающих в организме (Авдеева Ж.И. и др. Цитокины и вакцины. - Тихоокеанский медицинский журнал, 2009. - №3. - С. 22-27).

В результате многочисленных исследований к настоящему времени обнаружен ряд биологических эффектов цитокинов: иммуностимулирующий, противовирусный, антибактериальный и др., способность стимулировать пролиферацию клеток.

В литературе отражены результаты отдельных исследований, свидетельствующие о возможности стимулирующих и ингибирующих эффектов цитокинов в отношении ангиогенеза. Однако результаты этих исследований чрезвычайно вариабельны. Это связано с многообразием используемых экспериментальных систем и с гетерогенностью эндотелиальных клеток (ЭК). Результаты, полученные на первичных культурах ЭК, отличаются от результатов, полученных на перевиваемых культурах. Эффекты разных цитокинов изучались в разных экспериментальных системах и полученные результаты не сопоставимы (Амчиславский Е.В. Изучение влияния цитокинов на функции эндотелиальных клеток человека перевиваемой линии ЕА.Ну926: Автореферат дисс… канд. мед. наук. - Санкт-Петербург, 2006. - 26 с.).

Использование цитокинов имеет ряд преимуществ перед другими препаратами (вакцины, сыворотки): во-первых, небольшие дозы цитокинов индуцируют интенсивный иммунный ответ и запускают синтез собственных медиаторов; во-вторых, многие цитокины обладают полифункциональностью (например, ИНФ), оказывая противовирусное, антибактериальное, противоопухолевое действие, в-третьих, применение цитокинов сочетается с другими медиаторами, вакцинами, антибиотиками, сыворотками и т.д. (Ада, Г. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ / Г. Ада, А. Рамсей: пер. с англ. - М.: Медицина, 2002. - 344 с.).

Известны пародонтальные пептиды и синтетический пептид формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu, стимулирующие пролиферацию фибробластов (см АС СССР 1637077, МПК⁶ A61K 35/37, опубл. 25.04.1989; Патент РФ №2211046, МПК⁷ А61К 38/08. Пептиды, содержащие 5-11 аминокислот / Цепелев В.Л. и др. - Опубл. 27.08.2003). Однако данные пептиды получены синтетическим путем и обладают низкой биологической активностью (оптимальные концентрации - 0,5-50 мкг/мл). Это требует применения больших доз препаратов и влечет возможное появление аллергических и других нежелательных побочных эффектов.

Известны монокины - полипептидные молекулы, продуцируемые клетками макрофагально-моноцитарного ряда и относящиеся к классу цитокинов, которые обладают широким спектром биологической активности, в том числе стимулировать пролиферацию фибробластов, гладкомышечных клеток, клеток эпителия и эндотелия (см. статью Е.Б. Жибурта и др. «Цитокины в кроветворении иммуногенеза и воспаления // Терра Медика Нова. - 1996. - N 3 (4) / - С. 15-20).

Настоящее изобретение направлено на расширение арсенала и повышение биологической активности средств, стимулирующих пролиферацию культур клеток животных, используемых для репродукции на них вирусов при изготовлении вирус-вакцин.

Поставленная задача достигается за счет внесения в питательную среду стимулятора роста и развития клеток MDBK - биологически активного препарата в дозе 30-60 пг/мл интерлейкина-6 (IL-6).

Использование колибровочных проб коммерческого биологически активного препарата интерлейкина-6 (IL-6) производства ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург), в дозе 30-60 пг/мл приводит к существенному повышению пролиферативной активности и чувствительности культур клеток к вирусам.

Интерлейкин-6 является провоспалительным цитокином с молекулярной массой 26000 Да. IL-6 продуцируется лимфоидными клетками, нормальными и трансформированными клетками, включая Т-клетки, моноциты, фибробласты, гепатоциты. Он обладает множеством биологических активностей, таких как индукция синтеза белков, стимуляция и дифференцировка лимфоцитов (Инструкция по применению набора реактивов для иммуноферментного анализа интерлейкина-6 человека «ИФА-IL-6»).

Способ стимуляции метаболизма культур клеток MDBK для репродукции вирусов иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение цитотоксичности интерлейкина-6 на культуру клеток линии MDBK

Перед началом основных опытов по изучению биологического действия IL-6, в соответствии с требованиями Фармакопеи РФ, проводили изучение цитотоксичности препарата для культуры клеток MDBK. Для этого испытуемый препарат IL-6, расфасованный в ампулы по 1 см³ (1000 пг/мл), вскрывали и содержимое ампулы разводили стерильной деионизированной водой до концентраций 10, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000 пг/мл. Для определения цитотоксичности IL-6, вышеуказанные концентрации цитокина вносили в питательные среды, засевали их культурой клеток MDBK из расчета 4×10⁵ кл/мл и культивировали их в течение 24 часов. По истечении указанной экспозиции клетки рассевали в 96-луночные панели по 100 тыс. клеток/мл, инкубировали при 37°С в течение 72 ч и добавляли по 20 мкл раствора нитросинего тетразолия (НТ). Время инкубации с НТ - 4 ч в термостате при 37°С. Токсичность IL-6 оценивали по жизнеспособности клеток тест-культуры по изменению оптической плотности суспензии обработанных испытуемым препаратом клеток MDBK.

Оценку цитотоксических свойств испытуемого препарата (IL-6) на культуру клеток MDBK проводили по МТС-тесту, основанному на восстановление митохондриальными дегидрогеназами в метаболически активных клетках тетразолия в растворимый формазан, который поглощается при 490 нм. Этот тест позволяет анализировать NAD(Р)Н-зависимые оксидоредуктазные ферменты, которые отражают количество жизнеспособных клеток (Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods. - 1983. - V. 65. - N 1-2. - P. 55-63). Результаты выражали в виде цитотоксического индекса (ЦИ) (табл. 1).

Из данных таблицы видно, что внесение IL-6 в культивируемую среду в концентрации 150 пг/мл незначительно (на 7%) подавляет дыхание митохондрий клеток MDBK, а дальнейшее повышение концентрации цитокина приводит к значительному торможению дыхания, которое составляет при концентрации 200 пг/мл - 30%, при 250 пг/мл - 35%, при 500 пг/мл - 53% и при 1000 пг/мл - 80%.

Таким образом, минимальная переносимая доза (МПД) IL-6 для клеток MDBK равняется 150-200 пг/мл, а минимально цитотоксическая доза -1000 и более пг/мл.

Пример 2. Определение концентрации IL-6 в ростовой среде, обеспечивающей оптимальный рост культуры клеток MDBK.

Биохимическую активность предполагаемого средства изучали по его действию на культуру клеток почки крупного рогатого скота (MDBK). В качестве ростовой среды в опытах использовали среду Игла MEM, содержащую 20% сыворотки крови коров (СКК). Среду засевали клетками MDBK в концентрации 3×10⁵ кл/мл. В культуру клеток вносили IL-6 в концентрациях от 30 до 300 пг/мл. В качестве контроля использовали пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu из расчета 0,05 мкг/мл. Клетки культивировали в течение 72 ч при 37°С в CO₂-инкубаторе (BINDER).

Результаты исследований представлены в таблице 2.

Установлено, что предлагаемое средство оказывает стимулирующее влияние на пролиферацию клеток MDBK в культуре. Так, при микроскопической оценке, под влиянием IL-6 возрастает число клеток, причем отмечен доза - эффект.

Цитокин IL-6 стимулирует пролиферацию клеток MDBK в диапазоне концентраций от 30 до 60 пг/мл. Пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu (прототип) обладает подобным действием, однако он эффективен в концентрациях от 10000 до 500000 пг/мл. Таким образом, минимальная концентрация, в которой заявляемое средство способствует усилению пролиферации клеток

MDBK в культуре клеток, на 6 порядков (0,5×10^-6 г/мл, 60,0×10^-12 г/мл) меньше, чем у пептида, что указывает на более высокую специфическую активность цитокина IL-6.

Пример 3. Определение оптимальной линии культур клеток, обеспечивающей максимальный рост под влиянием используемого цитокина. Для этого в опытах использовали четыре линии клеток, наиболее часто используемые в биотехнологии для изготовления вирус-вакцин: LEK, MDBK, PK-15 и VERO, в концентрации 40 тыс. кл/мл. Перечисленные культуры клеток засевали на среду Игла MEM, вносили оптимальные концентрации цитокина IL-6 (60 пг/мл) и посевы инкубировали в течение 72 часов. По истечении указанной экспозиции клетки снимали со стекла раствором версена (1:3) и подвергали микроскопированию с использованием камеры Горяева. Результаты оценивали по индексу пролиферации (ИП) по общепринятому методу.

Результаты ростстимулирующей активности испытуемого цитокина на вышеуказанные перевиваемых линии культур клеток приведены в таблице 3.

Из данных таблицы видно, что из испытанных 4 линий клеток, используемых в биотехнологии, наиболее высокой цитокинстимулированной пролиферирующей активностью обладали клетки линии MDBK, индекс пролиферации которой превышал контрольные значение в 1,33 раза (Р<0,01), в то же время как этот показатель у других линий клеток был значительно меньше, чем у MDBK.

Пример 4 Изучение репродукции вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и парагриппа-3 (ПГ-3) на перевиваемой культуре MDBK, стимулированной IL-6

Культуру клеток MDBK выращивали на ростовой среде, содержащей 60 пг/мл IL-6, до формирования конфлюэнтного монослоя.

В опыте были использованы: вирус ИРТ штамм «ТК-А (ВИЭВ)-В2»; вирус ПГ-3 шт. «SF-4».

В ходе эксперимента нами было проведено 3 последовательных пассажа каждого вируса. Уровень накопления вируса в культуре клеток определяли методом титрования по общепринятой методике.

Результаты проведенных исследований по репродукции вирусов ИРТ и ПГ-3 клетками линии MDBK в цитокинсодержащей и сывороточной (контрольной) средах представлены в таблице 4.

Из данных таблицы 4 видно, что цитокинстимулированная культура клеток MDBK обладает более высокой вируспродуцирующей активностью по сравнению с таковой, выращенной без цитокина.

Таким образом, применение IL-6 для выращивания перевиваемой линии культуры клеток позволяет получать вирусную массу с достаточно высокой инфекционной активностью при изготовлении диагностических и профилактических препаратов.