Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДО- И ЛАКТОБАКТЕРИЙ

Настоящее изобретение относится к получению питательных сред с использованием крахмалосодержащего зернового сырья для выращивания бифидо- и лактобактерий, и может быть использовано в биотехнологии, пищевых производствах и при получении кормовых добавок для сельскохозяйственных животных, птиц и аквакультур.

Известен способ получения питательной среды для выращивания бифидобактерий на основе кислотно-щелочного гидролизата бобовых, в частности гороха, с добавлением пептона, лактозы, хлористого натрия и агара (патент RU №94026139). При этом среды, получаемые на основе кислотно-щелочного гидролизата гороха, люпина или люцерны, обеспечивают наращивание биомассы бифидобактерий к 16-24 ч культивирования с числом живых клеток не ниже 10⁸ КОЕ/мл. Основным недостатком изобретения является использование для гидролиза возобновляемого растительного сырья химически агрессивных кислот и щелочей, что может приводить к образованию побочных продуктов, ингибирующих рост пробиотических микроорганизмов.

Известен способ получения функционального продукта питания культивированием штамма пробиотических бактерий Bifidobacterium lactis Bb-12 на гидролизатах пшеничных отрубей, полученных при обработке а-амилазами и комплексами ксиланаз, гемицеллюлаз, глюканаз и целлюлаз. Содержание активных бифидобактерий в конечном продукте составляло 10⁵ КОЕ/г (Radenkovs V. et al. Wheat Bran Carbohydrates as Substrate for Bifidobacterium lactis Development. International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering. 2013. Vol.7. No.7. P. 605-610). При этом дополнительные компоненты, а именно источники белковых соединений, которые могли бы стимулировать рост культуры, в гидролизаты не вносили и в то же время предварительную обработку белковых веществ субстрата для повышения их биодоступности протеолитическими ферментными препаратами также не осуществляли, в результате чего содержание бактерий в продукте было сравнительно не велико.

Известен способ получения питательных сред для молочнокислых бактерий на основе солода, ячменя и пшеницы, заключающийся в четырехкратной экстракции белковых и углеводных компонентов центрифугированием водных суспензий муки с последующей стерилизацией. При этом наибольший рост лактобактерий наблюдался на солодовой питательной среде и достигал 8,1-10,1 log₁₀ (КОЕ/мл) (Charalampopoulos D. et al. Growth studies of potentially probiotic lactic acid bacteria in cereal-based substrates. Journal of Applied Microbiology. 2002. No.92. P. 851-859). Основным недостатком такого способа получения питательных сред является неполное использование потенциала компонентов муки зерновых молочнокислыми бактериями, лишь частично экстрагируемых в раствор.

Наиболее близким к заявленному способу является патент США №6159724 «Способ получения питательных сред для культивирования дрожжей и молочнокислых бактерий» (прототип). Способ включает в себя три варианта приготовления питательной среды: 1) питательную среду готовят с использованием автолизата дрожжей, зерна и ростков пшеницы, а также крахмала и глютена; 2) питательную среду готовят аналогично первой, но вместо глютена, она содержит белки 3) питательную среду готовят объединением питательных сред, полученных по 1 и 2 варианту. В питательные среды добавляют ферменты альфа-амилазы и амилоглюкозидазу для гидролиза крахмала в глюкозу. Кроме того, для гидролиза клейковины и протеинов в ароматические пептиды и свободные аминокислоты, стимулирующие микробный рост, также добавляют протеолитические ферменты. Среду стерилизуют и добавляют поваренную или морскую соль. Гидролиз ферментами проводят без поддержания рН. Питательные среды инокулируют индивидуальными культурами дрожжей или молочнокислых бактерий, либо проводят совместное культивирование. Недостатком изобретения является использование в среде дрожжевого автолизата и поваренной соли, которые могут повлиять на органолептические свойства конечного жидкого функционального пищевого продукта. Также в работе не рассматривается возможность культивирования на гидролизатах зернового сырья бифидобактерий.

Технической задачей настоящего изобретения является повышение биодоступности протеина и глюкозы для пробиотических бактерий в питательных средах на основе крахмалосодержащего зернового сырья путем обработки протеолитическими и амилолитическими ферментными препаратами таким образом, что внесение дополнительных дорогостоящих компонентов животного происхождения не требуется, а внесение дрожжевых добавок, которые отрицательно влияют на органолептические показатели пробиотических продуктов, ограничено.

Поставленная задача решается путем получения питательных сред для культивирования бифидо- и лактобактерий, представляющих собой Lactobacillus rhamnosus или Lactobacillus bulgaricus или Lactobacillus acidophilus или Lactobacillus helveticus или Lactobacillus paracasei или Lactobacillus plantarum или Bifidobacterium adolescentis или Bifidobacterium breve или Bifidobacterium bifidum или Bifidobacterium infantis или Bifidobacterium pseudolongum или Bifidobacterium longam, полученных посредством предварительной обработки суспензий возобновляемого крахмалосодержащего зернового сырья в соотношении с водой 1:5 - 1:40 протеолитическим ферментным препаратом Protex 40Е или Панкреатин в дозировке 0,5-4,0% по отношению к содержанию белка и амилолитическим ферментным препаратом Duozyme в дозировке 1,0-3,0%. по отношению к содержанию сухого вещества. Содержание пробиотических: бактерий на конец культивирования без поддержания рН составляет не менее 10⁸ КОЕ/мл, в условиях pH-статирования - не менее 10⁹ КОЕ/мл.

Технический результат настоящего изобретения заключается в повышении биодоступности крахмалосодержащего зернового сырья, как источника азота и углерода для пробиотических бактерий, что ведет к увеличению концентрации жизнеспособных клеток с 10⁵-10⁶ КОЕ/мл до 10⁸-10⁹ КОЕ/мл, и создании на основе полученных гидролизатов питательных сред и новых ферментированных пробиотических продуктов, способствующих расширению ассортимента продукции, в том числе, с высоким содержанием бифидобактерий, для производства которых не используется сырье животного происхождения, а также либо сокращении (за счет ферментативных гидролизатов и экстрактов растительного сырья), либо полном исключении дополнительных питательных компонентов в среде. Ниже приведены примеры реализации способа.

Пример 1. Крахмалосодержащее зерновое сырье смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5-1:40, суспензию стерилизуют автоклавированием и инокулируют пробиотическими микроорганизмами. Рост бактерий В. adolescentis после 24 ч ферментации отсутствовал. При культивировании на суспензиях лактобактерий конечное содержание L. plantarum не превышало 10⁵ КОЕ/мл при использовании гречневой муки и 10⁶ КОЕ/мл при использовании пшеничной муки.

Пример 2. Муку крахмалосодержащего зернового сырья смешивают с дистиллированной водой, суспензию стерилизуют автоклавированием в течение 5 мин, охлаждают до температуры гидролиза, помещают в термостатируемую водяную баню и вносят амилолитический ферментный препарат Duozyme (Novosymes). Осахаривание и разжижение крахмала проводят в течение 90 мин при температуре 60°С и рН 5,5. Затем вносят протеолитический ферментный препарат Protex 40Е (Genencor). Гидролиз протеина муки проводят в течение 90 мин при температуре 60°С и рН 8,6. В полученный стерильный ферментолизат вносят инокулят суточной культуры молочнокислых бактерий и ферментируют в течение 15-24 ч без поддержания рН (таблица 1).

Использование гидромодуля менее 1:5 приводит к ухудшению реологических свойств, а гидромодуля более 1:40 к уменьшению численности жизнеспособных клеток.

Пример 3. Пшеничную муку высшего сорта смешивают с дистиллированной водой, помещают в термостатируемую водяную баню и вносят протеолитический ферментный препарат Панкреатин (Panreac). Гидролиз протеина пшеничной муки проводят в течение 90 мин при температуре 40°С и рН 8,0. Ферментолизат фильтруют через бельтинг и на его основе готовят питательную среду с добавлением дрожжевого экстракта (5 г/л), L-цистеина (0,5 г/л), аскорбиновой кислоты (0,5 г/л), глюкозы (10 г/л) и минеральной составляющей среды MRS. При этом все компоненты животного происхождения в питательной среде заменены на ферментолизат. В полученную питательную среду вносят 18 ч инокулят бифидобактерий и ферментируют в течение 15-24 ч без поддержания рН (таблица 2).

Использование гидромодуля менее 1:5 приводит к ухудшению реологических свойств и невозможности фильтрования через бельтинг, а гидромодуля более 1:40 к ухудшению роста бифидобактерий.

Пример 4. Пшеничную муку высшего сорта смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5,43, помещают в биореактор, нагревают до температуры гидролиза и дробно на 0 мин и 90 мин вносят протеолитический ферментный препарат Панкреатин (Panreac) в суммарной дозировке 2% от содержания белка в муке. Гидролиз проводят в течение 180 мин при температуре 45°С в условиях поддержания рН 8,0. На основе фильтрованного через бельтинг ферментолизата готовят питательную среду с добавлением дрожжевого экстракта (5 г/л), L-цистеина (0,5 г/л), аскорбиновой кислоты (0,5 г/л), глюкозы (10 г/л) и минеральной составляющей среды MRS. При этом все компоненты животного происхождения заменены на ферментолизат. В готовую стерильную питательную среду вносят 18 ч инокулят бифидобактерий В. adolescentis и ферментируют в течение 18-24 ч при температуре 37°С в условиях поддержания pH 6,5-7,0. Получаемый при этом титр бифидобактерий не менее 3,0×10⁹ КОЕ/мл.