Результат интеллектуальной деятельности: Способ индивидуального прогнозирования сроков прогрессирования плоскоклеточного рака пищевода II-III стадии после хирургического лечения

Изобретение относится к медицине, а именно, к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования прогрессирования плоскоклеточного рака пищевода I-III стадии после хирургического лечения.

Из литературных источников известно, что иммунологическое микроокружение злокачественных опухолей неодинаково при различной локализации, гистологической характеристике (см. О.И. Кит, Е.Ю. Златник, Е.А. Никипелова, И.А. Новикова, Ю.А. Геворкян Влияние гистологического строения и органного окружения на факторы локального иммунитета при раке желудка и толстой кишки // Международный журнал экспериментального образования. Медицинские науки. 2014. №1. С. 76-79), стадии и плоидности опухоли при колоректальном раке (см. О.И. Кит, Е.Ю. Златник, Е.А. Никипелова, И.А. Новикова, А.В. Бахтин, О.Н. Селютина Взаимоотношения плоидности и параметров локального иммунитета при опухолях толстой кишки Молекулярная медицина. 2016. №1. С. 26-30; см. O.I. Kit, Е.А. Nikipelova, E.Yu. Zlatnik, A.V. Shaposhnikov, LA. Novikova, R.E. Tolmakh Local cell-mediated immunity in stage III and IV colon cancer // 2014 ASCO Annual Meeting May 30-June 3 2014 - published on Meeting Library (http://meetinglibrary.asco.org) e 22097), степени ее дифференцировки при раке пищевода (см. А.Ю. Максимов, Е.Ю. Златник, И.А. Новикова, Г.И. Закора, О.И. Кит, Е.Н., Колесников, B.C. Трифанов, О.Н. Селютина, А.Л. Базаев Факторы локального иммунитета при раке пищевода разной степени дифференцировки Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №6; URL:http://www.science-education.ru/128-22552) и других факторах, определяющих прогноз заболевания, что позволяет рассматривать особенности локального иммунитета в прогностическом аспекте.

Основными критериями прогнозирования течения рака пищевода являются поражение регионарных лимфатических узлов (N+/N-), глубина инвазии опухоли (Т). Тем не менее, важное значение для развития прогрессирования многих злокачественных опухолей, в том числе и пищевода, играет локальная микросреда, содержащая факторы роста опухоли и неоангиогенеза, что не учитывается при стандартном тестировании. Такими свойствами обладают цитокины - молекулы, продуцируемые активированными иммунокомпетентными клетками, в частности, IL-10 и TGF-β вырабатываемые T-reg лимфоцитами (см. Asadullah, K. Interleukin-10 therapy - review of a new approach / K. Asadullah, W. Sterry, H.D. Volk // Pharmacological Reviews. - 2003. - Vol. 55, №2. - P. 241-269; Curiel, T.J. Specific recruitment of regulatory T-cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival / T.J. Curiel, G. Coukos, L. Zou [et al.] // Nat.Med. - 2004. - Vol. 10. - P. 942-949. DOI: 10.1038/nm1093), способными накапливаться в ткани различных злокачественных опухолей, что показано на примере меланомы кожи (см. Е.Ю. Златник, Ю.В. Пржедецкий, С.С. Кочуев, И.А. Новикова, Е.М. Непомнящая, Г.И. Закора, Е.С. Бондаренко, B.В. Позднякова Иммунологические факторы в ткани меланомы кожи различной распространенности Мед. вестник Северного Кавказа 2018. №1. С. 44-49), сарком мягких тканей (см. Е.Ю. Златник, И.А. Новикова, Е.М. Непомнящая, О.Н. Селютина, Т.В. Аушева, Т.А. Алиев, Л.Н. Ващенко, Е.П. Ульянова, Н.М. Мащенко Возможности прогнозирования эффективности лечения сарком мягких тканей на основе особенностей их иммунологического микроокружения Казанский мед. журнал 2018. Т. 99, №1. C. 167-173) и других злокачественных опухолей.

В настоящее время известно, что регуляторные Т-клетки (T-reg) играют существенную роль в развитии иммуносупрессии при злокачественных опухолях, подавляя ответ эффекторных Т-клеток (см. Sasada, Т. CD4+CD25+ regulatory Т cells in patients with gastrointestinal malignancies / T. Sasada, M. Kimura, Y. Yoshida, M. Kanai, A. Takabayashi // Cancer. - 2003; 98:1089-99; см. Sakaguchi, S. Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses / S. Sakaguchi // Annu. Rev. Immunol. - 2004. - Vol. 22. - P. 531-562). Их иммунофенотип различными авторами характеризуется по-разному, что подразумевает гетерогенность этой субпопуляции. Тем не менее, рядом исследователей установлена функциональная идентичность лимфоцитов, имеющих классический иммунофенотип T-reg: CD4+CD25+FoxP3+ и CD4+CD127dim+ лимфоцитов (см. Селькова, М.С. Особенности содержания Т-регуляторных лимфоцитов и NK-клеток у пациентов с хроническим гепатитом С / М.С. Селькова, А.В. Селютин, С.А. Сельков // Инфекции и иммунитет. - 2012. - Т. 2, №4. - С. 715-722; Fazekas St., Groth В., Zhu Е., Asad S., Lee L. Flow cytometric detection of human regulatory T-cells. // Methods Mol. Biol. - 2011. - v. 114. №9. - P. 1209-1217). В литературе существуют противоречивые взгляды на значение лимфоцитарной инфильтрации опухолей, в частности, пищевода. Так, по данным ряда авторов (см. Cho, Y. CD4+ and CD8+ Т cells cooperate to improve prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma / Y. Cho, M. Miyamoto, K. Kato et al. // Cancer Res. - 2003; 63:1555-9; см. Yoshioka, T. Infiltrating regulatory T cell numbers is not a factor to predict patient's survival in oesophageal squamous cell cancer / T. Yoshioka, M. Miyamoto, Y. Cho et al. // Br J Cancer. - 2008; 98:1258-63; см. Tsuchikawa, T. Association of CD8+ T cell infiltration in oesophageal carcinoma lesions with human leucocyte antigen (HLA) class I antigen expression and survival / T. Tsuchikawa, H. Ikeda, Y. Cho et al. // Clin ExpImmunol. - 2011; 164:50-6), инфильтрация опухоли CD4+ или CD8+ Т-клетками предполагает положительный прогноз при плоскоклеточном раке. Однако другие исследователи (см. Zingg, U. Tumour-infiltrating lymphocytes and survival in patients with adenocarcinoma of the oesophagus / U. Zingg, M. Montani, D.M. Frey, S. Dirnhofer, A.J. Esterman, P. Went, D. Oertli // EJSO 36 (2010) 670e677 J of clin surgery. P. 670-677) не обнаружили статистически значимой взаимосвязи наличия и состава опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов с клиническими результатами, в частности, с увеличением выживаемости больных раком пищевода, хотя такая корреляция установлена при раке яичников (см. Zhang, L. Intratumoral Т cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer / L. Zhang, J.R. Conejo-Gracia, D. Katsaros et al. // N Engl J Med. - 2003; 348: 203-13; см. Sato, E.Intraepithelial CD8+ tumour-infiltrating lymphocytes and a high CD8/regulatory T cell ratio are associated with favourable prognosis in ovarian cancer / E. Sato, S.H. Olson, J. Arm et al. // Proc Natl Acad Sci. - 2005; 102: 18538-43) и аденокарциноме поджелудочной железы (см. Fukunaga, A. CD8p tumour-infiltrating lymphocytes together with CD4p tumour-infiltration lymphocytes and dendritic cells improve the prognosis of patients with pancreatic adenocarcinoma / A. Fukunaga, M. Miyamoto, Y. Cho et al. // Pancreas. - 2004; 28:e26-31).

Учитывая приведенные выше данные о роли локального иммунологического микроокружения злокачественных опухолей в их прогрессировании, представляется важной разработка иммунологических тестов, направленных на улучшение диагностики, прогнозирования и возможной коррекции лечения плоскоклеточного рака пищевода.

Описано усиление инфильтрации опухоли пищевода T-reg лимфоцитами при более распространенных стадиях заболевания (см. Kono, K.CD4+CD25 high regulatory Т cells increase with tumour stage in patients with gastric and oesophageal cancers / K. Kono, H. Kawaida, A. Takahashi et al. // Cancer Immunol Immunother. - 2006; 55:1064-71), однако, из данной работы остается неясным наличие или отсутствие вклада иммунологического микроокружения в развитие клинического эффекта.

Известен способ прогнозирования течения рака пищевода, предусматривающий иммунологическое исследование гомогената ткани опухоли, перитуморальной зоны и линии резекции с определением процентного содержания T-reg и CD8+ Т-лимфоцитов и вычислением коэффициентов К1, К2 и К3 (см. Патент RU №2640954 «Способ прогнозирования прогрессирования рака пищевода» Кит О.И., Златник Е.Ю., Селютина О.Н., Максимов А.Ю., Базаев А.Л., Е.Н. Колесников, Новикова И.А., опубл. 12.01.2018, Бюл. №2). Однако этот способ не предусматривает разграничения по срокам прогрессирования и не имеет математической формализации.

Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является повышение точности и информативности способа прогнозирования прогрессирования рака пищевода, включая разграничение сроков его прогрессирования и их индивидуализацию.

Технический результат достигают тем, что в биоптате опухоли определяют содержание лимфоцитов с иммунофенотипом CD45+, CD3+, CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD16/56+ и CD3+CD4+CD127dim (T-reg), затем рассчитывают показатели: отсутствие риска прогрессирования в течение 2-х и более лет после операции - F₀ по формуле F₀=0,39*Х1+0,0095*Х2-9,86, где

X1 - процентное содержание CD3+CD4+ от общего количества лимфоцитов,

Х2 - процентное содержание T-reg лимфоцитов от количества CD3+CD4+клеток,

0,39 и 0,0095 - коэффициенты,

-9,86 - константа;

прогрессирование заболевания в течение 6-12 месяцев после операции - F_6-12 по формуле F_6-12=0,24*Х1+0,12*Х2-6,7, где

X1 - процентное содержание CD3+CD4+ от общего количества лимфоцитов,

Х2 - процентное содержание T-reg лимфоцитов от количества CD3+CD4+клеток,

0,24, и 0,12 - коэффициенты,

-6,7 - константа;

прогрессирование заболевания в течение 12-24 месяцев после операции - F_12-24 по формуле F_12-24=0,39*X1+0,066*X2-11,57, где

X1 - процентное содержание CD3+CD4+ от общего количества лимфоцитов,

Х2 - процентное содержание T-reg лимфоцитов от количества CD3+CD4+клеток,

0,39 и 0,066 - коэффициенты,

-11,57 - константа,

полученные значения показателей F₀, F_6-12, F_12-24 сравнивают между собой, по максимальному значению F прогнозируют срок прогрессирования рака пищевода после хирургического лечения.

Нами проведено изучение показателей лимфоцитарного состава в ткани опухоли у 36 больных плоскоклеточным раком пищевода II-III стадии с различными сроками до развития прогрессирования заболевания после хирургического лечения. В биоптатах опухоли определяли содержание лимфоцитов с иммунофенотипом CD45+, CD3+, CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD16/56+ и CD3+CD4+CD127dim (T-reg).

В зависимости от сроков прогрессирования заболевания после хирургического лечения исследованные пациенты были распределены на разные подгруппы: подгруппа 0 - отсутствует прогрессирование рака пищевода в течение 2-х и более лет после операции, подгруппа 1 - наличие прогрессирования заболевания в течение 6-12 мес., подгруппа 2 - наличие прогрессирования в течение 12-24 мес.

Модель разработана с помощью пошагового дискриминантного анализа (см. Омельченко, В.П. Автоматизированные медико-технологические системы клинико-лабораторных исследований / В.П. Омельченко, А.А. Демидова // Медицинская информатика: Учебник. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2016. - С. 395-427).

На первом этапе путем пошагового включения различных показателей в модель были выбраны два параметра с наибольшей и статистически значимой дискриминантной мощностью. Ими оказались процентное содержание CD3+CD4+ и T-reg (CD3+CD4+CD127+dim) в опухолевой ткани, что объяснимо иммунофенотипической общностью этих субпопуляций.

Для разделения больных раком пищевода по срокам прогнозируемого прогрессирования заболевания были найдены коэффициенты и определены математические выражения для трех дискриминантных функций (F₀, F_6-12, F_12-24), организованные в модель.

Все показатели, включенные в модель, имели высокое значение Wilks' Lambda (лямбды Уилкса). Соответствующий каждому показателю критерий F превышал критическое значение и имел высокую доверительную значимость р (р<0,05) (табл. 1).

При использовании модели для определения сроков прогрессирования индивидуальные значения показателей больного вносили в каждое из трех уравнений для функций F₀, F_6-12, F_12-24 и рассчитывали три значения F.

F₀=0,39*X1+0,0095*X2-9,86

F_6-12=0,24*X1+0,12*X2-6,7

F₁₂-₂₄=0,39*X1+0,066*X2-11,57,

где X1 - CD3+CD4+- %,

Х2 - T-reg,

При этом F₀ соответствует заключению об отсутствии риска прогрессирования в течение 2-х и более лет; F_6-12 - заключению о высоком риске прогрессирования заболевания в течение 6-12 мес; F_12-24 - заключению о высоком риске прогрессирования заболевания в течение 12-24 мес. после операции.

Полученные значения трех классификационных функций сравнивали между собой и делали вывод в пользу той функции и заключения, при которой полученный F имеет максимальное значение, т.е. дискриминантная мощность является наиболее высокой.

В целом для модели значение Wilks' Lambda составило 1,628, статистическая значимость р<0,034 определялась по критерию F, составившему 3,88.

Приводим клинические примеры применения способа.

Клинический пример 1. Пациент П., 50 лет. Диагноз - рак средне-грудного отдела пищевода St IIII В, T3N2M0.

10.12.2016 г. выполнена операция в объеме - субтотальная резекция пищевода с одномоментной пластикой желудочным стеблем.

В биоптате опухоли определяли содержание лимфоцитов с иммунофенотипом CD45+, CD3+, CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD16/56+ и CD3+CD4+CD127dim (T-reg).

Результаты исследования были следующими: в опухолевой ткани CD3+CD4+- 23,5%, T-reg от CD3+CD4+клеток - 24,6%.

Подставив индивидуальные значения больного в каждое из трех уравнений и выполнив расчеты, получаем результат:

F₀=0,39*23,5+0,0095*24,6-9,86=-0,46

F_6-12=0,24*23,5+0,12*24,6-6,7=1,89

F_12-24=0,39*23,5+0,066*24,6-11,57=-0,78.

На основании результата расчетов (F₀=-0,46, F_6-12=1,89, F_12-24=-0,78) делается заключение в пользу большего значения (F_6-12=1,89), а, следовательно, заключения о риске прогрессирования рака пищевода в сроки 6-12 месяцев после операции.

В июле 2017 г. на СРКТ выявлено метастатическое поражение внутригрудных лимфоузлов, печени, легких. Бессобытийный период составил 7,2 мес.

Клинический пример 2. Пациентка М., 58 лет. Диагноз - рак нижнегрудного отдела пищевода St IIA, T2N0M0.

17.01.2014 г. выполнена операция в объеме - субтотальная резекция пищевода с одномоментной пластикой желудочным стеблем.

В биоптате опухоли определяли содержание лимфоцитов с иммунофенотипом CD45+, CD3+, CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD16/56+ и CD3+CD4+CD127dim (T-reg).

Результаты исследования были следующими: в опухолевой ткани CD3+CD4+- 54,8%, T-reg от CD3+CD4+клеток - 39,1%. Подставляем индивидуальные значения больного в каждое из 3 уравнений:

F₀=0,39*54,8+0,0095*39,1-9,86=11,88

F_6-12=0,24*54,8+0,12*39,1-6,7=11,14

F_12-24=0,39*54,8+0,066*39,1-11,57=12,38,

В результате расчетов получаем: F₀=11,88, F_6-12=11,14, F_12-24=12,38. Делаем заключение в пользу большего значения (F_12-24=12,38), а, следовательно, заключения о риске прогрессирования рака пищевода в сроки 12-24 месяцев после операции.

В сентябре 2016 г. на СРКТ выявлено метастатическое поражение внутригрудных лимфоузлов, легких. Бессобытийный период составил 20,4 месяцев.

Клинический пример 3. Пациент С., 60 лет. Диагноз - рак средне-грудного отдела пищевода St IIB, T3N0M0.

05.11.2015 г. выполнена операция в объеме - субтотальная резекция пищевода с одномоментной пластикой желудочным стеблем.

В биоптате опухоли определяли содержание лимфоцитов с иммунофенотипом CD45+, CD3+, CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD16/56+ и CD3+CD4+CD127dim (T-reg).

Результаты исследования были следующими: в опухолевой ткани CD3+CD4+- 35,5%, T-reg от CD3+CD4+клеток - 4,7. Подставляем индивидуальные значения больного в каждое из 3 уравнений:

F₀=0,39*35,5+0,0095*4,7-9,86=4,03

F_6-12=0,24*35,5+0,12*4,7-6,7=2,38

F_12-24=0,39*35,5+0,066*4,7-11,57=2,59,

В результате расчетов получаем: F₀=4,03, F_6-12=2,38, F_12-24=2,59. Делаем заключение в пользу большего значения (F₀=4,03), а, следовательно, об отсутствии риска прогрессирования в течение 2-х и более лет после операции. Контрольные обследования в течение трех лет не выявили прогрессирования заболевания.

Технико-экономическая эффективность способа заключатся в том, что способ позволяет более точно прогнозировать прогрессирование рака пищевода II-III стадии, включая разграничение сроков его прогрессирования и их индивидуализацию.