Результат интеллектуальной деятельности: Средство для стимуляции регенерации эндотелия легких при сочетании метаболического синдрома и хронической обструктивной болезни легких

Изобретение относится к области медицины, к клеточным технологиям и регенеративной медицине, и может быть использовано для стимуляции регенерации эндотелия легких при сочетанной патологии метаболическом синдроме и хронической обструктивной болезни легких.

В последнее время большое внимание исследователей и практикующих врачей приковывает проблема коморбидных патологий, как правило, связанных несколькими звеньями патогенеза друг с другом. Связь между метаболическим синдромом (МС) и заболеваниями легких, включая ХОБЛ, подтверждается рядом клинических исследований [1,2]. Общей чертой метаболического синдрома и ХОБЛ называют системное воспаление [3]. Кроме этого, у больных с метаболическим синдромом и ожирением [4] и у больных ХОБЛ [5] наблюдаются сосудистые осложнения, опосредованные нарушением функций и снижением числа циркулирующих эндотелиальных клеток.

К настоящему времени эффективных подходов терапии больных МС с таким осложнением как ХОБЛ не существует. Клиническая практика МС сосредоточена преимущественно на назначении противовоспалительных препаратов, лечении сердечнососудистых осложнений, поддерживающей терапии. Хронический и прогрессирующий характер МС и ХОБЛ при их сочетании, высокая частота развития осложнений, приводящих к инвалидизации населения, определяют необходимость разработки эффективных подходов лечения данной категории больных и поиск препаратов, обладающих способностью стимуляции регенерации клеток и тканей, и прежде всего эндотелия легких.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих способностью стимулировать регенерацию эндотелия легких при сочетании метаболического синдрома и хронической обструктивной болезни легких.

Поставленная задача достигается применением глюкагоноподобного пептида 1 для стимуляции регенерации эндотелия легких при сочетанной патологии метаболического синдрома и хронической обструктивной болезни легких.

Новым в предлагаемом изобретении является использование курсового введения 1 раз в день в течение 40 суток глюкагоноподобного пептида 1 при сочетанной патологии метаболическом синдроме и хронической обструктивной болезни легких.

Нами впервые выявлена способность глюкагоноподобного пептида 1, стимулировать регенерацию эндотелия, сниженную при сочетанной патологии: метаболический синдром и хроническая обструктивная болезнь легких.

Глюкагоноподобньш пептид-1 (ГПП-1) представляет собой гормон, секретируемый L-клетками листального отдела подвздошной кишки в ответ на прием пищи. Этот гормон вызывает как краткосрочные, так и долгосрочные плейотропные эффекты. ГПП-1 стимулирует выработку инсулина β-клетками, блокирует высвобождение глюкагона а-клетками поджелудочной железы через соматостатин, замедляет опорожнение желудка, улучшает толерантность к периферической глюкозе, подавляет аппетит в гипоталамусе и миндалинах, увеличивает массу бета-клеток, обеспечивает защиту от глюколипотоксичности и апоптоза [6], обладает противовоспалительными свойствами [7]. Способность ГПП-1 улучшать микрососудистую перфузию и противодействовать инсулинорезистентности может быть одной из причин эффективности терапии на основе аналогов ГПП-1 при сахарном диабете 2 типа [8]. Такой спектр биологических эффектов обусловлен широкой представленностью рецепторов ГПП-1 в организме. Рецептор ГПП-1 представляет собой мембранный рецептор, связанный с G-белком, обнаруживается не только в клетках островков поджелудочной железы, но и в некоторых других тканях, таких как центральная нервная система, почки, сердце, кровеносные сосуды, легкие, присутствует на эндотелиальных, нейрональных клетках [9, 10]. Ранее нами было продемонстрирована способность ГПП-1 влиять на регенерацию предшественников бета-клеток поджелудочной железы при сахарном диабете 1 типа [11].

Применение глюкагоноподобного пептида 1 по новому назначению стало возможным благодаря выявленному авторами новому свойству стимулировать регенерацию эндотелия легких при сочетании метаболического синдрома и хронической обструктивной болезни легких.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе.

Изобретение может быть использовано для стимуляции регенерации эндотелия легких при сочетании метаболического синдрома и хронической обструктивной болезни легких. Исходя из вышеизложенного, заявляемое изобретение соответствует критериям патентоспособности изобретения «Новизна» и «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».

Предлагаемый способ изучен в экспериментах на 60 мышах-самках линии C57BL/6. Животные поступили из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (ветеринарное удостоверение имеется). Содержание животных и экспериментальный дизайн одобрены Этическим комитетом НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ и соответствуют международным правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.

С целью исключения сезонных колебаний изучаемых показателей все эксперименты проведены в осенне-зимний период. Забор материала осуществляют в утренние часы. Мышей умерщвляют передозировкой СО₂.Количество животных в каждой группе не менее 20 особей.

Способ будет понятен из следующего описания и приложенных к нему фигур 1, 2 и 3.

На фиг. 1 изображено легкое мыши на 188 сутки эксперимента, при окрашивании ткани легкого гематоксилином и эозином: а, б, в - интактной, где а - верхнее легочное поле, 6 - среднее легочное поле, в - нижнее легочное поле; г, д, е - с индуцированным метаболическим синдромом и хронической обструктивной болезнью легких, где г -верхнее легочное поле, д - среднее легочное поле, е - нижнее легочное поле, ж, з, и - с индуцированным метаболическим синдромом и хронической обструктивной болезнью легких, получавших глюкагоноподобный пептид-1, где ж - верхнее легочное поле, з - среднее легочное поле, и - нижнее легочное поле. Увеличение х 100.

На фиг. 2 изображено легкое мыши на 188 сутки эксперимента, при иммуногистохимическом окрашивании ткани легкого для следующих маркеров: CD31 (а, б, в):.а, - интактной; б - с индуцированным метаболическим синдромом и хронической обструктивной болезнью легких; в - с индуцированным метаболическим синдромом и хронической обструктивной болезнью легких, получавшей глюкагоноподобный пептид-1. Увеличение х 100.

На фиг. 3 изображены 20-кратные изображения CD31 позитивных клеток легких мышей после культивирования, окрашенных: Hoechst (синий) для идентификации ядер клеток (а, г, ж); CFSE (зеленый) (б, д, з); (Hoechst+CFSE) составное изображение с использованием всех цветов (в, е, и). Определение процента клеток экстеразной активностью производится по отношению клеток, подсчитанных в зеленом канале, к общему количеству клеток, подсчитанных с использованием синего (DAPI) канала. Все масштабные линейки 100 мкм. а, 6, в - CD31 позитивные клетки легких интактных мышей; г, д, е, - CD31 позитивные клетки легких мышей, с индуцированным метаболическим синдромом и хронической обструктивной болезнью легких; ж, з, и - CD31 позитивные клетки легких мышей, с индуцированным метаболическим синдромом и хронической обструктивной болезнью легких, получавших глюкагоноподобный пептид-1.

Предлагаемое изобретение осуществляют следующим образом.

Экспериментальный метаболический синдром вызывают введением глутамата натрия (с 1 по 10 день жизни, ежедневно, подкожно в дозе 2,2 мг/т) [12]. Глутамат натрия, соль глутаминовой кислоты, с одной стороны широко применяется в качестве пищевой добавки (Е621) [13]. С другой стороны глутамат натрия активно используется для моделирования ожирения и метаболических нарушений у экспериментальных животных, причем отмечается, что новорожденные животные более чувствительны к поражающему действию препарата [14]. Дату рождения животных считают 1 днем эксперимента. На 124-е сутки эксперимента проводят вычисления индекса Ли [12]. Этот индекс рассчитывают как кубический корень из массы тела (г) * 10 / носоанальная длина (мм). У животных самок со значениями индекса Ли более 0,300, нарушениями глюкозотолерантного теста, на 126 сутки эксперимента индуцируют эмфизему легких.

Предварительно получают экстракт сигаретного дыма из сигарет марки L&M REDLABEL 2 сигареты на/мл (состав 1 сигареты: смола 10 мг/сиг, никотин 0,8 мг/сиг, СО10 мг/сиг). Перед получением экстракта удаляют сигаретный фильтр, длина сигареты с фильтром 80 мм, при удалении фильтра 55 мм. Экстракцию производят путем протягивания дыма зажженной сигареты через фосфатный буфер с постоянной скоростью, при помощи вакуумного насоса, сигарета сжигается до длины 5 мм. Время сжигания одной сигареты составляет 180 секунд. Для удаления частиц полученный экстракт фильтруют через бактериальный фильтр с величиной поры 0,22 мкм. Для стандартизации полученного экстракта перед и после фильтрации раствора проводят измерение рН (рН~7) и оптической плотности на длинах волн 405 и 540 нм (D₄₀₅~237, D₅₄₀~123).

Для инициации острой фазы воспаления используют липополисахарид (ЛПС). Липополисахарид - компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий Е. coli O111: В4 («Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4», «Sigma», США). ЛПС стимулирует клетки врожденной иммунной системы Toll-подобным рецептором 4, являющимся членом семейства Toll-подобных рецепторных белков, который распознает общие связанные с патогенами молекулярные структуры (PAMPs), вызывая тем самым усиление воспалительной реакции [15].

Хроническую обструктивную болезнь легких вызывают курсовым интратрахеальным введением липополисахарида и экстракта сигаретного дыма [16, 17]. ЛПС в дозе 3 мкг/мышь в 50 мкл фосфатного буфера и 50 мкл экстракта сигаретного дыма вводят интратрахеально [18]. При введении ЛПС и экстракта сигаретного дыма применяют общую анестезию (пентобарбитал, золетил и ксилазин). Введение ЛПС производится на 126 и 129 сутки эксперимента. Экстракт сигаретного дыма вводят на 127, 130, 133, 136, 139, 142, 149, 156, 163, 170 сутки эксперимента.

Контролируется модель по показателям уровня глюкозы, измерения липидного профиля в крови и проведением стандартных гистологических исследований легких с подсчетом площади эмфиземы [18]. Уровень глюкозы в крови определяют при помощи глюкометра (Accu-Chek Performa Nanu ("Roche Diagnostes GmbH", Germany). Измерение исходного уровня глюкозы в крови у животных проводят после 16-и часовой депривации корма, все последующие измерения уровня глюкозы также производят после 12-и часовой депривации еды. Оценку липидного профиля (ЛПНП, ЛПВП, триглицериды) проводят стандартными биохимическими методами.

Глюкагоноподобный пептид-1 (ГПП-1) представляет собой нейропептид и инкретин, полученный из транскрипции продукт гена проглюкагона (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). ГПП-1 вводят ежедневно внутрибрюшинно в область поджелудочной железы в дозе 3 ммоль / кг с 147-х по 187-е сутки эксперимента.

Для морфологических исследований правую долю легкого фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина, проводят через спирты восходящих концентраций до ксилола и заливают в парафин по стандартной методике. Депарафинизированные срезы толщиной 5 мкм окрашивают гематоксилин-эозином [19]. Микропрепараты от каждого экспериментального животного исследуются под световым микроскопом Axio Lab. A1 («Carl Zeiss», Germany) на 100- и 400-кратном увеличениях. Оцениваются нарушения гистоархитектоники ткани легких, наличие отека и воспалительной инфильтрации, венозного застоя, утолщения стенок сосудов и бронхов [20, 21].

Для каждого экспериментального животного делается минимум 5 микрофотографий без перекрытия по всей поверхности среза легочной ткани при 100-кратном увеличении. Использованная система состоит из микроскопа Axio Lab. A1 («Carl Zeiss», Germany) с видеокамерой AxioCam ERc5s («Carl Zeiss», Germany), подключенной к персональному компьютеру. Полученные изображения обрабатываются с помощью программного обеспечения Axio Vision Rel. 4.8.2. Площадь эмфизематозно-расширенных альвеол в легких определяется с использованием специальной функции для подсчета площади объекта на изображении. Срезы бронхов и кровеносных сосудов изымаются из анализируемых областей.

Расчет относительной площади эмфиземы производится по формуле 1:

где ∑а - сумма пикселей, занимаемых эмфизематозно-расширенными альвеолами, во всех снимках одного препарата, S - количество пикселей соответствующее полной площади снимка (при использовании данной фотокамеры и программы - 4423680), b - сумма пикселей, занимаемых пустой частью предметного стекла, во всех снимках одного препарата [22-24].

Иммуногистохимическое исследование легких проводят на 188 сутки эксперимента. Срезы легочной ткани помещаются на предметные стекла с адгезивным полилизиновым покрытием (Leica biosystems, Германия). Перед окрашиванием проводят депарафинизацию срезов ткани, с последующей демаскировкой антигена в цитратном буфере (рН=6) в течение 20 минут. Инкубирование с первичными антителами проводят во влажной камере при 37°С. Для выявления специфических клеточных маркеров используют следующие первичные антитела: поликлональные антитела к инсулину (ab63820, Abcam, США), поликлональные антитела к мембранному белку CD31 (аЬ28364, Abcam, США). Для детекции антител используется система визуализации в соответствии с инструкцией производителя (Spring bioscience, USA). Контрастирование срезов производится при помощи гематоксилина. После окраски срезы дегидрируются в ксилоле и заключаются в монтирующую среду. Для получения микрофотографий используется микроскоп Axio Lab. A1 (Carl Zeiss, Germany) с камерой AxioCam ERc5s (Carl Zeiss, Germany). Анализ изображений и подсчет клеток экспрессирующих детектируемые антигены производится при помощи программы ImageJ. Для каждого экспериментального животного делается минимум 10 микрофотографий без перекрытия по всей поверхности среза легочной ткани при 100-кратном увеличении. Процент окрашенных клеток оценивают, подсчитывая количество окрашенных клеток по отношению к общему количеству клеток ткани легких.

Экспрессию мембранных рецепторов мононуклеаров легких и периферической крови анализируют с использованием мышиных моноклональных антител методом проточной цитофлуориметрии. Для анализа используют прибор FACS Canto II с программным обеспечением FACS Diva («BD Biosciences)), США). Клеточные суспензии окрашивают следующими антителами: CD45 PerCP, CD31 АРС, CD34 FITC. В исследовании используют соответствующие изотипические контроли.

На 188 сутки эксперимента изучается действие ГПП-1 на CD31+ эндотелиальные клетки легких мышей in vitro. Для этого выделяют легкие мышей, ткань легких разрезают на кусочки, расщепляют раствором коллагеназы / диспазы (StemCell Technologies) и механически диспергируют в суспензию отдельных клеток. После удаления супернатанта осадок клеток один раз промывают полной средой DMEM, а затем ресуспендируют в 10 мл полной средой DMEM и помещают в покрытый желатином пластиковый планшет для тканевых культур Т-25 на 24 ч. На следующий день клетки удаляют из планшета с использованием трипсина для проведения магнитной сортировки.

Магнитную сортировку в целях обогащения клеточной суспензии легких CD31+ эндотелиальными клетками проводят стандартно с использованием положительной селекции с помощью антител против CD31 (StemCell Technologies, Канада). Фракцию CD31+ клеток выделяют с помощью магнита EasySep®(StemCell Technologies, Канада). Процедура позволяет увеличить количество CD31+клеток почти в 3 раза по сравнению с уровнем до сепарации.

Полученную после магнитной сортировки насыщенную суспензию CD31⁺ клеток (10⁶ клеток/ 1 мл среды) культивируют на покрытых желатином пластиковых планшетах для клеточных культур Т-25 в среде М199 в течение 6 дней в стандартных газовых (3,5% СОг) и температурных условиях (37°С). Среду меняют каждые 1-2 дня.

После 6-дневного цикла культивирования CD31⁺ клетки мышей удаляют из планшета с использованием трипсина, меняют среду M199, и высевают клетки в концентрации 3×10⁵ клеток/1 мл среды на покрытые желатином пластиковые планшеты Т-25. До культивирования в среду с CD31+ клетками мы добавляют ГПП-1 (10^-7 М). Цикл культивирования в стандартных условиях (3,5% СО₂, 37°С) составляет 24 ч. По окончании культивирования проводят оценку эффективности влияния ГПП-1 на CD31⁺ клетки с помощью проточной цитометрии и обработки изображений в каждой лунке с Cytation™ 3.

Изображения CD31⁺ клеток получают с помощью многорежимного ридера клеточного имиджера Cytation 3 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT), оснащенного кубами DAPI, GFP и Texas Red.

По завершении инкубационного периода эндотелиальные клетки легких обрабатывают флуоресцентными красителями Hoechst 33342, CFSE, Annexin V-iFluor™ 350 и 7-AAD. Затем визуализируют с помощью Cytation 3 под объективами 4× или 20× с последующим анализом клеток с использованием программного обеспечения для анализа данных Gen5™. Все собранные изображения предварительно обрабатывают для выравнивания фона перед выполнением аналитических методов. Для определения количества клеток на основе количества окрашенных Hoechst33342 ядер на синем канале проводят клеточный анализ, чтобы параметры по умолчанию привели к адекватным расчетным данным для дальнейшего анализа.

Статистическую обработку полученных результатов проводят методами вариационной статистики с использованием пакета статистической обработки данных SPSS 12,0. Вычисляют среднее арифметическое (М), ошибку среднего арифметического (m), значение вероятности (р). Различие двух сравниваемых величин считают достоверным в том случае, если вероятность их тождества была меньше 5% (р<0,05). Используя выборочные коэффициенты асимметрии и эксцесса, оценивают степень приближения закона распределения исследуемого признака к нормальному. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяют параметрический t-критерий Стьюдента. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок используют непараматрический критерий U-критерий Уилкоксона. Для выявления достоверности различий качественных показателей используют критерий углового преобразования Фишера.

Пример.

Проведенные эксперименты показывают, что введение глутамата натрия новорожденным мышам индуцирует метаболические нарушения у мышей самок линии C57BL/6 к 124 суткам эксперимента. У животных происходит достоверное увеличение индекса Ли, массы тела (Таблица 1)., концентрации триглицеридов и липопротеинов низкой плотности, снижение уровня липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови (Таблица 2). У животных с метаболическим синдромом регистрируется более выраженное увеличение уровня глюкозы и наблюдается увеличение площади под кривой (AUC) (Таблица 3).

Таким образом, глутамат натрия индуцирует дислипидемию и ожирение, вызывает нарушения при проведении глюкозотолерантного теста у мышей, что можно трактовать как метаболические нарушения.

У мышей самок линии C57BL/6 со значениями индекса Ли более 0,300, нарушениями толерантности к глюкозе на 126 сутки эксперимента индуцируют ХОБЛ. Введение глюкагон-подобного пептида-1 с 147-х по 187-е сутки эксперимента приводит к снижению у мышей массы тела и соответственно индекса Ли на 188 сутки эксперимента до уровня интактных животных (таблица 4). Индекс Ли увеличивается во всех группах в течение жизни, и, как и ожидается, группа с метаболическим синдромом и ХОБЛ показывает значительно более высокое значение, чем интактные мыши, к 188 суткам эксперимента (Таблица 4).

Важным критерием подтверждения метаболических нарушений являются изменения в метаболизме глюкозы. Введение ГПП-1 снижает выраженность подъема уровня глюкозы и уменьшает уровень площади под кривой (AUC) при проведении глюкозотолерантного теста на 186 сутки эксперимента (Таблица 5), и нормализует уровень глюкозы в периферической крови у животных (таблица 6).

Помимо положительного влияния на метаболические нарушения введение ГПП-1 улучшает показатели в легочной ткани при хронической обструктивной болезни легких. В ткани легкого мышей с ХОБЛ при предварительной макроскопической оценке отмечается мягкость консистенции и потеря эластичности ткани по сравнению с интактными животными, при этом ткань органа спадается и легко повреждается. Кроме этого, наблюдается гиперемия ткани легкого, при разрезе выделяется геморрагический экссудат, обнаруживается увеличение правого желудочка сердца и расширение крупных сосудов. Гистологическое исследование показывает, что в условиях введения ЛПС и экстракта сигаретного дыма на фоне развития метаболического синдрома в просвете отдельных альвеол обнаруживаются скопления макрофагов, имеет место перибронхиальный отек, отмечается умеренное растяжение бронхиол, альвеолярных ходов и альвеол. Кроме этого наблюдаются разрывы альвеолярных перегородок, отмечаются единичные ателектазы, происходит истончение альвеолярных капилляров и их запустевание (фиг 1, таблица 7). В результате действия ЛПС и экстракта сигаретного дыма на эластические волокна в паренхиме легких мышей развивается диффузная эмфизема. Наиболее выраженная эмфизема регистрируется в нижнем легочном поле, затем по интенсивности поражения следует среднее легочное поле и замыкает ряд верхнее легочное поле (таблица 7). Патоморфологические изменения легких мышей, получающих ГПП-1, менее выражены, чем в группе с метаболическими нарушениями и ХОБЛ (фиг. 1, таблица 7). Введение ГПП-1 достоверно уменьшает площадь эмфизематозно-расширенной ткани в нижней области легких мышей по сравнению с группой патологического контроля.

При иммуогистохимическом исследовании ткани легкого мышей с метаболическим синдромом и ХОБЛ отмечается достоверное уменьшение количества клеток, экспрессирующих CD31 в легочной ткани, по сравнению с интактным контролем (фиг. 2, таблица 8). Введение ГПП-1 нормализует количество клеток, экспрессирующих CD31 в легочной ткани мышей с метаболическими нарушениями и ХОБЛ.

На 188 сутки эксперимента у мышей на фоне метаболического синдрома и ХОБЛ число эндотелиальных прогениторных клеток с фенотипом CD45-CD31+CD34+сокращается в крови и увеличивается в легких по сравнению группой интактного контроля (Таблица 9). При введении ГПП-1 наблюдается значительное (в 1,8 раз) увеличение циркулирующих в крови эндотелиальных прогениторных клеток, и их уменьшение в легких по сравнению с группой мышей с метаболическим синдромом и ХОБЛ.

Для культуральных исследований проводят обогащение клеточной популяции эндотелиальных клеток легких с помощью CD31-позитивной магнитной сепарации. Для контроля процесса сепарации используют проточную цитометрию. Процедура позволяет увеличить количество CD31⁺- клеток почти в 3 раза, до 71% от всех окрашенных клеток по сравнению с исходным уровнем (до сепарации). Далее полученную обогащенную популяцию эндотелиальных клеток культивируют в течение 5 дней, затем добавляют ГПП-1 и культивируют еще сутки. Под влиянием ГПП-1 число апоптотических CD31+ клеток в культуре значительно снижается (более чем в 2 раза по сравнению с культурой без ГПП-1). ГПП-1 значительно увеличивает экспрессию маркера CD34 в культуре CD31+ эндотелиальных клеток легких (таблица 10).

ГПП-1 увеличивает количество CD31+ эндотелиальных клеток с активными эстеразами (фиг. 3, таблица 10). Эти результаты исследования in vitro указывают на то, что экспрессирующие маркеры CD31 и CD34 эндотелиальные прогениторные клетки, возможно, являются мишенью для ГПП-1 и вовлекаются инкретином в процессы регенерации поврежденного эндотелия у мышей с метаболическим синдромом и ХОБЛ.

Таким образом, глюкагоноподобный пептид 1 стимулирует регенерацию эндотелия легких при сочетании метаболического синдрома и хронической обструктивной болезни легких.

Литература

1. Hanson С, LeVan Т. Obesity and chronic obstructive pulmonary disease: recent knowledge and future directions. // Curr Opin Pulm Med. 2017 Mar;23(2): 149-153. doi: 10.1097/MCP.0000000000000354.

2. Lamonaca P., Prinzi G., Kisialiou A., Cardaci V., Fini M., Russo P. Metabolic Disorder in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) Patients: Towards a Personalized Approach Using Marine Drug Derivatives //Mar Drugs. 2017 Mar; 15(3): 81. doi: 10.3390/md15030081

3. Piazzolla G., Castrovilli A., Liotino V., Vulpi M.R., Fanelli M., Mazzocca A., Candigliota M., Berardi E., Resta 0., Sabba C, Tortorella C. Metabolic syndrome and Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD): The interplay among smoking, insulin resistance and vitamin D. // PLoS One. 2017 Oct 24;12(10):e0186708. doi: 10.1371/journal.pone.0186708.

4. Ambasta R.K., Kohli H., Kumar P.J Multiple therapeutic effect of endothelial progenitor cell regulated by drugs in diabetes and diabetes related disorder. // Transl Med. 2017 Aug. 31;15(1):185. doi: 10.1186/s12967-017-1280-y.

5. Wouters E.F., Peinado V.I., Jeffery P.K. Lungs, bone marrow, and adipose tissue. A network approach to the pathobiology of chronic obstructive pulmonary disease. // Am J Respir Crit Care Med. 2013 Dec 15;188(12):1396-406. doi: 10.1164/rccm.201308-1404PP.

6. Paternoster S, Falasca M. Dissecting the Physiology and Pathophysiology of Glucagon-Like Peptide-1. // Front Endocrinol (Lausanne). 2018 Oct 11;9:584. doi: 10.3389/fendo. 2018.00584.

7. Lee Y-S., Jun H-S. Anti-Inflammatory Effects of GLP-l-Based Therapies beyond Glucose Control // Hindawi Publishing Corporation Mediators of Inflammation Volume 2016, Article ID 3094642,11 pages, dx.doi.org/10.1155/2016/3094642.

8. Stephen Rattigan, Jacob F Jeppesen, Anne-Marie Lundsgaard, Jens J Hoist, and Bente Kiens Differential effects of glucagon-like peptide-1 on microvascular recruitment and glucose metabolism in short- and long-term insulin resistance J Physiol. 2015 May 1; 593(Pt 9): 2185-2198. doi: 10.1113/JP270129

9. Nguyen DV, Linderholm A, Haczku A, Kenyon N. Glucagon-like peptide 1: A potential antiinflammatory pathway in obesity-related asthma. // Pharmacol Ther. 2017, Dec;180:139-143. doi: 10.1016/j.pharmthera.2017.06.012.

10. Huang J, Yi HI, Zhao C, Zhang Y, Zhu L, Liu В, He P, Zhou M. Glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R) signaling ameliorates dysfunctional immunity in COPD patients. // Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2018, Oct 9;13:3191-3202. doi: 10.2147/COPD.S175145.

11. Skurikhin, E.G.; Pakhomova, A.V.; Epanchintsev, A.A.;, Stronin, O.V.; Ermakova, N.N.; Pershina, O.V.; Ermolaeva, L.A.; Krupin, V.A.; Kudryashova, A.I.;, Zhdanov, V.V.; Dygai, A.M. Role of P Cell Precursors in the Regeneration of Insulin-Producing Pancreatic P Cells under the Influence of Glucagon-Like Peptide 1. // Bull Exp Biol Med. 2018, V. 165(5), p. 644-648. doi: 10.1007/s10517-018-4232-5.

12. Cameron D.P., Poon T.K.-Y., Smith G.C. Effects of Monosodium Glutamate Administration in the Neonatal Period on the Diabetic Syndrome in KK Mice //Diabetologia. 1976. 12, 621-626.

13. Zanfirescu A, Cristea AN, Nitulescu GM2 Velescu BS, Gradinaru D. Chronic Monosodium Glutamate Administration Induced Hyperalgesia in Mice. // Nutrients. 2017. V. 21;10(1). pii: El. doi: 10.3390/nu10010001.2

14. Walker R, Lupien JR. The safety evaluation of monosodium glutamate.// J Nutr. 2000. V.130(4S Suppl):1049S-52S. doi: 10.1093/jn/130.4.1049S.

15. Wu, K.-C. Huang SS, Kuo YH, Ho YL, Yang CS, Chang YS, Huang GJ. Ugonin M, a Helminthostachys zeylanica constituent, prevents LPS-induced acute lung injury through TLR4-mediated МАРK and NF-kB signaling pathways // Molecules. 2017. Vol.22 (573). P. 1-15.

16. He Z.H., Chen P., Chen Y., He S.D., Ye J.R., Zhang H.L., Cao J. Comparison between cigarette smoke-induced emphysema and cigarette smoke extract-induced emphysema. // Tob Indue Dis. 2015. Mar 25;13(1):6. doi: 10.1186/s12971-015-0033-z.

17. Chen Y., Hanaoka M., Chen P. Protective effect of beraprost sodium, a stable prostacyclin analog, in the development of cigarette smoke extract-induced // American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 2009. V. 296(4). P. 648-656.

18. Ortiz-Munoz G, Looney MR. Non-invasive Intratracheal Instillation in Mice. //Bio Protoc. 2015;5(12). pii: e1504. PMID: 27390765

19. Pacini G., Reappraisal of the intravenous glucose tolerance index for a simple assessment of insulin sensitivity in mice. // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2009 May;296(5):R1316-24. doi: 10.1152/ajpregu.90575.2008.

20. Клатт Э.К. Атлас патологии Роббинса и Котрана. Пер. с англ. под ред. О.Д. Мишнева, А.И. Щеголева. М.: Логосфера, 2010. 544 с: ил.

21. Черняев А.Л., Самсонова М.В. Патологическая анатомия легких: атлас. М.: Издательство «Атмосфера», 2004. 112 с.

22. Parameswaran Н., Majumdar A., Ito S., Alencar A.M., Suki В. Quantitative characterization of airspace enlargement in emphysema // The journal of applied physiology. 2006. V. 100. P. 186-193.

23. Munoz-Barrutia A., Ceresa M., Artaechevarria X., Montuenga L.M., Ortiz-de-Solorzano C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema // International Journal of Biomedical Imaging. 2012. V. 2012. P. 1-11.

24. Sato S., Parameswaran H., Hamakawal H., Suki B. Scale dependence of structure-function relationship in the emphysematous mouse lung // Frontiers in Physiology. 2015. V. 6(146). P. 1-10.