ЭФИРЫ ТРИГИДРОКСИГЕПТАЕНОВОЙ КИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ АГОНИСТОВ FPR2 РЕЦЕПТОРА

Настоящее изобретение относится к аналогам аутокоидов, в частности к производным эфира тригидроксигептаеновой кислоты формулы (I) и их применению в качестве лекарственных средств. Настоящее изобретение также относится к родственным вопросам, включая способы получения соединений, фармацевтические композиции, содержащие одно или большее количество соединений формулы (I), и в особенности, к их применению в качестве агонистов рецептора FPR2.

Аутокоиды - это биологические сигнальные молекулы локального действия, в частности, небольшие липидные молекулы, синтезирующиеся из ω-3 полиненасыщенных жирных кислот: эйкозапентаеновой (С 20:5, ЭПК) и докозагексаеновой (С 22:6, ДГК). Соединения с данной структурой впервые были идентифицированы в 2000 году при экспериментальном воспалении у мышей с использованием методов липидомики (жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией) и биометриотики (Serhan et al. Novel functional sets of lipid-derived mediators with antiinflammatory actions generated from omega-3 fatty acids via cyclooxygenase 2-nonsteroidal antiinflammatory drugs and transcellular processing // J. Exp. Medicine. - 2000. - T. 192. - №. 8. - C. 1197-1204).

Аутокоиды D-серии (RD), представляющие собой полигидроксилированные производные ненасыщенных жирных кислот, впервые были обнаружены в экссудатах при развитии экспериментального воспаления у мышей. Источником для их синтеза служит ДГК. Эндогенная ДГК является субстратом для фермента 15-липоксигеназы, который превращает ДГК в 17S-гидроперокси-ДГК. Этот интермедиат затем может превратиться в несколько биоактивных компонентов, включая RD1, 2, 3 и 4 (Hong et al. Novel docosatrienes and 17S-resolvins generated from docosahexaenoic acid in murine brain, human blood, and glial cells autacoids in anti-inflammation // J. Biol. Chem. - 2003. - T. 278. - №. 17. - C. 14677-14687).

RD1 является мощным регулятором активности полиморфноядерных лейкоцитов. Он тормозит миграцию нейтрофилов через эндотелий, в микроглиальных клетках блокирует транскрипцию ИЛ-1β, а при экспериментальном перитоните у мышей снижает инфильтрацию брюшины полиморфно-ядерными лейкоцитами (Serhan et al. Resolvins // J. Exp.Medicine. - 2002. - T. 196. - №. 8. - C. 1025-1037; Hong et al, 2003). Введение RD1 перед или после экспериментальной ишемии почек уменьшает морфологические признаки повреждения (Duffield et al. Resolvin D series and protectin D1 mitigate acute kidney injury // J. Immunol. - 2006. - T. 177. - №. 9. - C. 5902-5911). Из патентной литературы известно применение некоторых полигидроксилированных производных ненасыщенных жирных кислот (Патент WO 2004014835 А2, опубликован 19.02.2004; Патент US 8586073 В2, опубликован 19.11.2013) и их производных для лечения боли (Патент CN 103193643 А, 10.07.2013), для заживления рубцов (Патент US 9463177 В2, опубликовано 11.10.2016) и др.

Воспалительная реакция играет центральную роль в защите организма от вторжения патогенных микроорганизмов и повреждения тканей. Инициирование этого ответа является активным процессом, и недавние исследования показали, что разрешение воспаления, так же как и его инициация, является активным процессом при посредничестве ряда эндогенных липидных производных молекул, которые могут «выключить» воспалительный каскад и содействовать гомеостазу (Serhan, Savill Resolution of inflammation: the beginning programs the end // Nature immunology. - 2005. - T. 6. - №. 12. - C. 1191-1197). Эти липиды в основном получены из ферментативной реакции эндогенных липоксигеназы и циклооксигеназы с С-20 и С-22 LC-PUFA (длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты) с образованием окисленных продуктов или оксилипинов в участке воспаления. При введении животным аутокоиды обладают сильной противовоспалительной активностью (Gilroy et al. Inflammatory resolution: new opportunities for drug discovery // Nature reviews. Drug discovery. - 2004. -Т. 3. - №.5. - C. 401-416; Serhan, Savill, 2005; Hong et al, 2003; Serhan et al, 2002).

В последнее время поиск новых соединений на основе полигидроксилированных производных ненасыщенных жирных кислот сосредоточен на получении стабильных аналогов с улучшенным фармакологическим профилем (Guilford et al, 2004; Dangi В. et al. Metabolism and biological production of resolvins derived from docosapentaenoic acid (DPAn-6) // Biochem. pharmacol - 2010. - T. 79. - №. 2. - C. 251-260).

Среди многочисленных публикаций о действии RD1 (Serhan, Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. // Nature. - 2014. - T. 510.- C. 92-101) сообщается, что RD1 уменьшает передачу сигналов TNF-альфа (Lee et al. Resolvin D1 stimulates efferocytosis through p50/p50-mediated suppression of tumor necrosis factor-alpha expression. // J Cell Sci. - 2013. - T. 126. - C. 4037-4047), уменьшает боль (Ji et al. Emerging targets in neuroinflammation-driven chronic pain. // Nat Rev Drug Discov. - 2014. - T. 13 - C. 533-548), играет важную роль в нарушении костной ткани (McCauley et al. Cutting edge: Parathyroid hormone facilitates macrophage efferocytosis in bone marrow via proresolving mediators resolvin D1 and resolvin D2. // J Immunol. - 2014. - Т. 193. - С.26-29), выполняет защитную функцию в экспериментальных моделях ишемии-реперфузии (Martin et al. Resolvin D1 and lipoxin A4 improve alveolarization and normalize septal wall thickness in a neonatal murine model of hyperoxia-induced lung injury. // PLoS One. - 2014. - T. 9. - С e98773), фибромиалгии (Klein et al. Effects of D-series resolvins on behavioral and neurochemical changes in a fibromyalgia-like model in mice. // Neuropharmacology. - 2014.- T. 86C. - C. 57-66), колитах (Bento et al. Omega-3 fatty acid-derived mediators 17(R)-hydroxy docosahexaenoic acid, aspirin-triggered resolvin D1 and resolvin D2 prevent experimental colitis in mice.// J Immunol. - 2011. - 187: 1957-1969), обладает противоаллергическим действием (Nelson et al. ALX/FPR2 receptor for RvD1 is expressed and functional in salivary glands. // Am J Physiol Cell Physiol. - 2014.- T. 306. - C 178-C185). Принимая во внимание защитное действие RD1, крайне высокую его подверженность окислению и высокую стоимость, мы предложили новый аналог RD1 с повышенной химической стабильностью и простотой общего органического синтеза, с сохранением биологической активности.

Биологические эффекты всех эйкозаноидов, в том числе аутокоидов, опосредуются специфическими эйкозаноидными рецепторами. Большинство эйкозаноидных рецепторов передают сигнал через G-белки. Как правило, эффекты аутокоидов опосредуются рецепторами CMKLR1 (хемокин-подобный рецептор 1, также обозначаемый ChemR23), GPR32 (G-белок-связанный рецептор 32), LTB4R (рецептор лейкотриена В4) и LXA4R (рецептор липоксина, или FPR2/ALXR-рецептор).

FPR2 - formyl peptide receptor 2 - формил пептидный рецептор, регулирующий хемотаксис, принадлежит к классу рецепторов сцепленных с G-протеином. Установлено, что метаболит липида, липоксин А4 (LXA4) и его аналоги с высоким сродством связываются с FPR2-рецептором и усиливают выработку арахидоновой кислоты (Chiang et al. The lipoxin receptor ALX: potent ligand-specific and stereoselective actions in vivo // Pharmacol. reviews. - 2006. - T. 58. - №. 3. - С 463-487). Для LXA4 установлена высокая противовоспалительная активность. На моделях воспаления кожи, перитонита, колита, мезангиопролиферативного нефрита, плеврита, астмы, муковисцидоза, сепсиса, периодонтита и др. (Schwab, Serhan Lipoxins and new lipid mediators in the resolution of inflammation // Cur. opinion pharmacol. - 2006. - T. 6. - №.4. - C. 414-420).

Биологические характеристики агонистов FPR2 включают, но не ограничиваются только ими, миграцию/активацию моноцитов/макрофагов/микроглиальных клеток/дендритных клеток, миграцию/активацию нейтрофилов, регуляцию активации, пролиферации и дифференциации лимфоцитов, регуляцию воспаления, регуляцию продуцирования и/или высвобождения цитокинов, регуляцию продуцирования и/или высвобождения провоспалительных медиаторов, регуляцию иммунной реакции.

Настоящее изобретение относится к аналогам аутокоидов - эфирам тригидроксигептаеновой кислоты, которые являются непептидными агонистами FPR2 рецептора. Соединения применимы для предупреждения или лечения заболеваний, которые отвечают на модулирование FPR2 рецептора, таких как воспалительные заболевания (предпочтительно метаболический синдром и сахарный диабет 2 типа), обструктивные заболевания дыхательных путей, аллергические патологические состояния, опосредуемые с помощью ВИЧ ретровирусные инфекции, сердечнососудистые нарушения, нейровоспаление, неврологические нарушения, боль, опосредуемые прионом заболевания и опосредуемые амилоидом нарушения (предпочтительно болезнь Альцгеймера); кроме того, они применимы для предупреждения или лечения аутоиммунных заболеваний и для модулирования иммунных ответов.

Ниже описаны различные варианты осуществления настоящего изобретения.

1) Настоящее изобретение относится к эфирам тригидроксигептаеновой кислоты формулы (I),

в которой,

R обозначает фенил, (С₂-С₄)алкил, бензил, метоксибензил или фенетил; и к солям (предпочтительно фармацевтически приемлемым солям) таких соединений.

Соединения формулы (I), соответствующие варианту осуществления (1), могут содержать один или большее количество стереогенных или асимметрических центров, таких как один или большее количество асимметрических атомов углерода. Заместители у двойной связи могут находиться в (Z)- или (Е)-конфигурации, если не указано иное. Таким образом, соединения формулы (I) могут находиться в виде смесей стереоизомеров или предпочтительно в виде чистых стереоизомеров. Смеси стереоизомеров можно разделить по методикам, известным специалисту в данной области техники.

В следующих абзацах приведены определения различных химических фрагментов соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, и они применимы во всем описании и формуле изобретения, если в других определениях не приведены более широкие или более узкие определения.

Термин «алкил» при использовании по отдельности или в комбинации означает обладающую линейной или разветвленной цепью алкильную группу, содержащую от 2 до 4 атомов углерода. Типичные примеры алкильных групп включают этил, изопропил и трет-бутил.

2). Предпочтительные соединения формулы (I), определенные в варианте осуществления (1), выбраны из группы, включающей:

(5R,6S,Z)-Этил-5,6,7-тригидроксигепт-2-еноат

(5R,6S,Е)-Этил-5,6,7-тригидроксигепт-2-еноат

(5R,6S,Е)-трет-Бутил-5,6,7-тригидроксигепт-2-еноат

(5S,6R,Е)-Бензил-5,6,7-тригидроксигепт-2-еноат

(5R,6S,Е)-Бензил-5,6,7-тригидроксигепт-2-еноат

(5S,6R,Е)-Фенил-5,6,7-тригидроксигепт-2-еноат

(5R,6S,Е)-Фенил-5,6,7-тригидроксигепт-2-еноат

(5R,6S,Е)-(4-Метоксибензил)-5,6,7-тригидроксигепт-2-еноат

(5R,6S,Е)-Фенетил-5,6,7-тригидроксигепт-2-еноат

Термин «фармацевтически приемлемые соли» означает нетоксичные соли присоединения с неорганической или органической кислотой и/или основанием (см. например, Gould P.L. Salt selection for basic drugs // International Journal of Pharmaceutics. - 1986. - T. 33. - №. 1-3. - C. 201-217).

Соединения формулы (I), соответствующие любому из вариантов осуществления (1)-(2), или их фармацевтически приемлемые соли являются подходящими для применения в качестве лекарственных средств. В частности, соединения формулы (I) модулируют рецептор FPR2, т.е. они выступают в качестве агонистов рецептора FPR2, и применимы для предупреждения или лечения заболеваний, которые отвечают на активацию рецептора FPR2.

В частности, соединения формулы (I), соответствующие любому из вариантов осуществления (1)-(2), или их фармацевтически приемлемые соли являются подходящими для предупреждения или лечения заболеваний, выбранных из группы, включающей воспалительные заболевания, предпочтительно метаболический синдром, сахарный диабет 2 типа, ревматоидный артрит, острое поражение легких, астма, воспалительная болезнь кишечника и болезнь Альцгеймер.

Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I), соответствующего любому из вариантов осуществления (1)-(2), для приготовления фармацевтических композиций, предназначенных для лечения и/или профилактики указанных выше заболеваний.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтически приемлемым солям и к фармацевтическим композициям и препаратам соединений формулы (I), соответствующих любому из вариантов осуществления (1)-(2).

Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере одно соединение формулы (I), соответствующее любому из вариантов осуществления (1)-(2) (или его фармацевтически приемлемую соль) в качестве активного средства и необязательно носители и/или разбавители, и/или вспомогательные вещества.

Соединения формулы (I), соответствующие любому из вариантов осуществления (1)-(2), и их фармацевтически приемлемые соли в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно предназначена для перорального введения человеку или животному. Фармацевтическая композиция может также предназначаться для введения с помощью любого другого способа, в котором активные ингредиенты могут эффективно поглощаться и использоваться, например, внутривенно, подкожно, внутримышечно, интраназально, ректально, вагинально или местно.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция формируется в форме капсулы, которая также может представлять собой микрокапсулу, генерирующую порошок, или саше. Капсула может ароматизироваться. Этот вариант осуществления также включает такую капсулу, где как капсула, так и инкапсулированная композиция в соответствии с настоящим изобретением является ароматизированной. Посредством ароматизации капсула становится более привлекательной для потребителя. Для рассмотренных выше терапевтических применений вводимая доза будет, разумеется, изменяться вместе с используемым соединением, со способом введения, желаемым лечением и показанным расстройством.

Фармацевтическая композиция может приготавливаться с получением ежедневной дозы, например, от 1 мкг до 10 мг соединения. Формулы (I). Под ежедневным дозированием подразумевается дозирование в течение 24 часов.

Приготовление фармацевтических композиций можно провести по методикам, которые должны быть известны специалисту в данной области техники (см. например. Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition (2005), Part 5, "Pharmaceutical Manufacturing" [published by Lippincott Williams & Wilkins]), путем внесения описанных соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей, необязательно в комбинации с другим терапевтически полезными веществами в вводимую дозированную форму вместе с подходящими нетоксичными инертными терапевтически совместимыми твердыми или жидкими носителями и при необходимости с обычными фармацевтическими вспомогательными веществами.

Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения или лечения заболевания или нарушения, указанному в настоящем изобретении, включающему введение субъекту соединения формулы (I), соответствующего любому из вариантов осуществления (1)-(2), или его фармацевтически приемлемой соли в фармацевтически активном количестве.

Любое указание на соединение формулы (I) в этом тексте следует понимать, как указание и на соли (и предпочтительно фармацевтически приемлемые соли) таких соединений, если это является подходящим или целесообразным. Разумеется, предпочтения, указанные для соединений формулы (I), с соответствующими изменениями применимы к солям и фармацевтически приемлемым солям соединений формулы (I). Это относится и к этим соединениям в качестве лекарственных средств, к фармацевтическим композициям, содержащим эти соединения в качестве активных действующих средств, или применению этих соединений для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний, указанных в настоящем изобретении.

Соединения формулы (I) можно получить по методикам, приведенным ниже, по методикам, приведенным в примерах или по аналогичным методикам. Оптимальные условия проведения реакции могут меняться в зависимости от конкретных использующихся реагентов или растворителей, но такие условия специалист в данной области техники может определить с помощью стандартных процедур оптимизации.

Если не указано иное, то типичные группы R являются такими, как определено для формулы (I). Другие использующиеся аббревиатуры определены в экспериментальном разделе.

Фармакологические свойства и способ получения заявляемых в настоящем изобретении эфирам тригидроксигептаеновой кислоты формулы (I) в литературе не описаны.

А. Синтез конечных продуктов

Настоящее изобретение будет теперь описано более подробно с помощью следующих примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение. Соединения формулы (I) можно получить из ДОР по реакции с соответствующим производным трифенилфосфоранилиденацетата при температуре кипения в подходящем растворителе.

Пример 1

Соединения структуры 1 или 2 получали по реакции раствора ДОР (1.00 г, 7.46 мМ) и этил-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетата (2.86 г, 8.2 мМ) в 15 мл сухого ТГФ при кипячении в течение 2 ч, после чего реакционную смесь концентрировали, остаток очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле (элюент CH₂Cl₂:МеОН, 97:3). Полученные цис- и транс-изомеры чистили с помощью колоночной хроматографии повторно и перекристаллизовывали из смеси МТБЭ:пентан, 1:6. Выпавшие при -15°С бесцветные осадки отфильтровывали и промывали пентаном. Получено 15 мг (1%) соединения структуры 1 с чистотой (HPLC) 100%, масс спектр: вычислено для C₉H₁₆NaO₅ (M+Na⁺): 227.0895, найдено 227.0893 и 220 мг (14%) соединения структуры 2 с чистотой (HPLC) 97.6%, масс спектр: вычислено для C9H16NaO5 (M+Na⁺) 227.0895, найдено 227.0889. Оба соединения получены в виде порошков белого цвета.

Пример 2

Соединение структуры 3 получали по реакции раствора ДОР (0.95 г, 7.1 мМ) и трет-бутил-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетата (2.93 г, 7.8 мМ) в 15 мл сухого ТГФ при температуре кипения и выдержке в течение 2 ч, после чего реакционную смесь концентрировали, остаток очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле (элюент CH₂Cl₂:EtOAc:МеОН, 65:33:2). Полученный транс-изомер чистили с помощью колоночной хроматографии повторно и перекристаллизовывали из смеси МТБЭ:пентан, 1:4. Выпавшие при -15°С бесцветные осадки отфильтровывали и промывали пентаном. Получено 300 мг (18%) соединения структуры 3 в виде бесцветного легкоплавкого твердого вещества с чистотой (HPLC) 100%, масс спектр: вычислено для C₁₁H₂₀NaO₅ (M+Na⁺): 255.1203, найдено 255.1208.

Пример 3

Соединение структуры 4 можно получали по реакции раствора ДОР (1.34 г, 10 мМ) и бензил-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетата (6.16 г, 15 мМ) в 35 мл сухого ТГФ при кипячении в течение 2 ч, после чего реакционную смесь концентрировали, остаток очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле (элюент CH₂Cl₂:МеОН, 94:6). Полученный транс-изомер перекристаллизовывали из МТБЭ. Выпавший при 5°С бесцветный осадок отфильтровывали и промывали охлажденным МТБЭ. Получено 420 мг (16%) соединения структуры 4 в виде кристаллического порошка белого цвета с чистотой (HPLC) 99.6%, масс спектр: вычислено для C₁₄H₁₈NaO₅ (M+Na⁺): 289.1046, найдено 289.1044.

Пример 4

Соединение структуры 5 можно получить по реакции раствора ДОР (1.50 г, 11.2 мМ) и бензил-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетата (6.90 г, 16.8 мМ) в 40 мл сухого ТГФ кипячением в течение 2 ч, после чего реакционную смесь концентрировали, остаток очищали методом КХ (элюент CH₂Cl₂:МеОН, 97:3). Полученные изомеры перекристаллизовывали из МТБЭ. Выпавшие при 5°С осадки отфильтровывали и промывали охлажденным МТБЭ. Получено 615 мг (20%) соединения структуры 5 в виде порошка белого цвета с чистотой (HPLC) 99.9%, масс спектр: вычислено для C₁₄H₁₈NaO₅ (M+Na⁺): 289.1046, найдено 289.1040.

Пример 5

Получение промежуточного продукта 1 (фенил-2-йодацетат). 13.49 г (90 мМ) йодида натрия и 14.5 г (85 мМ) фенил-2-хлорацетата растворяли в 54 мл СН₃СОСН₃, смесь перемешивали 3 ч. Выпавший осадок отфильтровывали и промывали СН₃СОСН₃. Раствор упаривали, к остатку добавляли 30 мл хлористого метилена, смесь профильтровывали через ФШ. Растворитель упаривали в вакууме, продукт реакции перекристаллизовывали из этанола. Выход промежуточного продукта 1 18.16 г (82%).

Получение промежуточного продукта 2 (фенил-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетат). 18.16 г (69.3 мМ) трифенилфосфина растворяли в 200 мл С₆Н₆, смесь профильтровывали через ФШ. К раствору добавляли 18.16 г (69.3 мМ) промежуточного продукта 1. Через 16 ч к смеси добавляли 100 мл ПЭ, смесь охлаждали до 3-5°С, выпавший осадок отфильтровывали, промывали ПЭ и высушивали. Высушенный осадок добавляли к охлажденной до 0-5°С смеси 100 мл 0.5 М раствора NaOH с 200 мл CH₂Cl₂. Органический слой отделяли, водный слой промывали 20 мл CH₂Cl₂. Объединенные органические вытяжки высушивали Na₂SO₄, растворитель отгоняли. Выход промежуточного продукта 2 в виде желтоватого кристаллизующегося смолообразного вещества 18.41 г (67%).

Соединение структуры 6 можно получить по реакции раствора ДОР (1.0 г, 7.5 мМ) и промежуточного продукта 2 (3.96 г, 10.0 мМ) в 25 мл сухого ТГФ при кипячении, после чего реакционную смесь концентрировали, остаток очищали методом КХ (элюент CH₂Cl₂:МеОН, 97:3). Полученный транс-изомер перекристаллизовывали из МТБЭ. Выпавший при 5°С бесцветный осадок отфильтровывали и промывали охлажденным МТБЭ. Получено 50 мг (26%) соединения структуры 6 в виде порошка белого цвета с чистотой (HPLC) 98.5%, масс спектр: вычислено для C₁₃H₁₆NaO₅ (M+Na⁺): 275.0895, найдено 275.0897.

Пример 6

Получение промежуточного продукта 1 (см. для структуры 6).

Получение промежуточного продукта 2 (фенил-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетат). 18.16 г (69.3 мМ) трифенилфосфина растворяли в 200 мл С₆Н₆, смесь отфильтровывали через ФШ. К раствору добавляли 18.16 г (69.3 мМ) промежуточного продукта 1. Через 16 ч к смеси добавляли 100 мл петролейного эфира, смесь охлаждали до 3-5°С, выпавший осадок отфильтровывали, промывали ПЭ и высушивали. Высушенный осадок добавляли к охлажденной до 0-5°С смеси 100 мл 0.5 М раствора NaOH с 200 мл CH₂Cl₂. Органический слой отделяли, водный слой промывали 20 мл CH₂Cl₂. Объединенные органические вытяжки высушивали Na₂SO₄, растворитель отгоняли. Выход промежуточного продукта 2 в виде желтоватого кристаллизующегося смолообразного вещества составил 18.41 г (67%).

Соединение структуры 7 получали по реакции раствора ДОР (1.50 г, 11.2 мМ) и промежуточного продукта 2 (6.66 г, 16.8 мМ) в 40 мл сухого ТГФ при кипячении, после чего реакционную смесь концентрировали, остаток очищали методом КХ (элюент СН₂С1₂:МеОН, 97:3). Полученный транс-изомер перекристаллизовывали из МТБЭ. Выпавший при 5°С бесцветный осадок отфильтровывали и промывали охлажденным МТБЭ. Получено 315 мг (20%) соединения структуры 7 в виде порошка белого цвета с чистотой (HPLC) 96,6%, масс спектр: вычислено для C₁₃H₁₆NaO₅ (M+Na⁺): 275.0895, найдено 275.0885.

Пример 7

Получение промежуточного продукта 1 ((4-метоксибензил)-2-хлорацетат). 10.9 мл (12.0 г, 87 мМ) анисового спирта и 7 мл (6.9 г, 87 мМ) абс. пиридина растворяли в 80 мл хлористого метилена, после чего смесь охлаждали в ледяной бане. При охлаждении к смеси прикапывали 6.9 мл (9.8 г, 87 мМ) хлорацетилхлорида, выдерживали до достижении КТ. Через 16 часов выпавший осадок отфильтровывали и промывали CH₂Cl₂. Раствор промывали 1% раствором HCl и высушивали безводным Na₂SO₄. Растворитель упаривали в вакууме. Выход промежуточного продукта 1 составил 17.91 г (91%) в виде бесцветной маслообразной субстанции.

Получение промежуточного продукта 2 ((4-Метоксибензил)-2-йодацетат). 3.75 г (25 мМ) йодида натрия и 4.29 г (20 мМ) промежуточного продукта 1 растворяли в 15 мл СН₃СОСН₃, смесь перемешивали 3 ч. Выпавший осадок отфильтровывали и промывали СН₃СОСН₃. Раствор упаривали, к остатку добавляли 30 мл CH₂Cl₂, смесь профильтровывали через ФШ. Растворитель упаривали в вакууме. Выход промежуточного продукта 2 5.20 г (85%), желтоватое маслообразное вещество.

Получение промежуточного продукта 3 ((4-Метоксибензил)-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетат). 4.20 г (16 мМ) три-фенилфосфина растворяли в 200 мл С6Н6, смесь профильтровывали через ФШ. К раствору добавляли 4.81 г (16 мМ) промежуточного продукта 2. Через 16 ч к смеси добавляли 100 мл ПЭ, смесь охлаждали до 3-5°С, выпавший осадок отфильтровывали, промывали петролейным эфиром и высушивали. Высушенный осадок добавляли к охлажденной до 0-5°С смеси 100 мл 0.5 М раствора NaOH с 200 мл CH₂Cl₂. Органический слой отделяли, водный слой промывали 20 мл CH₂Cl₂. Объединенные органические вытяжки высушивали Na₂SO₄, растворитель отгоняли. Выход промежуточного продукта 3 в виде желтоватого кристаллизующегося смолообразного вещества составил 6.61 г (94%).

Соединение структуры 8 получали реакцией раствора ДОР (1.34 г, 10 мМ) и промежуточного продукта 3 (6.61 г, 15 мМ) в 25 мл сухого ТГФ при кипячении в течение 2 ч, после чего реакционную смесь концентрировали, остаток очищали методом КХ (элюент CH₂Cl₂:МеОН, 97:3). Полученный транс-изомер дважды перекристаллизовывали из МТБЭ. Выпавший при 5°С бесцветный осадок отфильтровывали и промывали охлажденным МТБЭ. Получено 296 мг (10%) соединения структуры 8 в виде порошка белого цвета с чистотой (HPLC) 99,4%, масс спектр: вычислено для C₁₅H₂₁O₆ (М+Н⁺): 297.32, найдено 297.30.

Пример 8

Получение промежуточного продукта 1 (фенетил-2-йодацетат). 3.75 г (25 мМ) йодида натрия и 3.97 г (20 мМ) фенетил-2-хлорацетата растворяли в 15 мл СН₃СОСН₃, смесь перемешивали 3 часа. Выпавший осадок отфильтровывали и промывали СН₃СОСН₃. Раствор упаривали, к остатку добавляли 30 мл CH₂Cl₂, смесь профильтровывали через ФШ. Растворитель упаривали в вакууме. Выход промежуточного продукта 1 составил 4.81 г (83%) в виде маслообразного вещества желтого цвета.

Получение промежуточного продукта 2 (фенетил-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетат). 4.35 г (16.6 мМ) трифенилфосфина растворяли в 200 мл С6Н₆, смесь отфильтровывали через ФШ. К раствору добавляли 4.81 г (16.6 мМ) промежуточного продукта 1. Через 16 ч к смеси добавляли 100 мл ПЭ, смесь охлаждали до 3-5°С, выпавший осадок отфильтровывали, промывали ПЭ и высушивали. Высушенный осадок добавляли к охлажденной до 0-5°С смеси 100 мл 0.5 М раствора NaOH с 200 мл CH₂Cl₂. Органический слой отделяли, водный слой промывали 20 мл CH₂Cl₂. Объединенные органические вытяжки высушивали Na₂SO₄, растворитель отгоняли. Выход промежуточного продукта 2 составил 6.9 г (98%) в виде желтоватого кристаллизующегося смолообразного вещества. Соединение структуры 9 получали реакцией раствора ДОР (1.43 г, 10.7 мМ) и промежуточного продукта 2 (6.9 г, 16.3 мМ) в 20 мл сухого ТГФ при кипячении в течение 2 ч, после чего реакционную смесь концентрировали, остаток очищали методом КХ (элюент СН₂С1₂:МеОН, 97:3). Полученный транс-изомер перекристаллизовывали из МТБЭ. Выпавший при 5°С бесцветный осадок отфильтровывали и промывали охлажденным МТБЭ. Получено 325 мг (11%) соединения структуры 9 в виде порошка белого цвета с чистотой (HPLC) 99,0%, масс спектр: вычислено для C₁₅H₂₁O₅ (М+H⁺): 281.14, найдено 282.20.

I. Химические данные

Общие положения. Все температуры указаны в градусах Цельсия (°С). Если не указано иное, то реакции протекают при КТ.

Колоночную флэш-хроматографию (ФХ) проводили с использованием силикагеля 60 Merck (0.063-0.200 мм) или силикагеля Macherey-Nagel (0.063-0.200 мм): для элюирования использовали CH₂Cl₂:МеОН в соотношении 97:3.

Условия проведения ЖХ-МС (если не указано иное): Аналитическая: насос для подачи двух компонентов Dionex HPG-3000, МС: Thermo MSQ, ДДМ: Dionex PDA 3000, ИДСР: PolymerLab ELS 2100. Колонка: Ascentis Express C18 2,7 мкм, 2,1×30 мм ВД (внутренний диаметр), выпускающаяся фирмой Sigma-Aldrich, термостатируемая в камере Dionex ТСС-3200. Элюенты: А: Н₂О+0,05% NH₄OH+2% AcCN; В: AcCN. Методика: Градиентный режим: 5% В→95% В за 2,00 мин. Скорость потока: 1,8 мл/мин. Детектирование: УФ/вид, t_R приведены в минутах.

Условия проведения HPLC (если не указано иное): Колонка: Luna С18 (2) 5 мкм, 4.6×150 мм, выпускающаяся фирмой Phenomenex. Элюент: 0,03% ТФК+AcCN 88:12. Методика: Градиентный режим: 5% В→95% В за 2,00 мин. Скорость потока: 1,0 мл/мин. Детектирование: УФ/вид, t_R приведены в минутах.

ЯМР: Bruker Avance 400 (400 МГц); Varian Mercury 300 (300 МГц); химические сдвиги приведены в част./млн относительно использующегося растворителя; мультиплетности: s = синглет, d = дублет, t = триплет, q = квадруплет, р=пентиплет, hex = секстет, hept = гептет, m = мультиплет, br = широкий, константы спин-спинового взаимодействия приведены в герцах.

II. Биологические исследования

ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фиг. 1 представлена зависимость ингибирующего действия от концентрации соединения структуры 2 на фермент ЦОГ-2

По оси абсцисс концентрация соединения структуры 2 в мкг/мл; по оси ординат ингибирование активности фермента ЦОГ 2 в % от контроля.

Исследование in vitro

Пример 9. Агонистическую активность соединений формулы (I) по отношению к рецептору FPR2 определяли по описанной ниже экспериментальной методике.

Синтез провоспалительных цитокинов инициируется внутриклеточным сигналингом, одним из звеньев которого являются МАР-киназы р38, JNK1/2 и ERK1/2. При стимуляции клеток факторами воспаления (бактериальные агенты, цитокины, вирусы и др.) МАР-киназы фосфорилируются и активируют факторы, запускающие транскрипцию медиаторов воспаления (TNFa, IL-1, IL-6, IL-8, ЦОГ-2, арахидоновая кислота и др.) (Yang et al, 2003; Dumitru et al, 2000; Kyriakis et al, 2001).

В соответствие с этим было сделано предположение, что снижение фосфорилирования МАР-киназ, в частности, киназы р38, может обеспечивать противовоспалительное действие тестируемых субстанций за счет снижения продукции провоспалительных цитокинов.

Экспериментальная методика: Определение влияния соединений формулы (I) на ЛПС-индуцированное фосфорилирование МАР-киназы р38 в перевиваемой культуре моноцитов человека линии U937.

Культуру клеток инкубировали с соединениями формулы (I) в различных концентрациях в течение 1 ч при 37°С и 5% СО₂, далее вносили липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерий Е. coli и выдерживали 1 ч в тех же условиях. По истечении указанного срока в культуре определяли содержание фосфорилированных форм и общее количество (фосфорилированных и не фосфорилированных форм) МАР-киназы р38 с целью определить уровень активации (фосфорилирования) МАР-киназы р38. Метод определения - иммуноблот.Исследование проводилось в сравнении со специфическим ингибитором активации МАР-киназы р38 SB203580 (5 мкМ (1,88 мкг/мл))

Агонистическая активность приведенных в качестве примеров соединений по отношению к рецептору FPR2 (количество фосфо-МАРК, % от контроля) представлена в таблице 1.

Оценка количества фосфорилированных форм МАР-киназы р38 в реализованной модели показала, что наиболее выраженный эффект на активацию МАР-киназы р38 оказывают структуры 2, 3 и 9. Указанные соединения оказывают ингибирующее действие на активацию МАР-киназы р38 в широком диапазоне концентраций. Субстанции структуры 5 и 6 оказывали влияние на активацию МАР-киназы р38 в диапазоне концентраций от 4 мкг/мл до 1 мкг/мл.

Пример 10. Активность соединений формулы (I) по отношению к ферментам циклооксигеназы-1 (ЦОГ-1) и циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) определяли по описанной ниже экспериментальной методике.

Развитие воспаления обеспечивается синтезом комплекса провоспалительных медиаторов, стимулирующих большинство дальнейших процессов в развитии воспалительной реакции и активации различных типов клеток, участвующих в поддержании и регуляции воспаления, включая все типы лейкоцитов, дендритные клетки, Т- и В- лимфоциты, эндотелиальные и эпителиальные клетки, фибробласты и др. (Holgate S.Т. et al. Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation, smooth muscle function, and remodeling // J. Allergy Clin Immunol. 2003. Vol. 111. №1. P. 18-34.)

Одним из возможных механизмов противовоспалительного действия различных лекарственных веществ может быть ингибирование каскада арахидоновой кислоты, синтеза простагландинов и лейкотриенов (Holgate S.T. et al., 2003). Один из ключевых ферментов этого каскада циклооксигеназа 1/2 (ЦОГ1/2) являются перспективными мишенями для поиска новых нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) (Kumar К.А. High-through screening assays for cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase, the targets for inflammatory disorders // Ind. J. Biochem. Biophysics. 2011. Vol. 48. P. 256-261).

Оценку влияния синтезированных соединений на ферментативную активность ЦОГ-1/2 проводили с помощью коммерчески доступной тест-системы СОХ (human) inhibitory screening assay kit (Cayman Chemicals, USA).

Некоторые из соединений, охватываемых настоящим изобретением, являются эффективными ингибиторами ферментов ЦОГ 1/2 (соединения 2, 5 и 9). Причем соединение структуры 2 является селективным ингибитором ЦОГ 2 и по ингибирующему действию сходно с индометацином, который является неселективным ингибитором, что может являться механизмом противовоспалительного действия лекарственных средств на его основе (см. Фиг. 1). IC50 для соединения структуры 2 составило около 0,21±0,01 мкг/мл (1,0±0,03 мкМ), что сопоставимо с неспецифическим ингибитором ЦОГ индометацином: IC50=0,69 мкМ.