Результат интеллектуальной деятельности: Способ проведения цитологического исследования при дифференциальной диагностике узловых образований щитовидной железы

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может использоваться для проведения цитологического исследования при дифференциальной диагностике узловых образований щитовидной железы, а также состава инфильтрата как мелких, так и крупных кист различных органов при патологии молочной железы, яичников, лимфоузлов.

Известен способ дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы (ЩЖ), включающий тонкоигольную аспирационную биопсию (ТАБ) под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием пунктата (см. Ветшев П.С., Шкроб О.С., Чилингариди К.Е. и др. Возможности предоперационной морфологической верификации при узловых эутиреоидных образованиях щитовидной железы // Хирургия. - №2, 1998. - С.4-8). В этом способе выявляется клеточный состав узлового образования ЩЖ. Hamburger J.I. считает, что рак щитовидной железы не может быть полностью исключен, если в каждом из двух препаратов, полученных при разных аспирациях, не определяется 6 кластеров, каждый из которых содержит как минимум 10-15 «доброкачественных» фолликулярных клеток.

Недостатками способа являются:

- недостаточная чувствительность (при выявлении коллоидного зоба - 91,3%, при многоузловом поражении чувствительность снижается до 88,3%, а при незначительной пролиферации тиреоцитов - до 77,4%, при выявлении аденом из фолликулярных клеток - 70,5%, при выявлении рака - всего лишь 23,1%, а при наличии папиллярного и фолликулярного рака чувствительность еще уменьшается до 9,1% и 11,1% соответственно);

- при многоузловом поражении не всегда представляется возможным пунктировать все имеющиеся узлы;

- не во всех случаях удается получить достаточное количество клеток (по данным А.Бельфиоре, примерно в 25% случаев информативность ТАБ оказывается недостаточной из-за получения неинформативного материала (низкой клеточности мазков), а также вследствие установления так называемых «неопределенных» диагнозов);

- необходимость высокой квалификации цитолога;

- стандартная ТАБ, по различным оценкам, не может дифференцировать доброкачественные и злокачественные опухоли, имеющие сходную цитоморфологическую картину, в 15-30% случаев. В первую очередь это касается фолликулярных аденом и фолликулярного рака, а также фолликулярного варианта папиллярного рака и гюртлеклеточных опухолей.

Зачастую пунктат содержит жидкость с очень малым количеством клеток, и цитологический анализ провести практически невозможно. Жидкая же часть пунктата (коллоид, содержимое кисты, плазма крови) обычно никак не исследуется. В доступной литературе нам удалось обнаружить лишь указание на то, что коллоид - это жидкость, включающая рибонуклеины, протеиды, тиреоглобулин, йод, цитохромоксидазу и другие ферменты. Методик исследования жидкой части пунктата с целью дифференциальной диагностики узловых образований ЩЖ найдено не было.

Известен способ проведения цитологического исследования при дифференциальной диагностике узловых образований щитовидной железы, включающий их тонкоигольную аспирационную биопсию под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием полученного пунктата, который центрифугируют и используют для приготовления препарата на предметном стекле (см. RU №2267997, МПК A61B 10/00, G01N 33/48, 2003).

Недостаток этого способа, недостаточная оперативность и ограниченная информативность способа – позволяет судить о доброкачественной или недоброкачественной природе узла. При этом он не позволяет оценить динамику изменения материала обследуемых органов.

Задача, на решение которой направлено предлагаемое решение, выражается в повышении оперативности и расширении информативности способа при обеспечении возможности оценки динамики изменения материала обследуемых органов.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в повышении оперативности и расширении информативности способа при обеспечении возможности оценки динамики изменения материала обследуемых органов.

Для решения поставленной задачи, способ проведения цитологического исследования при дифференциальной диагностике узловых образований щитовидной железы, включающий их тонкоигольную аспирационную биопсию под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием полученного пунктата, который центрифугируют и используют для приготовления препарата на предметном стекле, отличается тем, что пунктат центрифугируют на скорости 600 оборотов в минуту в течение 30 секунд, отделяют осадок и помещают его в 10% нейтральный формалин так, чтобы фиксирующая жидкость занимала объем не менее чем объем образца, при этом полученную смесь фиксатора и осадка пунктата центрифугируют на скорости 600 оборотов в минуту в течение 10 секунд и осадок, образовавшийся после центрифугирования, наносят на предметное стекло тонким слоем, окрашивают и изучают с помощью фазовоконтрастной микроскопии, выявляя вид, количество и соотношение клеточных ансамблей.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Совокупность признаков формулы изобретения обеспечивает возможность повышения оперативности и расширения информативности способа при обеспечении возможности оценки динамики изменения материала обследуемых органов, при этом признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.

Признак «пунктат центрифугируют на скорости 600 оборотов в минуту в течение 30 секунд» обеспечивает сохранность в исследуемом материале структуры клеток. Осадок при таких условиях центрифугирования представляют только живые клетки, которые в мазке наблюдаются в большом количестве. Морфология клеток соответствует реальной их прижизненной структуре в узловых образованиях.

Признак, указывающий, что из отцентрифугованного пунктата «отделяют осадок и помещают его в 10% нейтральный формалин» обеспечивает впадение клеток в паранекроз, затем в некроз, прекращение гранулообразования. Клетку можно рассмотреть при фазовоконтрастной микроскопии, она сохраняется длительное время, так как произошла денатурация белков в цитоплазме, прекращена активность всех ферментов и эндонуклеаз, расщепляющих ДНК ядра. Все ферменты дезактивированы, поэтому клетка длительно сохраняет размеры, форму, структуру.

Признак, указывающий, что необходимо, «чтобы фиксирующая жидкость занимала объем не менее чем объем образца» обеспечивает эффективность (полноту) консервации материала.

Признаки, указывающие, что «полученную смесь фиксатора и осадка пунктата центрифугируют на скорости 600 оборотов в минуту в течение 10 секунд» обеспечивают сохранность в исследуемом материале структуры клеток при повышении эффективности фиксации материала.

Признаки, указывающие, что «осадок, образовавшийся после центрифугирования, наносят на предметное стекло тонким слоем, окрашивают» обеспечивают подготовку препарата к фазовоконтрастной микроскопии.

Признаки, указывающие, что «изучают с помощью фазовоконтрастной микроскопии, выявляя вид, количество и соотношение клеточных ансамблей» обеспечивают расширение набора диагностических признаков в отношении щитовидной железы и организма в целом.

На фиг.1 показаны результаты УЗИ обследования щитовидной железы; на фиг.2 показано выполнение ТАБ под контролем УЗИ; на фиг.3 показаны предметные стекла с неокрашенными мазками; на фиг.4-фиг.7 показаны результаты цитологического исследования обычных мазков, полученных методом ТАБ с последующим классическим выполнением окрашивания мазка, при этом на фиг. 4 показаны лейкоциты: нейтрофил и лимфоцит; на фиг. 5 показаны моноцит, лимфоцит и нейтрофил; на фиг. 6 показано, что в мазках идентифицируются единичные нейтрофилы и макрофаги с крупными гранулами; на фиг. 7 видны немногочисленные клетки в поле зрения; на фиг.8-фиг.10 показаны мазки, полученные методом ТАБ щитовидной железы с центрифугированием аспирационного материала; на фиг.11-фиг.12 показаны результаты окраски мазка, изготовленного из экссудата, при этом на фиг.11 показана окраска с применением метиленового синего; на фиг. 12 показана окраска с применением иммунной гистохимии на выявление локализации маркера р53.

Для реализации способа используют известные средства для выполнения ТАБ: лоток, шприцы объемом в зависимости от размеров кист и количества инфильтрата (от 5,0 мл до 20 мл); предметные стекла, пробирки, салфетки, карандаш. Кроме того, для мягкого центрифугирования используют исследовательскую центрифугу, например, К1015. Для изучения препаратов и изготовления иллюстраций используют микроскоп, например, Olympus Bx51 c фотокамерой DP25. Для контроля выполнения ТАБ используют аппарат УЗИ.

Заявленный способ реализуется следующим образом.

Показанием для выполнения тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) являются результаты УЗИ обследования пациента.

В процессе ТАБ врач под контролем УЗИ реализует классический метод (ТАБ) у пациентов с узловыми образованиями щитовидной железы. Аналогично отбирают инфильтрат как мелких, так и крупных кист различных органов при патологии молочной железы, яичников, лимфоузлов и т.п. Весь жидкий материал собирают шприцом, после чего помещают содержимое шприца в пробирку и центрифугируют его на скорости 600 оборотов в минуту в течение 30 секунд. Далее сливают жидкую часть материала, а осадок помещают в 10% нейтральный формалин без перемешивания и без образования пены (для большего соприкосновения материала с фиксатором). В случае малого количества материала, как, например, при пункции инфильтрата небольших кист щитовидной железы или жидкости передней камеры глаза, используют пробирку Эппендорф (1,5 мл), содержащую 0,5 мл консервирующей жидкости. Важно, чтобы консервирующая жидкость занимала объем не менее чем объем образца (1:1).

Полученную смесь фиксатора, эпителиоцитов, лейкоцитов, эритроцитов, клеток инфильтрата кист исследуемого органа центрифугируют при скорости 600 оборотов в минуту в течение 10 секунд и осадок, образовавшийся после центрифугирования, наносят на предметное стекло тонким слоем.

После обработки формалином клетки не обладают способностью к вакуолизированию красителя, окрашиваются равномерно, имеют четкие границы, в таком мазке количество клеток в поле зрения максимальное, что облегчает анализ. Окрашивание при этом возможно любыми морфологическими методами, как классическими, так и иммуногистохимическими.

Анализ результатов с помощью фазовоконтрастной микроскопии дает полное представление о составе инфильтрата кисты любого исследуемого органа. При данном способе изготовления мазка можно получить полную картину клеточного состава, содержащегося в инфильтрате как мелких, так и крупных кист различных органов: при патологии молочной и щитовидной желез, яичников, лимфоузлов, жидкости, содержащейся в серозных полостях.

Для изготовления иллюстраций используют микроскоп Olympus Bx51 c фотокамерой DP25. Техника микроскопирования предусматривает анализ препарата без покровного стекла с предварительным высушиванием и нанесением иммерсионного масла для работы с наибольшим увеличением под иммерсионным объективом. В рассматриваемых объектах идентифицируются ядра, фигуры митоза, отростки клеток, содержимое цитоплазмы, включая везикулы и контаминированные организмы.

Комментарии к фотографиям: На фиг.1 стрелкой показана игла для аспирации материала. Выявлен папиллярный рак, выполнена тиреоидэктомия.

На фиг.2 показано выполнение ТАБ под контролем УЗИ. На фиг.3. Материал получен методом ТАБ с последующим нанесением на предметные стекла. На фиг.8-фиг.10 показаны мазки, полученные методом ТАБ щитовидной железы с центрифугированием аспирационного материала для обогащения цитологической картины: видны многоклеточность, атипические микрофолликулы с нагромождением клеток. Папиллярные структуры. Однородная популяция полиморфных фолликулярных клеток. Ядра вариабельны. Определяется 1-2 ядрышка со смещением к периферии. Цитоплазма нежно-структурированная с нечеткими контурами.

Заключение: фолликулярная опухоль, вероятно, атипическая фолликулярная аденома. TBSRTC IV категория – фолликулярная опухоль. На фиг.12 показано большое количество клеток в поле зрения на препарате, изготовленном предлагаемым методом.

При данном способе изготовления мазков избегаем повторных биопсий с помощью ТАБ, так как заключение «неинформативный мазок» полностью исключается. Полученный образец дает представление о количестве и соотношении клеточных ансамблей в сгустке клеток, полученных из инфильтрата кист после центрифугирования, что можно использовать для расширения диагностического спектра в оценке патологического процесса.

Дальнейшие этапы аналогичны таковым при работе с цитологическим материалом. Заключение в бальзам и под покровное стекло возможно как ручное, так и автоматическое. Для автоматической заливки применяют аппарат для заключения гистологических препаратов под покровное стекло TISSUE-TEK® GLAS™ G2 в стандартизированном режиме. Хранить препараты рекомендуется в вертикальном положении в темноте при температуре не выше 10^оС. Можно также формировать архив из цифровых цветных фотографий препаратов.

Достоинства способа:

- позволяет получить обогащенную массу клеток и лейкоцитов, входящих в состав кист или полостей различных органов, заполненных жидким содержимым;

- морфологическая картина на стеклах с мазками при таком способе заливки материала максимально информативна и дает представления о количественных и качественных взаимоотношениях клеточных ансамблей, входящих в состав кист;

- окрашивание материала возможно всеми доступными классическими морфологическими и иммуногистохимическими методами;

- полученный осадок также можно исследовать с помощью PCR метода;

- заключенные препараты можно архивировать в течение многих лет и использовать в дальнейшем в динамике клинического наблюдения за пациентом;

- цифровые фотографии препаратов также можно архивировать в течение многих лет, и, кроме того, ими обмениваться между центрами или учеными, занимающимися сходной проблематикой;

- исключается диагноз «неинформативный мазок», что позволяет избежать повторных процедур ТАБ, что важно для пациента;

- исключается излишний расход красителя и предметных стекол для диагностики, сокращается время, требуемое для правильной диагностики, необходимое как для врача, так и для пациента;

- исключается дополнительная стрессовая ситуация для пациента;

- способ дает представление не только о морфологии клеток, изменений ядер, но и позволяет судить о наличии или об отсутствии апоптоза, что характерно для процесса малигнизации.