Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения и обнаружения в моче фторсодержащих лекарственных средств в комбинированных сочетаниях

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и может быть использовано в химико-токсикологических и контрольно-аналитических лабораториях для разделения, идентификации и анализа офлоксацина, линезолида и эфавиренза в комбинированных сочетаниях.

Исследуемые фторсодержащие лекарственные средства применяются для лечения бактериальных и вирусных инфекций, но различаются механизмами действия. Так, офлоксацин относится к группе антибактериальных препаратов, является представителем фторхинолонов II поколения. Линезолид - синтетический антибиотик группы оксазолидинонов. Эфавиренз - антиретровирусный препарат. По механизму действия представляет собой селективный ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (ННИОТ) вируса иммунодефицита человека тип 1 (ВИЧ-1). Возникновение острых отравлений лекарственными препаратами, в том числе антибактериальными и противовирусными, часто связано с ошибочным приемом неправильно подобранной дозировки, превышающей требуемую, длительным применением препаратов, повышенной чувствительностью к ним отдельных лиц, сочетанием их с другими лекарственными средствами, а также с суицидальной целью при намеренном приеме более высокой дозы.

Наиболее часто встречаются случаи отравления офлоксацином, линезолидом и эфавирензом в сочетании с антидепрессантами, анальгетиками, седативными, антигистаминными, противотуберкулезными лекарственными средствами -амитриптилином, мелипрамином, новокаином, морфином, фенобарбиталом, димедролом, рифампицином.

Одной из актуальных проблем химико-токсикологического и фармацевтического анализа является разработка новых и усовершенствование существующих способов идентификации комбинированных сочетаний лекарственных средств. Для химико-токсикологического и аналитического контроля целесообразно использовать простые, но надежные и производительные экспрессные методики анализа.

Среди современных методов химико-токсикологического и фармацевтического анализа важное место занимает хроматография в тонком слое сорбента, которая широко применяется как для целей разделения, так и для идентификации лекарственных средств в комбинированных сочетаниях.

Наиболее близким является способ определения циннаризина в комбинированных сочетаниях с психотропными лекарственными средствами, путем приготовления растворов испытуемых веществ с последующим хроматографированием на хроматографических пластинках «Армсорб» в системе растворителей н-гептан - этанол 95%-25% раствор аммиака (6:2:2) и идентификацией в УФ-свете при длине волны 254 нм и реактивом Драгендорфа (Чмелевская Н.В., Илларионова Е.А., Цыренов Б.М. Разработка методик обнаружения циннаризина в комбинированных сочетаниях с психотропными лекарственными средствами // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов. - Пятигорск, 2012. - Вып.67. - С. 290-291). В этой работе предложен способ хроматографирования в тонком слое сорбента для разделения и идентификации циннаризина в сочетании с амитриптилином, аминазином, азалептином, галоперидолом, трифтазином и неулептилом, который оказался неселективным для определения офлоксацина, линезолида и эфавиренза в сочетании с антидепрессантами, анальгетиками, седативными, антигистаминными, противотуберкулезными лекарственными средствами -амитриптилином, мелипрамином, новокаином, морфином, фенобарбиталом, димедролом, рифампицином. Предложенные автором условия хроматографирования не позволяют разделить исследуемые комбинированные сочетания фторсодержащих лекарственных средств после изолирования их из мочи.

В предлагаемом способе авторы используют в качестве растворителя для изолирования испытуемых растворов из мочи - дихлорметан и насыщенный раствор натрия хлорида при рН 4, чувствительность определения в 3 раз выше, чем в прототипе, показана возможность хроматографирования на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей диэтиловый эфир - хлороформ - 25% раствор аммиака в соотношении 15:2:1,5 и идентификацией в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Использование в качестве растворителя дихлорметана и насыщенного раствора натрия хлорида при рН 4 и системы растворителей диэтиловый эфир - хлороформ - 25% раствор аммиака (15:2:1,5) позволяет четко разделить пятна определяемых веществ, что повышает селективность, объективность и чувствительность анализа, которая составила 0,01 мкг/мл.

Технический результат достигается путем изолирования из мочи определяемых веществ и приготовления растворов стандартных образцов сравнения с последующим их хроматографированием и обнаружением УФ-светом.

Новым в достижении технического результата является то, что изолирование испытуемых веществ из мочи осуществляют дихлорметаном и насыщенным раствором натрия хлорида при рН 4,0.

Новым является также то, что в качестве подвижной фазы используют систему растворителей диэтиловый эфир - хлороформ - 25% раствор аммиака в соотношении 15:2:1,5.

Исследуемые лекарственные вещества характеризуются наличием в молекулах различных функциональных групп и поэтому отличаются физико-химическими свойствами. Исходя из этого, оптимальным методом их разделения следует считать метод хроматографии в тонком слое сорбента, который характеризуется экспрессностью, селективностью, высокой чувствительностью, несложным аппаратурным оснащением, простотой выполнения.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является наиболее распространенным методом анализа лекарственных, наркотических веществ и их метаболитов в биологических объектах и на этапе скрининга служит преобладающим источником информации. Данный метод применяется в общем и частном скрининге.

Для выбора условий разделения исследуемых веществ методом ТСХ использовали пластины на основе силикагеля «Сорбфил», которые имеют высокую степень активности, стандартизированную толщину сорбента.

Детекцию пятен проводили путем просмотра пластин в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Предварительно нами была определена хроматографическая подвижность исследуемых веществ в общих системах растворителей, наиболее часто применяемых для веществ основного характера в химико-токсикологическом анализе. В качестве общих систем использовали: I. Бензол - диоксан - 25% раствор аммиака (12:7:1); П. Этилацетат - хлороформ - 25% раствор аммиака (17:2:1);

III. Хлороформ - этанол - 25% раствор аммиака (30:30:1);

IV. Толуол - ацетон - 25% раствор аммиака (50:50:1);

V. Этилацетат - ацетон - этанол - 25% раствор аммиака (50:45:4:1);

VI. Этанол - 25% раствор аммиака (49,25:0,75);

VII. Этилацетат - метанол - 25% раствор аммиака (17:2:1).

Система этилацетат - хлороформ - 25% раствор аммиака (17:2:1) является наиболее подходящей из вышеперечисленных сочетаний для разделения исследуемых лекарственных веществ. Данная система может быть рекомендована в скрининге при проведении ненаправленного анализа. В остальных общих системах, разделение исследуемых веществ идет недостаточно четко, наблюдается размытие зон адсорбции, а также наличие «хвостов».

Для увеличения значения ΔR_f между зонами исследуемых веществ провели варьирование количеством частей подвижной фазы этилацетат - хлороформ - 25% раствор аммиака (17:2:1) (базовая система).

Увеличение количества этилацетата в системе до двадцати частей привело к росту подвижности только эфавиренза, подвижность офлоксацина и рифампицина при этом не изменилась, а у других лекарственных веществ уменьшилась. Уменьшение количества этилацетата от семнадцати частей до десяти, восьми и пяти соответственно увеличило подвижность эфавиренза и офлоксацина (кроме уменьшения до пяти частей, в случае которого подвижность не изменилась). Подвижность рифампицина не изменилась, а у остальных лекарственных веществ уменьшилась. Изменение в системе количества хлороформа от двух до трех частей не приводит к увеличению подвижности всех исследуемых лекарственных веществ. Подвижность эфавиренза, офлоксацина и рифампицина при этом не меняется, у остальных лекарственных веществ уменьшается. Уменьшение в системе количества хлороформа от двух частей до одной увеличивает подвижность эфавиренза. Подвижность офлоксацина и рифампицина остается на прежнем уровне, у всех остальных исследуемых веществ уменьшается.

Таким образом, варьирование количеством этилацетата и хлороформа в системе не привело к существенному увеличению ΔRf между зонами, а в некоторых случаях даже уменьшило разделяющую способность исследуемых соединений. В связи с этим провели замену этилацетата на диэтиловый эфир и варьировали количеством диэтилового эфира от 17 до 5 частей. Наилучшее разделение компонентов наблюдалось в системе диэтиловый эфир -хлороформ - 25% раствор аммиака (15:2:1).

Учитывая тот факт, что исследуемые нами лекарственные препараты обладают основными свойствами, в ходе дальнейших исследований провели варьирование количеством аммиака в системе. Изменение количества 25% раствора аммиака в системе по-разному сказывается на хроматографической подвижности исследуемых лекарственных веществ. Хроматографическая подвижность линезолида, морфина, амитриптилина, новокаина, мелипрамина, димедрола и фенобарбитала снижается при уменьшении количества аммиака до 0,7 и 0,5 частей в системе, а эфавиренза и рифампицина, наоборот, увеличивается. Подвижность офлоксацина не изменяется. Подвижность фенобарбитала при уменьшении до 0,7 частей не изменяется. Лучшей разделяющей способностью обладает система, в которой количество аммиака составляет 1,5. В результате проведенных экспериментов найдена подвижная фаза диэтиловый эфир - хлороформ - 25% раствор аммиака (15:2:1,5), позволяющая разделить комбинированные сочетания офлоксацина, линезолида, эфавиренза с антидепрессантами, анальгетиками, седативными, антигистаминными, противотуберкулезными лекарственными средствами, наиболее часто применяемых совместно, и получить зоны веществ правильной формы.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемое техническое решение отличается тем, что в качестве растворителя для изолирования офлоксацина, линезолида и эфавиренза используют дихлорметан и насыщенный раствор натрия хлорида при рН 4,0 соответственно, хроматографирование проводят в системе диэтиловый эфир - хлороформ - 25% раствор аммиака в соотношении 15:2:1,5, что соответствует критерию изобретения «новизна».

Новая совокупность признаков обеспечивает повышение селективности, объективности и чувствительности анализа, что соответствует критерию «промышленная применимость».

При анализе известных решений было выявлено, что в них отсутствуют сведения о влиянии отличительных признаков на достижение поставленного технического результата, следовательно, изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Способ осуществляют следующим образом: 10 мл мочи, содержащей смесь исследуемых веществ, переносят в делительную воронку, добавляют 25% раствор аммиака до рН 4,0, 10 мл насыщенного раствора натрия хлорида, 30 мл дихлорметана и затем проводят экстракцию трехкратно в течение 7 минут. Извлечения переносят в фарфоровую чашку и оставляют при комнатной температуре до удаления органического растворителя. Полученный сухой остаток растворяют в 2 мл хлороформа и перемешивают.

На линию старта пластинки «Сорбфил» размером 10×10 см микропипеткой наносят по 0,4 мл раствора смеси. Рядом наносят по 0,4 мл растворов стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) в хлороформе, содержащихся в смеси. Пластинку сушат на воздухе в течение 5 минут, а затем помещают в хроматографическую камеру со смесью растворителей: диэтиловый эфир - хлороформ - 25% раствор аммиака (15:2:1,5) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт растворителя пройдет почти до конца пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 20 минут и просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Для приготовления растворов стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) берут 0,1 мкг СОВС и растворяют в 10 мл хлороформа.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Готовят растворы извлечения из мочи и растворы веществ-свидетелей описанным выше способом. Хроматографируют испытуемые растворы, используя оптимальную систему растворителей. Далее обнаруживают зоны веществ на хроматограмме УФ-светом.

На хроматограмме обнаружены зоны веществ со следующими значениями R_f офлоксацин 0,01±0,01; линезолид 0,29±0,01; эфавиренз 0,72±0,03; амитриптилин 0,52±0,01; мелипрамин 0,59±0,01; новокаин 0,65±0,02; фенобарбитал 0,35±0,01; морфин 0,10±0,02; димедрол 0,45±0,02; рифампицин 0,23±0,01.

Данные примеры подтверждают, что предлагаемый способ может быть использован для химико-токсикологического и фармацевтического анализа офлоксацина, линезолида и эфавиренза в комбинированных сочетаниях с антидепрессантами, анальгетиками, седативными, антигистаминными, противотуберкулезными лекарственными средствами - амитриптилином, мелипрамином, новокаином, морфином, фенобарбиталом, димедролом, рифампицином.

Таким образом, предлагаемый способ определения и обнаружения офлоксацина, линезолида и эфавиренза в комбинированных сочетаниях после извлечения их из мочи с использованием тонкослойной хроматографии позволяет повысить селективность, объективность и чувствительность анализа.