Способ лиофильного высушивания аттенуированных бактерий B. pertussis, аттенуированная бактерия B. pertussis, штамм аттенуированных бактерий B. Pertussis, вакцина, лиофилизированный вакцинный препарат

Предшествующий уровень техники

Сохранение жизнеспособности бактерий, входящих в состав иммунобиологических препаратов является важнейшей биотехнологической задачей. Для этих целей используют разные методы, включающие в себя замораживание, хранение бактерий в различных стабилизирующих растворах или гелях и некоторые другие. Наиболее надежным, удобным и обеспечивающим максимальные сроки их хранения методом консервации иммунопрепаратов является лиофилизация.

В патенте RU 2303999 описан способ получения ассоциированной коклюшной, дифтерийной и столбнячной вакцины. Смешивание бесклеточного коклюшного анатоксина, дифтерийного и столбнячного анатоксинов осуществляют одновременно в присутствии физиологического раствора, забуференного фосфатом, полученную смесь выдерживают в течение 1 часа при 4-10°С с последующей сорбцией на гидроксиде алюминия и оставляют на ночь в холодильнике при 4-10°С, непосредственно перед лиофилизацией в смесь добавляют сахарозу до конечной концентрации 9-10,5%, после чего смесь перемешивают и выдерживают при 4-10°С в течение 1 часа, разливают в ампулы по 0,6 мл и подвергают вакуумной лиофилизации. После лиофилизации ампулы запаивают под вакуумом и хранят в холодильнике при 4-10°С.

Патент RU 2213557 касается фармацевтической композиции, содержащей иммобилизованную форму ферментного препарата протосубтилина (комплекс нейтральных и щелочных протеаз из В. subtilis). В качестве полимерных носителей для иммобилизации протеаз используют смесь полиэтиленоксида и декстрана. Декстран выполняет функцию структурообразователя, позволяющего проводить лиофилизацию всей композиции с образованием хорошо сформированной, однородной, пористой массы (таблетки). Полиэтиленоксид и декстран оказывают синергетический эффект на способность к лиофилизации в зависимости от диапазона концентраций. При концентрации полиэтиленоксида более 10% не удается сформировать пористую, однородную массу. При концентрации декстрана свыше 10% вязкость композиции резко увеличивается, что значительно ухудшает качество лиофилизации всей композиции.

Декстраны также используются в средах для культивирования аттенуированных живых вакцинных штаммов (патентная заявка US 20090246222).

Однако методы лиофилизации не применялись для получения живых вакцинных препаратов возбудителя коклюша. Бактерии B. pertussis могут сохранять жизнеспособность в течение разного времени при низкотемпературной заморозке с криопротекторами. Но цельноклеточные вакцины, содержащие инактивированные бактерии, не рекомендуется подвергать замораживанию. Таким образом, известные публикации свидетельствуют об актуальности разработки способа лиофильного высушивания аттенуированных бактерий B. pertussis, используемых в качестве живых вакцин.

Исследования последнего десятилетия показали, что циркулирующие в настоящее время в разных странах штаммы бактерий B. pertussis содержат последовательности ptx, fga, prn отличные от соответствующих последовательностей ранее циркулирующих и вакцинных штаммов B. pertussis [Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Ивашинникова Г.А., и др. Особенности распространения штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем, с различными аллельными вариантами гена, кодирующего промоторную область коклюшного токсина (ptxP). Журнал эпидемиология и инфекционные болезни 2012, №2, стр. 28-34;

de Gouw D, Hermans PW, Bootsma HJ, et al. Differentially expressed genes in Bordetella pertussis strains belonging to a lineage which recently spread globally. PLoS One. 2014, 8, 9(1):е84523]. Высказываются предположения, что рост заболеваемости коклюшем связан именно с циркуляцией бактерий «нового» генотипа. Рассматривается возможность замены «старых» вакцинных штаммов на «новые» для производства современных вакцин.

Большинство выявленных мутаций в последовательности ptx, кодирующей основной протективный антиген возбудителя коклюша, коклюшный токсин (КТ), расположены в области, ответственной за формирование структур протективных эпитопов КТ. Мутации в регуляторных областях генов факторов вирулентности и протективных антигенов Ptx, Fga, Prn, усиливающих их продукцию, приводят к увеличению вирулентности, и, возможно, защитных свойств [Mooi FR, van Loo IH, van Gent M, He Q, Bart MJ, Heuvelman KJ, de Greeff SC, Diavatopoulos D, Teunis P, Nagelkerke N, Mertsola J Bordetella pertussis strains with increased toxin production associated with pertussis resurgence. Emerg Infect Dis. 2009, 15(8):1206-13].

Описаны аттенуированные бактерии В. pertussis, содержащие мутантные гены ptx и dnt (затронуты кодирующие области), не проявляющие активности дермонекротического токсина, продуцирующие генетически измененную иммунологически активную нетоксичную токсоидную форму коклюшного токсина, сохранившие способность связывания с рецептором эукариотической клетки и индуцировать защиту животных от заражения вирулентными бактериями возбудителя коклюша (патент РФ 2455024). Описанные аттенуированные бактерии В. pertussis могут быть использованы в качестве вакцины, содержащей живые аттенуированные бактерии или инактивированные аттенуированные бактерии В. pertussis.

Краткое описание изобретение

Впервые разработан способ лиофильного высушивания аттенуированных бактерий B. pertussis, позволяющий получить живые вакцинные препараты (ЖКВ) бактерий B. pertussis, и обеспечивающий стабильность структуры и биологических характеристик аттенуированных бактерий.

Другим аспектом изобретения являются аттенуированные бактерии В. pertussis 4MKS, содержащие мутацию в регуляторной области гена ptx, две мутации в области, определяющей ферментативную (токсическую) активность КТ, и нокаутную (инактивирующую) мутацию в кодирующей области гена dnt, которые могут быть использованы в качестве живой вакцины, и лиофилизированный вакцинный препарат на их основе.

Еще один аспект изобретения касается штамма аттенуированных бактерий B. pertussis 4MKS, депонированного в «Государственной коллекции бактерий II-IV группы патогенности» ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №171/332 от 03.03.2014 г. для использования в качестве вакцины.

Краткое описание фигур.

Фиг. 1 (а) и (б). Представлена структура фрагментов хромосомы B. pertussis 4MKS, содержащих мутантные гены dnt (а) и (ptx) (б)

Тонкие линии указывают на положение генов cat, dnt, bla и ptx, сайтов рестрикции и модифицированных последовательностей гена ptx. Модифицированные последовательности приведены на выносе. Буквами, набранными курсивом на выносах, обозначены последовательности оперона ptx в участках, подвергавшихся мутагенезу. Большими буквами обозначены триплеты, кодирующие аминокислоты Lys9 (AAG), Arg9 (CGC), Gly129 (GGA) и Glu129(AAG). Прямоугольники со стрелками обозначают положение генов, кодирующих субъединицы S1-S5 в структуре оперона ptx B. pertussis. Незаштрихованный прямоугольник, обозначенный буквой «Р» - промотор оперона ptx. Ломаными линиями обозначены положения праймеров, использованных для амплификации (табл. 1) и последующего секвенирования модифицированных фрагментов генов dnt, и ptx в составе хромосомы аттенуированных бактерий.

Подробное описание изобретения

Впервые предложен способ лиофильного высушивания аттенуированных бактерий B. pertussis, позволяющий получить живые вакцинные препараты бактерий B. pertussis (ЖКВ), и обеспечивающий стабильность структуры и биологических характеристик аттенуированных бактерий.

Предложенный способ лиофилизации аттенуированных бактерий B. pertussis (ЖКВ) предусматривает выращивание бактерий на твердой среде КУА, суспендирование в защитных средах, последующее замораживание и высушивание, причем в качестве защитных сред используют сахарозо-желатинозную среду, состоящей из сахарозы 10% + желатин 1% и среду, содержащую декстран 5% + желатин 1% + сахарозу 3%, или желатин 1% + декстран 10%; замораживание культуры осуществляют в интервале температур от - 45° до - 80°С в течение 15 часов, с последующим высушиванием в течение 18-20 часов при изменении температуры от - 30°С до +20°С.

Лиофилизацию аттенуированных бактерий B. pertussis и оценку выживаемости аттенуированных бактерий после сушки осуществляли в соответствии с примером 1.

Выживаемость аттенуированных бактерий B. pertussis 4MKS

Результаты определения выживаемости аттенуированных бактерий B. pertussis 4MKS после сушки с тремя стабилизаторами, представленные в таблице 1, показывают, что в результате сушки бактерий с использованием любой из защитных сред, наблюдается снижение КОЕ. Минимальное снижение выживаемости бактерий регистрируется при сушке препаратов в декстраново-сахарозо-желатиновой и сахарозо-желатиновой среде.

Сохранение жизнеспособности бактерий, входящих в состав иммунобиологических препаратов, является важнейшей биотехнологической задачей.

Важными условиями, определяющим стабильность ЖКВ, являются условия культивирования и подготовки биомассы для высушивания. В настоящее время при производстве ККВ используют два типа среды для культивирования бактерий: твердую и жидкую. Биомасса с твердой питательной среды может быть суспендирована непосредственно в защитной среде, и использована для лиофилизации. Бактерии, культивированные в жидкой питательной среде необходимо отделить от среды и после этого суспендировать в защитной среде. Для приготовления препарата аттенуированных бактерий согласно изобретению используют бактерии B. pertussis AMKS, выращенные на твердой питательной среде КУА.

Результаты показали, что предложенный метод лиофилизации препаратов обеспечивает сразу после сушки выживаемость бактерий на уровне 50-70%.

Была проведена наработка 3-х серий препарата ЖКВ и проверка стабильности их биологических свойств после высушивания и хранения от одного месяца до одного года.

Суммарные результаты анализа 3-х серий препарата спустя 1 год хранения представлены в таблице 2.

После одного хранения препарата и последующего высева бактерий всех проверенных серий на среду КУА с добавлением крови наблюдали формирование округлых блестящих колоний (КОЕ) с четко очерченными краями и гладкой поверхностью размером около 1 мм. Микроскопия мазков из колоний выявила грамотрицательные коккобациллы, располагающиеся отдельно или парами.

При подсчете КОЕ отмечено 30-50% снижение выживаемости лиофилизированных бактерий при хранении 4-8С° в течение года (табл. 2). Значения вакуума во флаконах достигали значений близких к 1 кПа.

Качество лиофилизированного препарата ЖКВ.

Проверки качества высушенного препарата ЖКВ определяли, как описано в примере 2.

Основные критерии качества и требования, предъявляемые к цельноклеточным инактивированным корпускулярным коклюшным вакцинам, сформулированы в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты. Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с» и МУК 4.2.2317-08). Необходимо отметить, что в настоящее время в мире ЖКВ не производятся, и поэтому нет соответствующих критериев оценки ее качества. Основные критерии качества вакцинных штаммов бактерий B. pertussis согласно изобретению основаны на сохранении стабильности структуры и биологических характеристик аттенуированных бактерий.

Стабильность структуры генома и биологических характеристик рекомбинантнах микроорганизмов в процессе их культивирования и хранения является одним из основных требований к иммунобиологическим препаратам, приготовленным из живых бактерий (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты. Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с.). Анализ стабильности структуры модифицированных участков генома определяли по стабильности фенотипических характеристик (устойчивости к антибиотикам), а также в результате рестрикционного анализа и секвенирования специфических фрагментов хромосомы аттенуированных бактерий, полученных в результате их амплификации с помощью ПЦР, как показано в примере 2.

Стабильность биологических характеристик препарата оценивали при определении токсической активности КТ по ЛСА, активности ДНТ по наличию некроза при внутрикожном введении морским свинкам и защитной активности в летальных тестах белых мышей, инфицированных внутримозговым введением вирулентных бактерий B. pertussis 18323, согласно методике, описанной в упомянутом выше Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств, или интраназальным введением вирулентных бактерий B. pertussis 475, согласно методу, описанному в патенте РФ 2623314.

Изучение структуры модифицированных участков генома и основных иммунобиологических характеристик серий препаратов аттенуированных бактерий до лиофильного высушивания, через год хранения показало, что сушка и хранение бактерий не влияет на стабильность генома и иммунобиологические характеристики аттенуированных бактерий (табл. 4).

Сравнительное изучение защитной активности аттенуированных бактерий B. pertussis 4М и B. pertussis 4MKS при интраназальной вакцинации лабораторных мышей.

Результаты сравнительного изучения защитной активности аттенуированных бактерий «старого» генотипа ptxP1 B. pertussis 4М и нового ptxP3 B. pertussis 4М KS в тесте выживаемости вакцинированных лабораторных мышей после внутримозгового заражения бактериями B. pertussis 18323, приведены в примере 4. Как указано выше эти генотипы характеризуются одинаковой структурой КТ, но разной его экспрессией. Данные, представленные в таблицах 5 и 6, свидетельствуют об увеличении защитной активности при использовании бактерий B. pertussis 4MKS относительно защитной активности аттенуированных бактерий «старого» генотипа ptxP1 B. pertussis 4М.

Результаты определения токсичности бактерий B. pertussis 4MKS и B. pertussis 4М, говорит о полной идентичности измеренных параметров и отсутствии у аттенуированных бактерий двух разных ptxP - генотипов токсичности.

Таким образом, введенная регуляторная мутация не приводит к неконтролируемому изменению токсичности аттенуированных бактерий, несмотря на увеличение уровня продукции токсоида КТ, а аттенуированные бактерии B. pertussis 4MKS могут быть использованы в меньшем количестве, чем B. pertussis 4М, для достижения равного защитного эффекта мышей. Таким образом аттенуированные бактерии B. pertussis 4MKS генотипа ptxP3, согласно изобретению, сконструированные на основе бактерий B. pertussis 4М (патент РФ 2455024), могут быть использованы в качестве ЖКВ.

Использование такого подхода позволит экономить время, средства и быстро реагировать на необходимость замены генотипов в вакцинных штаммах, возникающую в популяции по мере применения вакцин, в том числе и содержащих мутации в кодирующей части генов, кодирующих протективные антигены.

Другим аспектом изобретения является аттенуированный штамм B. pertussis 4MKS, содержащий один из «новых» генотипов оперона ptx - ptxP3, характеристикой генотипа которого является наличие мутации в регуляторной области оперона ptx, ответственной за связывание белка bvgA, усиливающей экспрессию оперона и продукцию КТ [Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Ивашинникова Г.А., и др. Особенности распространения штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем, с различными аллельными вариантами гена, кодирующего промоторную область коклюшного токсина (ptxP). Журнал эпидемиология и инфекционные болезни 2012, №2, стр. 28-34].

Штамм B. pertussis 4MKS содержит мутации в регуляторной и кодирующей области оперона ptx, и кодирующей области гена dnt, депонирован в «Государственной коллекция бактерий II-IV группы патогенности» ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» (в музей лаборатория Генетики бактерий) Минздрава России под №171/332 от 03.03.2014 г. предназначен для использования в качестве вакцины.

Конструирование аттенуированных бактерий B. pertussis 4MKS, содержащих мутацию в регуляторной области оперона ptx осуществляли в соответствии с примером 3.

Совершенствование вакцин путем контролируемых изменений структуры и функции отдельных генов бактерий, позволяет быстро реагировать на возможное ухудшение эффективности специфической профилактики коклюша, связанной сформированием бактерий «нового» генотипа.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1. Лиофилизация аттенуированных бактерий B. pertussis и выживаемость аттенуированных бактерий B. pertussis после лиофилизации.

Лиофилизация аттенуированных бактерий B. pertussis осуществляли в следующих защитных средах: сахарозо-желатинозной среде, состоящей из сахарозы 10% + желатин 1%, в среде, содержащих декстран 5% + желатин 1% + сахарозу 3%, и желатин 1% + декстран 10%.

Сахарозо-желатинозную среду готовили разведением сахарозы и желатина в физрастворе (0,9% раствор хлорида натрия).

Две другие защитные среды готовили путем растворения желатины и сахарозы в растворе декстрана с молекулярной массой 40-70 кДа (преимущественно 40 кДа) в 0,025 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,5. Среды автоклавировали при 121-125°С в течение 30 мин.

Бактерии выращивали на среде КУА в течение 36 часов. Биомассу с чашек снимали стеклянными палочками и суспендировали в соответствующих защитных средах до концентрации 10⁹-10¹⁰ микробных клеток/мл по оптическому стандарту мутности. Количество живых бактерий в культуре до и после высушивания определяли по значению КОЕ, в соответствии с принятой методикой.

По 0,5-1 мл суспензии бактерий в защитной среде разливали в стеклянные флаконы и закрывали резиновыми пробками. Первый этап - замораживание культуры - проводили в холодильной камере при температуре от - 45 до -80 С° в течение 3-15 часов, или в жидком азоте в течение 10-30 мин. Высушивание проводили в лиофильной сушке LabconcoFreezone 12L или аналогичном оборудовании.

Замороженный продукт размещали на полке камеры, охлажденной до -35 С°. Температурный режим сушки: 2 часа при - 30-35 С°, и далее с постепенным повышением температуры до +20 С° в течение 15-30 часов, 1 час при +25 С°, 1-2 часа при +27 С°. Укупорка флаконов при вакууме максимально достижимом для используемой установки.

Для оценки выживаемости культуры, препараты, высушенные в соответствующих защитных средах, ресуспендировали в 1 мл физраствора, и в последовательных разведениях высевали на среду КУА с кровью для определения КОЕ. Значения КОЕ для каждого препарата определяли по результатам высева культуры из трех флаконов. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Таким образом, в результате сушки бактерий с использованием любой из защитных сред, наблюдается статистически достоверное снижение КОЕ. Минимальное снижение выживаемости бактерий регистрируется при сушке препаратов в декстраново-сахарозо-желатиновой и сахарозо-желатиновой среде. При хранении бактерий в течение года не наблюдается дальнейшего снижения выживаемости бактерий.

Пример 2.

Изучение безопасности и защитной активности генно-инженерной живой вакцины интраназального применения для профилактики коклюша согласно изобретению проводилось согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты». Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с.) и рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).

Токсическая активность аттенуированных бактерий B. pertussis 4MKS

Специфическую токсическую активность аттенуированных бактерий B. pertussis, определяли in vivo по способности индуцировать лейкоцитоз (ЛСА) у мышей. Токсическую активность ДНТ рекомбинантных клеток определяли в опытах на морских свинках. Морским свинкам весом 300-350 г вводили внутрикожно 2,0 МОЕ, 1,0 МОЕ и 0,5 МОЕ живых микробных клеток в логарифмической фазе в объеме 0,2 мл. Контроль - ОСО-5 (отраслевой стандартный образец на основе живых коклюшных бактерий). Образование некроза учитывали через 24 и 48 ч.

Стабильность фен о типических характеристик аттенуированных бактерий B. pertussis 4MKS

Стабильность фенотипических характеристик аттенуированных бактерий B. pertussis определяли в разные сроки хранения (от 1 месяца до 1 года) после их высева на среду КУА. Для этого во флакон с высушенной биомассой добавляли 0,9% раствор хлорида натрия, суспендировали 5 минут, разводили и высевали на среду КУА с кровью до отдельных колоний. Посевы культивировали при 36 С° в течение 5 суток. Для каждой экспериментальной точки методом реплик переносили по 48 бактерий на селективные среды: КУА + стрептомицин (400 мкг/мл), КУА + налидиксовая кислота (100 мкг/мл), КУА + канамицин (50 мкг/мл), КУА + хлорамфеникол (25 мкг/мл) и КУА без добавления антибиотиков. В качестве контроля на матрицу наносили Km^RCm^RNal^RStr^R культуру B. pertussis 4М и Km^SCm^SNal^SStr^S B. pertussis415. По росту бактерий на средах определяли их фенотип.

Анализ полученных результатов показал, что все колонии, отобранные после посева бактерий, хранящихся в разные сроки, выросли на среде с Cm, Nal и Str и не выросли на среде с Km. Таким образом, все проверенные аттенуированные бактерии имели заданный фенотип Km^SCm^RNal^RStr^R.

Для анализа структуры модифицированных фрагментов генома бактерий B. pertussis, содержащих мутантные гены коклюшного (ptx) и дермонекротического (dnt) токсинов, использована ПЦР, рестрикцию продуктов амплификации и их сиквенирование. Для проведения ПЦР были использованы праймеры, специфичные для последовательностей генов ptx, cad и dnt. Расположение праймеров и их последовательность представлены в таблице 3.

Ампликоны, очищенные с помощью Wizard PCR preps purification system (Promega, США), секвенировали на приборе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems/ Hitachi). Использовали наборы Big Dye Terminatorv 3.1 Cycle Sequencing. Режим амплификации выбирали согласно рекомендациям к прибору. Электрофорез продуктов реакции осуществляли в капиллярах длиной 50 см с полимером РОР-7.

Стабильность структуры хромосомы в области модификации гена ptxS1 через месяц после лиофилизации бактерий определяли секвенированием продуктов амплификации ДНК хромосомы бактерий, выделенной из трех случайных флаконов (по одному из каждой экспериментальной серии) с использованием праймеров K1KS - S1-S. Показано, что искомый фрагмент присутствовал в хромосоме всех исследованных ДНК, а его последовательность содержала мутации в генах исходного штамма

Поверхностные агглютиногены определяли в реакции агглютинации на стекле с моноспецифическими сыворотками к главным агглютиногенам коклюшного микроба 1, 2 и 3 после высева бактерий на среду КУА с кровью барана.

Лейкоцитоз стимулирующую активность (ЛСА) и активность дермонекротического токсина (ДНА) определяли после разведения лиофилизированной суспензии бактерий в 1 мл 0,9% растворе хлорида натрия. Суммарные результаты анализа качества 3-х серий препарата спустя 1 месяц хранения представлены в таблице 4.

Пример 3. Конструирование аттенуированных бактерий «нового» генотипа.

При конструировании аттенуированных бактерий «нового» генотипа использованы методические приемы, описанные при конструировании аттенуированных Km^RCm^RNal^RStr^R бактерий B. pertussis 4М (патент РФ 2455024).

Мутация, определяющая «новый» генотип ptxP3 не затрагивает структурную часть оперона и не может оказывать влияние на протективные характеристики токсоида КТ, но способна увеличить уровень его продукции. На Фиг. 1 показано расположение мутации на хромосоме «нового» генотипа. Для аллельного обмена была сконструирована плазмида pjQКS, содержащая фрагмент последовательности генома B. pertussis «нового» генотипа. Последовательность, определяющая «новый» генотип ptxP3 получена в результате амплификации ДНК хромосомы B. pertussis 55-12, описанной и любезно предоставленной нам д.м.н. Борисовой О.Ю. [de Gouw D, Hermans PW, Bootsma HJ, et al. Differentially expressed genes in Bordetella pertussis strains belonging to a lineage which recently spread globally. PLoS One. 2014, 8, 9(1):е84523]. Плазмида pjQКS трансформирована в бактерии E. coli SM10, которые использованы в скрещивании с аттенуированными бактериями B. pertussis 4М. Трансконъгаты отбирали на селективной среде, содержащей Cm, Str и Gm. После расчистки трансконъюгатов на селективной среде бактерии высевали до отдельных колоний на среду Cm, Str и методом реплик переносили на селективные среды, содержащие один из пяти антибиотиков Cm, Str, Gm, Km и Nal. Трансконъюгаты с фенотипом Km^SCm^RNal^RStr^RGm^S проверяли на наличие последовательности гена кап, соответствие структуры оперона ptx и гена dnt ожидаемым последовательностям. Анализ соответствующих структур проводили с помощью ПЦР и секвенирования.

Амплификация ДНК хромосомы B. Pertussis 4MКS с праймерами Двф, Двр, Сф, Ср показала полную ее идентичность хромосоме B. pertussis 4М в области мутантного гена dnt. Сравнительные результаты секвенирования фрагментов хромосом B. pertussis 4MКS и B. pertussis 4М, фланкированных праймерами К1КS-S1-S, демонстрируют, что хромосома B. pertussis 4MKS, содержит замену в положении -65 (по отношению к стартовому кодону оперона ptx) с на t, характеризующую «новый» генотипа ptxP3, к которому относится B. pertussis 55-12 [de Gouw D, Hermans PW, Bootsma HJ, et al. Differentially expressed genes in Bordetella pertussis strains belonging to a lineage which recently spread globally. PLoS One. 2014, 8, 9(1):e84523].

Последовательность (SEQ ID: 1) фрагмента мутантного оперона ptx хромосомы аттенуированных бактерий Bpertussis 4MKS (нумерация нуклеотидов представлена от начала секвенирования фрагмента).

Сопоставление последовательности (SEQ ID: 1) фрагмента хромосомы аттенуированных бактерий B. pertussis 4MKS, содержащего мутантный оперона ptx, с последовательностью хромосомы изогенных вирулентных бактерий B. pertussis 475, показывает, что она одержит три замены:

- в регуляторной области: с на t (в положении 315), которая приводит к изменению генотипа ptxP1, у бактерий B. pertussis 475 и B. pertussis 4М, на «новый» генотип ptx Р3, циркулирующих в России бактерий B. pertussis 55-12;

- в кодирующей области: ccgc на taag (в положении 632-636) и а на g (в положении 995), которые приводит к замене Arg9 (CGC) на Lys9 (AAG) и Gly129 (GGA) на Glu129(AAG), определяющих устранение ферментативной активности КТ, присущей вирулентным бактериям B. pertussis 475. Эти мутации присутствовали также в хромосоме ранее описанных, изогенных аттенуированных бактерий B. pertussis 4М (патент РФ 2455024).

Таким образом, сконструированные согласно изобретению рекомбинантные аттенуированные бактерии B. pertussis4MКS сохранили кодирующую последовательность оперона ptx и нокаутную мутацию в гене dnt бактерий B. pertussis4M и содержат регуляторную мутацию в промоторной области оперона ptx, определяющую замену «старого» генотипа ptxP1 бактерий Bpertussis4M на «новый» ptxP3, характерный для циркулирующих в настоящее время бактерий возбудителя коклюша. Полученные аттенуированные бактерии более эффективны в качестве инновационных живых противококлюшных вакцин.

Пример 4. Определение защитной активности живых изогенных аттенуированных бактерий B. pertussis 4М и B. Pertussis 4MКS

Результаты определения защитной активности живых изогенных аттенуированных бактерий B. pertussis 4М и В. pertussis 4MКS при интраназальной иммунизации и внутримозговом и интраназальном заражении мышей вирулентными бактериями B. pertussis 18323 и B. pertussis 475, соответственно, представлены в таблицах 5 и 6.

Из таблицы 5 видно, что на фоне некоторого общего уменьшения выживаемости с уменьшением количества бактерий в вакцинной дозе, можно видеть, что 67% выживаемость мышей обеспечивается при дозе равной 0,15 МОЕ бактерий B. pertussis 4М и 0,03 МОЕ B. pertussis 4М KS. Этот результат указывает на то, что 70% минимум выживаемости обеспечивается достоверно меньшей дозой аттенуированных бактерий B. pertussis 4М KS.

Nв - количество выживших мышей; No - количество мышей в эксперименте

Способ иммунизации; Способ зараж. - способ заражения; м.к. - микробные клетки; К. в. В. р 18323 - Контроль вирулентности бактерий B. pertussis 18323

Представленные в таблице 6 результаты показывают, что все серии ЖКВ защищают животных от интраназального заражения бактериями B. pertussis 475 и B. bronchiseptica 8220-17 в дозе, обеспечивающей 100% гибель (примерно 10 ЛД₅₀) мышей. Зависимость защитной активности от количества аттенуированных бактерий представлена в таблице 6 и близка к параметрам, полученным при внутримозговом заражении мышей бактериями B. pertussis 18323 (табл. 5). Однако выявлены и некоторые количественные отличия. В тесте интраназального заражения бактериями B. pertussis 475, и B. bronchiseptica 8220-17. 70% защита животных обеспечивается при дозе аттенуированных бактерий равной 3×10⁷, что в 5 раз меньшей, чем при использовании теста внутримозгового заражения мышей вирулентными бактериями B. pertussis 18323.

Мыши, вакцинированные коммерческим препаратом АКДС, демонстрирует лучшую выживаемость после интраназального заражения исследованными бактериями, чем при внутримозговом заражении B. pertussis 18323, но худшую, чем показывает ЖКВ в обоих этих тестах. Эти результаты согласуются с представлением о выработке мукозального иммунитета при вакцинации людей и животных ККВ.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют выраженную тенденцию увеличения защитной активности при использовании бактерий B. pertussis 4MKS.