СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АДАПТОГЕННОЙ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к фармацевтике и касается создания растительного средства, обладающего адаптогенной и иммуномодулирующей активностью.

Отечественная медицинская наука сформулировала следующие требования к адаптогенным препаратам: адаптоген должен быть безвредным, проявлять свое адаптогенное действие только на соответствующем фоне, повышая сопротивляемость к вредному влиянию широкого набора факторов физической, химической и биологической природы; должен обладать нормализующим действием независимо от направленности предшествующих сдвигов, и действие адаптогена должно быть тем более выражено, чем более глубоки неблагоприятные сдвиги в организме [Шабанов П.Д. Адаптогены и антигипоксанты // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2003. - Т.2. - №3. - С.50-80].

На основе изучения литературных данных о химическом составе, фармакологических свойствах отдельных растений нами разработана рецептура композиции, состоящей из 15 компонентов (условное название - Адаптофит). Наиболее близок к Адаптофиту по составу растительных компонентов прототип - фитокомпозиция с адаптогенным действием, представляющая собой 40% спиртовую настойку из соцветий календулы лекарственной, плодов мускатного ореха, корней и корневищ левзеи сафлоровидной, девясила высокого, имбиря, аира болотного, солодки уральской, родиолы розовой, бадана, петрушки, побегов пятилистника курильского, листьев крапивы двудомной, плодов облепихи, перца черного, боярышника [Патент RU 2259840 C 2, 10.09.2005]. Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании лекарственного средства, обладающего адаптогенной и иммуномодулирующей активностью и представляющего собой средство, полученное из измельченной растительной смеси и хитозана следующего состава (мас.ч.): соцветий календулы лекарственной - 13; корни левзеи сафлоровидной - 13; плоды граната - 11,5; плоды кардамона - 9,0; корневища девясила высокого - 7,0; плоды перца длинного - 6,5; плоды можжевельника обыкновенного - 5,0; корни алтея лекарственного - 5,0; корни аира болотного - 5,0; трава горца птичьего - 5,0; плоды мускатного ореха - 5,0; корневища имбиря настоящего - 4,5; кора коричного дерева (корица) - 4,5; листья черные бадана толстолистного - 3,0; хитозан - 3,0.

Для приготовления 1000 г предлагаемого средства 133 г соцветий календулы лекарственной, 133 г корней левзеи сафлоровидной, 113 г плодов граната, 92 г плодов кардамона, 71 г корневищ девясила высокого, 66 г плодов перца длинного, 51 г плодов можжевельника, 51 г корней алтея лекарственного, 51 г корней аира болотного, 51 г травы горца птичьего, 51 г плодов мускатного ореха, 46 г корневищ имбиря, 46 г корицы, 31 г листьев черных бадана толстолистного, 31 г хитозана смешивают, измельчают на мельнице до размера частиц 0,5-1,0 мм, просеивают через сито №2 и взвешивают. Потери сырья при измельчении не должны составлять более 2%.

Для доказательства обоснованности предложенного состава авторами проведены серии экспериментов, данные которых подтверждают его выраженную эффективность. Технический результат, получаемый при осуществлении изобретения, выражается в расширении ассортимента лекарственных средств растительного происхождения с широким спектром фармакологического действия для повышения устойчивости организма к воздействию экстремальных факторов различной природы.

Для опытов использовано растительное сырье и хитозан, приобретенные в аптечной сети. Плоды граната и готовые сухие порошки пищевых пряностей - имбирь молотый, кардамон молотый, корица молотая, мускатный орех молотый (производитель ООО «Новосибирский пищевой комбинат») приобретены в торговой сети. Количественное определение основных групп биологически активных веществ в средстве проведено по описанным в литературе методам. Результаты опытов приведены в табл.1.

Качественный и количественный состав некоторых веществ в исследуемых образцах определяли методом ВЭЖХ-МС, с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа марки «Agilent 1200», с тандемным масс-спектрометрическим детектором «ионная ловушка» 6330, способ ионизации электроспрей. Колонка Zorbax Eclipse C18, 5 мкм, 4,6*150 мм. Элюирование проводили в градиентном режиме, в качестве подвижной фазы использовали смесь 0,1% раствора муравьиной кислоты и ацетонитрила в соотношении (1:0, 1:9, 9:1). Объемная скорость потока элюента - 1,0 мл/мин, объем вводимой пробы 10 мкл, время элюирования 30 минут. Анализ проводился в режиме регистрации отрицательных ионов, по полному ионному току TIC, по массовым зарядам характеристических (MS) и дочерних (MS2) отрицательных ионов, режим UltraScan 50-1300 m/z, AutoMS. Стандартные образцы соединений (кверцетина, рутина, лютеолина, лютеолина-7-глюкозида, галловой кислоты) готовили в концентрации 10 мкг/мл. В хроматограф вводили по 20 мкл исследуемых растворов и раствора стандартных образцов, хроматографировали в вышеприведенных условиях.

Количественное определение экдистерона по методу абсолютной калибровки выполнено на хроматографе GILSTON, модель 305 (производитель - Франция); инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 (USA) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для "Windows". В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка размером 4,6×250 мм Kromasil C18, с размером частиц 5 мкн, в качестве подвижной фазы метанол-вода-фосфорная к-та (40:60:0,5). Скорость подачи элюента - 0,8 мл/мин, время - 50 мин, детектирование проводилось с помощью УФ-детектора "GILSTON" UV/VIS модель 151, при длине волны 242 нм. Данные анализов приведены в табл.2.

1. Изучение адаптогенной активности Адаптофита при интенсивной физической нагрузке.

Эксперименты проведены на белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180-220 г. Общую физическую выносливость определяли общепринятым методом по длительности плавания животных в бассейне с грузом, составляющим 7% от массы тела [Р.Д.Сейфулла, И.А.Анкудинова, А.П.Азизов. Адаптогены и физическая работоспособность. - М., 1997. - 267 с.]. Крысам опытной группы внутрижелудочно вводили отвар Адаптофита в объеме 10 мл/кг в течение 7 дней до стрессорного воздействия (1 раз в день за 30 минут до кормления). Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды по аналогичной схеме. В качестве препарата сравнения использовали деалкоголизированный экстракт элеутерококка в объеме 5 мл/кг. Через 7 суток от начала введения средства определяли общую физическую выносливость путем плавания животных до утомления, критерием которого служило первое погружение животного под воду в течение 10 секунд, после чего под легким эфирным наркозом крыс декапитировали и определяли: в гомогенатах скелетной мышцы - содержание АТФ [Алейникова Т.А., Рубцова Г.В. Количественное определение макроэргических соединений мышц (АТФ, креатинфосфата) // Руководство к практическим занятиям по биологической химии. - М., 1988. - С.115-117], молочной (МК) и пировиноградной кислоты (ПВК) [Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. - Минск, 1980. - 231 с.], содержание глюкозы, общего белка, триацилглицеридов (ТГ), холестерина (ХС), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и креатинфосфокиназы (КФК) в сыворотке крови. Исследование проведено на анализаторе «SAP-PHIRE 400» (Япония). Содержание гликогена в гомогенате печени определяли по методу S. Seifter [Seifter S., et al. The estimation of Glycogen with the Antron Reagent // Arch. Biochem. - 1950. - Vol.25. - P.191-200]. Полученные данные представлены в таблицах 3-4. Интенсивная физическая нагрузка сопровождается снижением концентрации АТФ в скелетной и сердечной мышцах. Кроме того, на фоне интенсивной физической нагрузки наблюдается истощение углеводных запасов, а именно снижение концентрации гликогена в печени (Табл. 3).

Превентивное многократное введение Адаптофита оказывало выраженное актопротекторное действие, о чем свидетельствует повышение общей физической работоспособности животных опытной группы: продолжительность плавания увеличилась в 2,7 раза по сравнению с данными животных контрольной группы, исследование показателей энергетического обмена свидетельствует, что повышение физической выносливости животных под влиянием данного средства обусловлено активацией ресинтеза АТФ: содержание ее в скелетной мышце было в 2,4 раза выше по сравнению с аналогичными показателями животных контрольной группы. Кроме того, введение Адаптофита сопровождалось увеличением углеводных запасов в печени: концентрация гликогена в печени животных опытной группы была выше и, соответственно, повышением концентрации глюкозы в сыворотке крови на 47% по сравнению с данными контрольной группы. Отмечается уменьшение активности таких ферментов ЛДГ и КФК у животных, получавших испытуемое средство, на 25 и 29% соответственно (Табл. 3).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что Адаптофит обладает выраженной адаптогенной активностью, повышая неспецифическую резистентность животных при интенсивной физической нагрузке.

2. Изучение антистрессорной активности Адаптофита.

Эксперименты проведены на белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180-220 г. Иммобилизационный стресс воспроизводили общепринятым методом путем фиксации животных в положении на спине в течение 18 ч [Юматов Е.А., Скоцеляс Ю.Г. Сравнительный анализ устойчивости функций сердечнососудистой системы у крыс разных линий при иммобилизации // Журн. высшей нервн. деят. - 1979. - №2. - С.345-350]. Крысам опытной группы внутрижелудочно вводили отвар Адаптофит в объеме 1,0 мл/100 г в течение 7 дней до стрессорного воздействия (1 раз в день за 30 минут до кормления). Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды по аналогичной схеме. В качестве препарата сравнения другой группе животных вводили деалкоголизированный экстракт элеутерококка в объеме 5 мл/кг. На 7 сутки эксперимента животных контрольной и опытных групп подвергали иммобилизационному стрессу, после чего животных декапитировали под легким эфирным наркозом и определяли выраженность триады Селье: гипертрофию надпочечников, состояние иммунокомпетентных органов и появление деструктивных повреждений в слизистой оболочке желудка с подсчетом «язвенного индекса» Паулса [Оболенцева Г.В., Хаджай Я.И., Видюкова А.И., Ларьяновская Ю.В. Влияние некоторых природных веществ на язвенное повреждение желудка крыс, вызванное ацетилсалициловой кислотой // Бюлл. экспер. биологии и медицины. - 1984. - №3. - С.39-40]. Полученные данные приведены в табл.4-5.

Как следует из данных, приведенных в табл.4, у животных опытной группы наблюдается уменьшение массы надпочечников на 26% по сравнению с данными у крыс контрольной группы, а также курсовое введение Адаптофита в дозе 100 мг/кг на фоне стресса способствует увеличению массы иммунокомпетентных органов: тимуса - на 45%, а селезенки - на 60%.

Наряду с этим введение животным испытуемого средства оказывало выраженное гастропротективное действие, задерживая развитие глубоких деструкции слизистой оболочки желудка белых крыс (табл.5). Так, у опытных животных число мелкоточечных кровоизлияний и эрозий встречалось в 25% случаев при поражении в контроле у 66%. Соответственно, индекс Паулса для точечных кровоизлияний у животных, принимавших испытуемое средство, был меньше, чем таковой у крыс контрольной группы и составил 0,125 против 0,4, а для язв - 0,125 против 0,400 в контроле. При этом у крыс, получавших Адаптофит, не наблюдалось образования эрозий, тогда как у животных контрольной группы в 66% случаев отмечалось появление такого поражения слизистой (Табл. 5).

В группе животных, получавших экстракт элеутерококка, из деструктивных поражений слизистой желудка отмечались только эрозии в 33% случаев. На слизистой желудка крыс, входящих в контрольную группу, наблюдали резко выраженный отек и гиперемию, тогда как у крыс, получавших испытуемые средства, отек и сглаженность рельефа слизистой желудка были умеренными.

Полученные данные свидетельствуют, что Адаптофит обладает антистрессорной активностью, препятствуя развитию катаболических изменений, вызванных иммобилизационно-болевым стрессом.

3. Изучение гепатопротекторной активности Адаптофита при тетрахлорметановом гепатите.

Острый токсический гепатит воспроизводили путем подкожного введения 50% масляного раствора четыреххлористого углерода (ССЦ) в объеме 0,4 мл/100 г массы животных 1 раз в день в течение 4 дней [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М. - 2000. - С.228-232]. Животным 1-й опытной группы интрагастрально вводили отвар Адаптофита в течение 21 дней в объеме 5,0 мл/кг массы тела 1 раз в день за 30 мин до приема пищи. В качестве препаратов сравнения: 2-й опытной группе крыс вводили калефлон в изоэффективной дозе 100 мг/кг массы животного и 3-й опытной группе животных по аналогичной схеме вводили препарат сравнения - деалкоголизированный раствор элеутерококка в объеме 5 мл/кг по той же схеме. Животным контрольной группы внутрижелудочно вводили по аналогичной схеме дистиллированную воду.

Для оценки гепатопротекторной активности Адаптофит определяли биохимические показатели, характеризующие функциональное состояние печени лабораторных животных: активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), содержание общего билирубина и активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови определяли общепринятыми методами [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. Под. ред. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.]; экскреторно-поглотительную функцию печени оценивали по скорости выведения бромсульфалеина с желчью [Соловьев В.И., Егоренко Г.Г., Фирсов А.А. Использование математической модели фармакокинетики при изучении функции печени у белых крыс методом бромсульфалеиновой пробы // Лабораторное дело. - 1976. - №9. - С.538-542]. Антипирин вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг, определение антипирина в сыворотке крови проводили через 1, 2, 3 и 4 часа. Для оценки влияния средства на процессы синтеза в организме в гомогенатах тканей печени определяли содержание гликогена. Полученные данные обработаны статистически с использованием U-критерия Манна-Уитни [Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. - М. - 2000. - 263 с.].

Полученные в ходе экспериментов данные свидетельствуют, что повреждение печени крыс четыреххлористым углеродом сопровождается развитием синдрома цитолиза (Табл. 6). Под влиянием указанного гепатотропного яда отмечается повышение активности мембраносвязанных ферментов сыворотки крови белых крыс: активность АлТ к 7 суткам исследования возрастает на 32%, АсТ - на 24% по сравнению с данными у интактных крыс (Табл.6). При курсовом введении Адаптофит в объеме 5,0 мл/кг на фоне токсического гепатита активность указанных ферментов снижается по сравнению с контролем соответственно на 32 и 29%. Тогда как эти показатели при применении препаратов сравнения элеутерококка и калефлона снижались: AcT - на 20 и 24%, АлТ - на 20 и 28%. При исследовании на 14 и 21 сутки эксперимента активность аминотрансфераз у крыс опытной группы, получавших Адаптофит, также была достоверно ниже, чем у животных контрольной группы.

Установлено также, что интоксикация тетрахлометаном сопровождается развитием холестатического синдрома. В частности, на 7 сутки у животных контрольной группы в сыворотке крови активность щелочной фосфатазы повышается на 42%, а содержание общего билирубина - в 2,6 раза по сравнению с данными у интактных крыс. При курсовом введении испытуемого средства активность щелочной фосфатазы и содержание билирубина в сыворотке крови снижались в среднем на 30 и 22% соответственно по сравнению с показателями в контроле (Табл. 6).

При применении препаратов сравнения элеутерококка и калефлона щелочная фосфатаза снижается на 17 и 25% соответственно, а содержание билирубина - на 8 и 12% соответственно. Такая же тенденция сохраняется и в последующие сроки наблюдения (14 и 21 сутки). При этом Адаптофит по фармакотерапевтической эффективности превосходит препараты сравнения (элеутерококк и калефлон).

Установлено, что курсовое введение Адаптофита крысам с токсическим гепатитом сопровождается снижением интенсивности процессов ПОЛ. Так, концентрация МДА в сыворотке крови и в гомогенате печени животных этой группы на 7-е сутки снижается соответственно на 57% и 60% по сравнению с аналогичными показателями крыс контрольной группы. Одновременно с этим под влиянием испытуемого средства отмечается повышение потенциала антиокислительной системы организма: активность каталазы возрастает в 3 раза, а содержание сульфгидрильных групп в сыворотке крови повышается на 20% по сравнению с таковыми у крыс контрольной группы. При этом по своей фармакотерапевтической эффективности Адаптофит превосходит препараты сравнения (элеутерококк и калефлон).

Введение тетрахлорметана белым крысам сопровождается резко выраженным нарушением экскреторно-выделительной функции печени, на что указывает задержка элиминации ксенобиотиков из организма (Табл. 7).

Адаптофит проявляет антитоксическую активность при повреждении печени тетрахлорметаном (Табл. 7). Так, скорость выведения бромсульфалеина (БСФ) и антипирина с желчью у животных, получавших гепатотропный яд, резко снижается, период их полувыведения на 45% и 28% соответственно превышает показатели у интактных крыс. На фоне курсового введения испытуемого средства скорость элиминации БСФ и антипирина с желчью повышается соответственно на 22 (31) % и 16 (20) % по сравнению с показателями у крыс контрольной группы, а у препаратов сравнения элеутерококка - на 10 и 9% соответственно, калефлона - на 16 и 24% соответственно. Полученные данные свидетельствуют об активации экскреторной функции печени под влиянием испытуемого средства, при этом Адаптофит по антитоксической активности превосходит таковую препаратов сравнения.

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что Адаптофит при курсовом введении в объеме 5,0 мл/кг обладает выраженной гепатопротекторной активностью, не уступающей таковой препаратов сравнения (элеутерококка и калефлона).

В целом, данные проведенных исследований свидетельствуют о выраженной адаптогенной активности Адаптофита в условиях интенсивных физических нагрузок, влияния стрессовых факторов и действия ксенобиотиков (тетрахлорметан), превосходя по некоторым критериям препараты сравнения (экстракт элеутерококка и калефлон).

4. Изучение иммуномодулирующей активности Адаптофита.

Эксперименты проведены на мышах-самцах линии F₁(CBA×C57B1/6) массой 18-20 г. Действие исследуемого средства на показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета было изучено на интактных животных, а также животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, вызванной цитостатиком азатиоприном, который вводили животным в дозе 50 мг/кг перорально 1 раз в сутки в течение 5 дней [Д.Н.Лазарева, Е.К.Алехин. Стимуляторы иммунитета. - М., 1985. - 256 с.]. Адаптофит вводили 1-й опытной группе на фоне азатиоприна и 2-й опытной группе интактных мышей в объеме 10 мл/кг перорально 1 раз в сутки в течение 14 дней. Интактная и контрольная группы животных получали воду очищенную по аналогичной схеме. В качестве препарата сравнения использовали жидкий экстракт элеутерококка колючего (ЭЭК) в объеме 5 мл/кг перорально 1 раз в сутки в течение 14 дней.

Действие испытуемого средства на состояние клеточного звена иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) согласно стандартной методике локальной ГЗТ. Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,1%-ной взвеси эритроцитов барана (ЭБ) в физиологическом растворе. На 4-е сутки под подошвенный апоневроз задней лапки вводили разрешающую дозу антигена - 50 мкл 50%-ной взвеси ЭБ. В контралатеральную лапку инъецировали физиологический раствор в том же объеме. Оценку реакции ГЗТ проводили спустя 24 часа по разнице массы опытной (Ро) и контрольной (Рк) лапок.

Состояние макрофагального звена иммунного ответа оценивали в реакции фагоцитоза перитонеальных макрофагов в отношении частиц коллоидной туши. Оптическую плотность лизата клеток перитонеального экссудата, отражающую количество туши, поглощенной перитонеальными макрофагами, определяли при длине волны 620 нм [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева. - М., 2005. - С.81]. Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза по A.J.Cunningham [Cunningham A.J. А method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells // Nature. - 1965. - Vol.207, №5001. - P.1106-1107]. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2*10⁸ клеток на мышь. Реакцию ставили на 5-е сутки после иммунизации. Полученные результаты обработаны статистическим методом с помощью критерия Стьюдента.

При исследовании влияния Адаптофита на процессы антителообразования установлено, что данное средство восстанавливает показатели гуморального иммунного ответа в условиях азатиоприновой иммуносупрессии. Введение азатиоприна приводило к снижению как абсолютного числа АОК, так и числа АОК на 106 спленоцитов на 45% и 37% соответственно по сравнению с теми же показателями в интактной группе (табл.8).

При введении исследуемого средства на фоне иммуносупрессии наблюдали достоверное увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 10⁶ спленоцитов; при этом первый показатель превышал уровень азатиоприновой супрессии в 2,7 раза, а второй - в 1,6. Препарат сравнения - ЭЭК увеличивал абсолютное и относительное число АОК в 2,2 и 1,5 раза соответственно.

При введении Адаптофита интактным животным установлено, что данное средство не оказывает существенного влияния на показатели гуморального иммунитета у интактных животных.

При исследовании влияния Адаптофита на клеточно-опосредованную реакцию ГЗТ установлено, что испытуемое средство восстанавливает индекс данной реакции (ИР ГЗТ) в условиях азатиоприновой иммуносупрессии. Введение азатиоприна приводило к снижению ИР ГЗТ на 44% по сравнению с тем же показателем в интактной группе (табл.9).

При введении испытуемого средства на фоне иммунодепрессии наблюдали увеличение ИР ГЗТ в 2,3 раза по сравнению с контролем, тогда как ЭЭК повышал индекс реакции ГЗТ лишь в 1,5 раза. У интактных животных при использовании Адаптофита не отмечали значимого изменения данного показателя по сравнению с данными в интактной группе (Табл. 9).

При исследовании влияния Адаптофит на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов интактных мышей в отношении частиц коллоидной туши установлено, что данное средство не изменяет фагоцитарный индекс по сравнению с данными в интактной группе (Табл. 10).

При введении данного средства животным с иммунодефицитом наблюдали увеличение фагоцитарного индекса в 2,2 раза по сравнению с данными в контрольной группе, а использование ЭЭК приводило к увеличению фагоцитарного индекса в 1,5 раза по сравнению с контролем (табл.8).

Таким образом, Адаптофит способен ослаблять супрессивное действие азатиоприна на показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа. Исследуемое средство не изменяет показатели иммунитета интактных животных. Это свойство присуще лишь истинным иммуномодуляторам, обладающим активностью только в условиях повреждения иммунитета.

Приведенные выше экспериментальные данные свидетельствуют, что Адаптофит обладает выраженной адаптогенной активностью и оказывает иммуномодулирующее действие в условиях иммуносупрессии.