Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПРЕСС-ТЕСТА НА ТОКСОПЛАЗМОЗ ЖИВОТНЫХ И ЭКСПРЕСС-ТЕСТ НА ТОКСОПЛАЗМОЗ

Группа изобретений относится к области ветеринарии, а именно к методам диагностики болезней, и может применяться для выявления антигенов Toxoplasma gondii или антител к ним в сыворотке или плазме крови животных, а также в материале, полученном от животных методом биопсии (ликвор, лимфатические узлы), и в тканях и органах животных после убоя.

Токсоплазмоз - эндемическое заболевание, распространенное по всему миру - инфицированность в мире составляет 20-90%. Возбудитель заболевания - Toxoplasma gondii - распространен повсеместно, является облигатным внутриклеточным паразитом, который способен поражать широкий спектр теплокровных животных, включая человека. Домашние кошки и дикие животные из семейства кошачьих играют важную роль в эпидемиологии этого заболевания, так как являются дефинитивными хозяевами, которые выделяют с фекалиями устойчивые в окружающей среде ооцисты. Спорулированные ооцисты от инфицированных кошек и брадизоиты в пораженных тканях промежуточных хозяев вирулентны для всех теплокровных животных и человека. В почве ооцисты сохраняются до двух лет. Путь заражения - пероральный. Ооцисты попадают в организм с загрязненными почвой, зеленью, овощами, ягодами. Также источником инфицирования может быть плохо приготовленное или сырое мясо, а также загрязненная вода, не пастеризованное молоко.

Токсоплазмоз характеризуется большим разнообразием клинических проявлений - от бессимптомного носительства до летальных форм, и поражает главным образом нервную систему, мышцы, лимфатические узлы, миокард, глаза, печень и селезенку, и поэтому диагностика данного паразитарного заболевания представляет определенную сложность.

Токсоплазмоз очень опасен для плодов или новорожденных детей, которые могут заразиться от инфицированных матерей.

Быстро выявить возбудителя и начать адекватную терапию - залог успеха при лечении токсоплазмоза, и поэтому создание способов, которые позволили бы в короткие сроки и с высокой степенью достоверности диагностировать данное заболевание, является актуальной задачей.

В настоящее время передним краем научного поиска новых, простых и экономичных методов детекции самых различных антител, антигенов и других аналитов являются экспресс-тесты.

Экспресс-тесты позволяют быстро и с высокой степенью достоверности диагностировать инфекционные заболевания животных непосредственно в присутствии пациента.

Наборы современных быстрых тестов характеризуются:

- получением результатов в максимально короткие сроки (минуты);

- простотой выполнения анализа и учета результатов (визуально, без приборов);

- тем, что их комплектации не требуют дополнительных принадлежностей; т.к. все необходимое уже включено в наборы тестов;

- возможностью проведения анализа нативного биоматериала без выделения возбудителя в чистой культуре;

- небольшим объемом пробы для исследования;

- минимальными трудозатратами и требованиями к квалификации персонала.

Таким образом, экспресс-тесты обеспечивают возможность проведения анализа ветеринарным врачом там, где это необходимо, т.е. без отправки биоматериала в лабораторию, что очень важно для оперативной оценки состояния животного и принятия решения о начале терапии практически в течение врачебного приема.

Одним из быстро развивающихся и востребованных методов лабораторной диагностики является иммунохроматографический (ИХА) анализ. Принцип действия иммунохроматографического теста состоит в том, что при погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль тест-полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость.

Вместе с жидкостью движутся и помеченные красителем антитела. В ИХА в качестве красителя используется коллоидное золото, которым и метят антитела к искомым антигенам. Если в исследуемой физиологической жидкости присутствует искомый антиген, то происходит его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что является уже иммунологическим методом анализа. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы. Не связавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют с вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса. Взаимодействие и темная полоса в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости. Результаты определяются визуально или компьютерной обработкой отсканированного изображения (см., например, Соколов Д.М. и Соколов М.С., Иммунохроматографический анализ, Экспресс - тесты Singlepath и Duopath для выявления патогенных микроорганизмов и токсинов в пищевых продуктах, Молочная промышленность, 2015, №1, с. 4-6).

Таким образом, компонентами для проведения экспресс-теста для диагностики токсоплазмоза животных являются токсоплазменный антиген, иммунная сыворотка и исследуемый материал.

Известен способ получения токсоплазменного антигена для диагностики токсоплазмоза, включающий извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцию токсоплазм обработкой ультразвуком и выделение антигенной фракции изоионным фракционированием (см., например, SU 533376, 30.10.76).

Приготовленный по известному способу токсоплазменный антиген показал высокую специфичность при серологической диагностике токсоплазмоза в реакции связывания комплемента, реакции непрямой гемагглютинации и реакции иммунодиффузии в агаровом геле.

Однако в иммунохроматографическом анализе приготовленный по известному способу токсоплазменный антиген не используется.

Задачей изобретения в части способа подготовки токсоплазменного антигена является получение высокоспецифичного антигена, пригодного для использования в иммунохроматографическом анализе.

Поставленная задача решается тем, что, согласно изобретению, способ подготовки токсоплазменного антигена для проведения экспресс-теста диагностики токсоплазмоза иммунохроматографическим методом с использованием тест-полосок включает извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцию токсоплазм обработкой ультразвуком и выделение антигенной фракции изоионным фракционированием, разведение полученного растворимого токсоплазменного антигена фосфатно-солевым буферным раствором в соотношении 1:10, добавление к полученному раствору равного объема метиленового синего, также предварительно разведенного фосфатно-солевым буферным раствором в соотношении 1:500, нанесение смеси токсоплазменного антигена и метиленового синего на тест-полоски и конъюгацию токсоплазменного антигена и метиленового синего путем нагревания при температуре 37°С в течение 7-10 мин.

Вторым компонентом экспресс-теста для диагностики токсоплазмоза является иммунная сыворотка.

Известен способ получения иммунной сыворотки к токсоплазмам, заключающийся в том, что сыворотку с определенным титром антител получают от больных хронической формой токсоплазмоза, после чего выделяют фракцию иммуноглобулинов, которые затем метят флуоресцеин-5-изотиоцианатом. Получают иммунофлуоресцирующие антитела к токсоплазмам с высокой активностью и специфичностью (см., например, RU 2174233 С1, 27.09.2001).

Однако полученные иммунофлуоресцирующие антитела к токсоплазмам не используются в иммунохроматографическом анализе.

Задачей изобретения в части способа подготовки иммунной сыворотки является получение иммунной сыворотки, содержащей высокоспецифичные антитела, пригодные для использования в иммунохроматографическом анализе.

Поставленная задача решается тем, что, согласно изобретению, способ подготовки иммунной сыворотки для проведения экспресс-теста диагностики токсоплазмоза иммунохроматографическим методом с использованием тест-полосок заключается в том, что в качестве иммунной сыворотки используют кроличью токсоплазменную иммунную сыворотку, которую разводят фосфатно-солевым буферным раствором в соотношении 1:10 и смешивают с равным объемом метиленового синего, предварительно также разведенного фосфатно-солевым буферным раствором в соотношении 1:500, после чего наносят полученную смесь на тест-полоски и конъюгируют иммунную сыворотку и метиленовый синий путем нагревания при температуре 37°С в течение 7-10 мин.

Известен иммунохроматографический тест на основе конъюгатов наночастиц коллоидного золота или люминисцентных микрочастиц со специфическими антителами для быстрого выявления сальмонелл различных групп (см., например, Шиленко И.В. и др., Разработка иммунохроматографических тестов с визуальной и приборной регистрацией для быстрого выявления сальмонелл, Биологические науки, октябрь 2015).

Наиболее близким является способ диагностики токсоплазмоза, который позволяет легко и быстро обнаружить антитела к T.gondii в сыворотке, плазме и цельной крови кошек и свиней при первичном скриннинговом исследовании. В известном способе в качестве красителя также используют коллоидное золото, а в качестве антигена или иммунной сыворотки используют антиген или иммунную сыворотку, предварительно конъюгированные с коллоидным золотом (см., например, Информационный буклет на экспресс-тесты ASAN Pharm.(Корея) с перечнем наборов и описанием процедур постановки анализов, 13.09.16).

Однако известный тест в качестве красителя использует дорогое коллоидное золото, а сама методика проведения диагностики довольно сложная, т.к. основана на соединении моноклональных токсоплазменных антител со специфическими антигенами и идиотипическими антителами, присутствующими в исследуемых образцах тканей. Таким образом, происходит двойное наслоение антител и контроль во всех случаях в виде темной полоски, а тестовая зона при отсутствии антигена в исследуемом образце светлого цвета.

Задачей изобретения является разработка более простого в исполнении экспресс-теста для диагностики токсоплазмоза, который использовал бы более дешевый, по сравнению с известным тестом, краситель, но не уступал бы известному тесту по специфичности и надежности.

Поставленная задача решается тем, что, в экспресс-тесте для диагностики токсоплазмоза, включающем нанесение на диагностические полоски конъюгированных с красителем токсоплазменного антигена или иммунной сыворотки и исследуемого образца сыворотки крови, или плазмы крови, или тканевой суспензии, и диагностику наличия или отсутствия возбудителя токсоплазмоза по изменению окраски диагностической полоски, согласно изобретению, в качестве красителя используют метиленовый синий.

Техническим результатом заявленной группы изобретений является удешевление иммунохроматографических диагностических экспресс-тестов на токсоплазмоз при сохранении их высокой специфичности.

Группа изобретений иллюстрируется следующими примерами, которые, однако, не охватывают все формы ее выполнения.

Пример 1. Получение токсоплазменного антигена и подготовка его для использования в иммунохроматографическом экспресс-тесте.

Лабораторным белым мышам интраперитонально вводят 100 пролиферативных форм токсоплазм в поле зрения микроскопа при увеличении ок. 10 х об. 40 в дозе 0,2 мл. Через 4 дня после заражения с помощью стерильного шприца от мышей получают брюшной экссудат, содержащий суспензию трофозоитов Т.gondii. Полученную суспензию токсоплазм отмывают центрифугированием при 1,5 тыс. об./мин. в течение 10 мин. от клеток брюшного экссудата в фосфатно-солевом буферном растворе (далее - ФСБ) с рН=7,3 и концентрируют до 280 трофозоитов Т. gondii в 1 мл. Для получения растворимого антигена концентрированную суспензию токсоплазм подвергают воздействию ультразвука при 19 кГц и силе тока 5 А. Обработанный ультразвуком материал центрифугируют при 9 тыс. об./ мин. 38 мин. В качестве растворимого антигена используют надосадочную фракцию. Полученный растворимый токсоплазменный антиген разводят ФСБ в соотношении 1:10. Метиленовый синий разводят ФСБ в соотношении 1:500.

Носителем для компонентов иммунохроматографического метода является нитроцеллюлозная мембрана (тест-полоска) на основе сополимера дивинилбензен/стирена (Danger CAS№9004 -70-0, Германия).

Смешивают разведенные ФСБ токсоплазменный антиген и метиленовый синий в равных объемах и наносят на диагностические тест-полоски.

Тест-полоски сушат при температуре 37°С в течение 8 мин.

В процессе сушки происходит конъюгация токсоплазменного антигена с красителем - метиленовым синим.

Пример 2.

Получение токсоплазменной иммунной сыворотки и подготовка ее для использования в иммунохроматографическом экспресс-тесте.

Полученный по примеру 1 растворимый токсоплазменный антиген с концентрацией белка 130 мкг/мл в дозе 0,1 мл разводят в соотношении 1:5 неполным адъювантом Фрейда и вводят кроликам подкожно в область регионарных лимфатических узлов с двух сторон, а также в область нижней брюшной стенки на уровне расположения мезентериальных лимфатических узлов.

На одиннадцатый день кроликам дополнительно вводят по 0,6 мл растворимого токсоплазменного антигена внутримышечно в области лопатки, поясницы и бедра с двух сторон.

На четырнадцатый день и на двадцатый день у кроликов берут кровь из ушной вены в количестве до 10 мл и отделяют сыворотку.

У полученных сывороток с помощью РИГА определяют титр антител.

Для последующего использования в иммунохроматографическом методе отбирают иммунные сыворотки без признаков гемолиза и с титром антител не менее 1:200.

Полученную иммунную кроличью сыворотку разводят ФСБ в соотношении 1:5 (для сыворотки с титром 1:800).

Метиленовый синий разводят ФСБ в соотношении 1:500. Разведенные кроличью сыворотку и метиленовый синий смешивают в равных объемах, наносят на тест-полоски нитроцеллюлозной мембраны и сушат при температуре 37°С в течение 8 мин.

В процессе сушки происходит конъюгация содержащихся в иммунной кроличьей сыворотке токсоплазменных антител с красителем -метиленовым синим.

Пример 3. Проведение экспресс-теста на токсоплазмоз иммунохроматографическим методом.

В предложенном экспресс- тесте ИХА с метиленовым синим все иммунореагенты в опытной и контрольной зонах готовят на основе фосфатно-солевого буферного раствора, рН=7,2-7,4, включающего двузамещенный фосфорнокислый натрий и однозамещенный фосфорнокислый калий (см., например, Приготовление буферных растворов, адрес в Интернете - http://agro-archive.ru/metody-issledovaniya/951-prigotovlenie-bufernyh-rastvorov.html, 03.02.14.

Экспресс-тест проводят следующим образом:

а) Проведение экспресс-теста на выявление антител к возбудителю токсоплазмоза.

Исследовали крупный рогатый скот голштинской породы. Было исследовано 20 коров 3-7 лет. Животные были взяты из двух хозяйств, при этом одно из хозяйств использует пастбищное содержание, а другое хозяйство пастбищное содержание не использует.

В качестве образцов использовали сыворотку крови (от 10 животных) и плазму крови (от 10 животных).

Высушенные по примеру 1 тест-полоски размером 5 мм х 2 мм прикрепляют к основной полоске нитроцеллюлозной мембраны с помощью раствора желатина.

Исследуемые образцы разводят ФСБ (рН=7,2) в соотношении 1:5 и наносят с помощью микротитровальной пипетки на диагностические тест-полоски.

Образцы сыворотки крови или различных тканей наносят в две зоны: I вариант - зона с антигеном Т.gondii + краситель (тестовая) и зона ФСБ + краситель (контрольная); II вариант - зона с кроличьими антителами против Т.gondii + краситель и зона ФСБ + краситель (контрольная). Контрольная зона не содержит специфических антител.

Токсоплазмоз в заявленном экспресс-тесте диагностируют на основании того,что:

- до нанесения образцов тест-полоска нитроцеллюлозной мембраны имеет темно-синий цвет;

- каждая тест-полоска нитроцеллюлозной мембраны имеет поперечно расположенные зоны индикации антител (I), антигена (II) и контрольную (К) - фиг. 1;

- при индикации антител (I) или антигена (II) Toxoplasma gondii цвет диагностических зон тест-полоски изменяется и становится темно-зеленым (I) или светло-зеленым (II). Интенсивность окрашивания в зеленый цвет может различаться в зависимости от количества токсоплазменных антител или антигенов в образцах сыворотки крови, тканей;

- в контрольной зоне (ФСБ + краситель - метиленовый синий) после нанесения исследуемых образцов окраска не изменяется, цвет остается темно-синим.

В двух образцах проб крови и в одном образце пробы плазмы крови окраска тест-полоски изменилась с синей на темно-зеленую, т.е. тест на токсоплазмоз оказался положительным (фиг. 2). Все положительно отреагировавшие на токсоплазмоз животные были из хозяйства, использующего пастбищное содержание.

Во всех остальных исследованных образцах тест-полоски сохранили синий цвет (фиг. 3), т.е. результат считают отрицательным.

Контрольные тест-полоски также не поменяли цвет (фиг. 4).

Животные, у которых экспресс-тест на токсоплазмоз оказался положительным, исследованы и другим методом - в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). Во всех случаях диагноз на токсоплазмоз подтвердился.

б) Проведение экспресс-теста на выявление антигена возбудителя токсоплазмоза в исследуемом образце иммунохроматографическим методом.

Высушенные по примеру 2 диагностические тест-полоски размером 5 мм х 3 мм прикрепляют к основной полоске нитроцеллюлозной мембраны с помощью раствора желатина. В качестве образцов исследовали образцы тканевой суспензии головного мозга и селезенки, полученные от полевых мышей. Всего было исследовано 96 мышей.

Исследуемые образцы развели ФСБ (рН=7,2) в соотношении от 1:10 и нанесли с помощью микротитровальной пипетки на диагностические тест-полоски. По изменению окраски в темно-зеленый (фиг. 5) и светло-зеленый цвет (фиг. 6) диагностировали токсоплазмоз.

Если после нанесения исследуемого образца тест-полоска сохраняет синий цвет (фиг. 3), как в контроле (фиг. 4), то результат считают отрицательным.

Общее количество положительно отреагировавших на экспресс-тест на токсоплазмоз мышей - 23 или 24%.

И в данном случае токсоплазмоз был подтвержден другим методом исследования, а именно, с помощью реакции торможения гемагглютинации.

На основании изложенного выше можно сделать вывод о том, что заявленная группа изобретений позволяет:

- быстро и с большой точностью диагностировать токсоплазмоз, т.к. при сопоставлении результатов РНГА и предложенного экспресс-теста установлена 97, 5% корреляция, а серо- эпизоотологический мониторинг по токсоплазмозу крупного рогатого скота и свиней в Центральном регионе РФ показал соответствие полученных результатов известным среднестатистическим показателям за последние 3-5 лет;

- снизить затраты на материалы и реактивы при проведении иммунохроматографического метода диагностики, т.к. в заявленном тесте не используется коллоидное золото, а на одну тест-полоску затрачивается всего 0,05-0,1 мл подготовленных иммунореагентов;

- отказаться от дорогостоящего оборудования, т.к. в заявленном тесте не используются моноклональные антитела;

- предупредить заражение людей токсоплазмами через мясо и мясные продукты, т.к. заявленный экспресс-тест доступен для применения в условиях мясоперерабатывающих предприятий, боен и лабораторий ветеринарно-санитарной экспертизы рынков.