СПОСОБ ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО ЭЛЕКТРОННОПЛОТНОГО КОНТРАСТИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ЯДРЕ И ЦИТОПЛАЗМЕ ПРИ ГИСТОХИМИЧЕСКОМ ВЫЯВЛЕНИИ КАТИОНОВ НАТРИЯ В УЛЬТРАСТРУКТУРАХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Изобретение относится к области медицины и биологии, гистологического, цитологического, физиологического исследования тканей и клеток органов человека и животных, а так же к цитологическим и гистологическим методам исследования.

Известны способы гистохимического окрашивания натрия хлорида тканей и клеток органов, которое осуществляется с помощью насыщенного водного раствора гексагидроксоантимоната калия (K[Sb(OH)₆]), а также 2% водного раствора OsO₄ /Г. Гайер. Электронная гистохимия. - М.: Мир. - 1974. - 488 с./. Способы окрашивания клеток водным раствором антимоната и осмиевой кислоты необходимы для исследования биологических объектов с помощью электронного микроскопа, так как продукты окрашивания биологических структур, содержащих ионы натрия, в этих способах становятся электронно-плотными.

Избыток тетраоксида осмия препятствует этой гистохимической реакции, так как фосфолипиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты, приобретают высокую электронную плотность. Дополнительное контрастирование нуклеиновых кислот, содержащихся в ядре и цитоплазме клеток уранилацетатом, цитратом свинца или др., так же препятствует гистохимическому выявлению ионов натрия с помощью антимоната. Поэтому основным недостатком данных способов является то, что они осуществляются без синтеза координационных соединений OsO₄ (осмиевая кислота) с гексагидроксоантимонатом калия, которое происходит при нагревании водного раствора этих веществ в водяной бане, а так же последующей очистки растворенных при нагревании координационных соединений OsO₄ в воде, ацетоном от избытка тетраоксида осмия, который плохо растворим в воде и в органических растворителях.

Близким по существу являются способы гистохимического выявления натрия хлорида и ионов кальция в клетках и тканях, которые осуществляются с помощью антимоната /Komnik H. Electron mikroscopische Lokalisation von Na+ and CI - in Zellen and Geweben // Protoplasma. - 1962. - V.55. - P.414-418. Mariani P., Tolomio C, Baldan B., and Braghetta P. Cell wall ultrastructure and cation localization in some benthic marine algae // Phycologia. - 1990. - Vol.29. - No. 2. - P.253-262/.

Существенным отличием заявленного способа от этого является то, что в нем осуществляется синтез и очистка: 1) основных координационных соединений тетраоксида осмия, которые необходимы для гистохимического окрашивания клеток и тканей и 2) K₂CO₃, который необходим для нейтрализации красящего раствора. Для этого используется в восьмикратном молярном отношении к осмиевой кислоте 0,1 M раствор гексагидроксоантимоната калия (K[Sb(OH)₆]). При этом наличествует отсутствие осмиофилии цитоплазматических мембран, при продолжительности окрашивания в течение 4 и более часов.

Близкими по техническому результату являются способы гистохимического окрашивания основных координационных соединений тетраоксида осмия с тиохолинхлоридом, диметиламиноэтилтиолом, несимметричным диметилэтилендиамином, тетраметилэтилендиамином, тетраметилэтелиндиамин, которые используются для гистохимического выявления веществ с кислой реакцией (ядерный хроматин, ядрышки, рибосомы, гликозаминогликаны и др.) в тканях и клетках /Гайер Г. Электронная гистохимия. - М. Мир. 1974. - 488 с./.

Существенным отличием заявленного способа от этого является то, что в качестве лиганда используется насыщенный водный раствор гексагидроксоантимоната калия (K[Sb(OH)₆]), в результате чего синтезируется Os[Sb(OH)₆]₄ и K₂CO₃, а так же то, что для гистохимического выявления натрия хлорида, ионов кальция, ионов неорганического железа используется K[Sb(OH)₆].

Близким по способу осуществления является способ получения пироантимоната ртути (II) /Ширвинский А.Е. RU 2036149 C1/, который используется в неорганической химии при получении соединений сурьмы и ртути. Сущность способа: растворы уксуснокислой ртути (II) и гидроксида калия добавляют к раствору гексагидроксоантимоната калия. Молярное соотношение K[Sb(OH)₆]:Hg(CH₃COO)₂:KOH=2:(2-3):(6-8). Перемешивают и нагревают в течение 10-15 мин. Осадок отделяют, промывают его горячей водой и сушат на воздухе при 100-120°C. Время сушки 15-60 мин. Существенным отличием заявленного способа от этого является то, что образование основного координационными соединениями тетраоксида осмия - Os[Sb(OH)₆]₄ и K₂CO₃, окончательно образуются в присутствии NaCl и ионов натрия (Na⁺), кальция (Ca⁺), которые содержатся в исследуемых органах и тканях организма.

Задачей заявленного способа является дополнительное докрашивание нуклеиновых кислот в ядре и цитоплазме, которое осуществляется путем электронноплотного контрастирования клеток, необходимое для гистохимического выявления катионов натрия в ультраструктурах.

Существо заявленного способа заключается в том, что с помощью трансмиссионного электронного микроскопа изучаются ультратонкие срезы тканей и клеток, фиксированных в гистологическом фиксаторе в течение 1 часа, содержащем 2% водный раствор гексагидроксоантимоната калия, а затем с целью гистохимического обнаружения фосфатных групп, содержащихся в нуклеиновых кислотах, окрашиваются водным раствором основного координационного соединения тетраоксида осмия - Os[Sb(OH)₆]₄, содержащего K₂CO₃, которые окончательно образуются в присутствии NaCl и ионов натрия (Na⁺), кальция (Ca⁺), которые содержатся в исследуемых органах и тканях организма. Реакция гистохимического окрашивания происходит при молярном отношении реагентов внутри кусочков тканей органов, содержащих натрий хлорид др. и реагентов в инкубационной среде K[Sb(OH)₆]:OsO₄, которое равно 1:(1-8):(1-10).

Предложенный нами способ включает синтез основного координационного соединения осмия взаимодействия OsO₄ и осмиевой кислоты с гексагидроксоантимонатом калия, который окончательно происходит в тканях, органах, в клетках которых содержится при обеспечении доступа атмосферного воздуха CO₂, который поглощается K₂O. После фиксации кусочков органов в гистологическом фиксаторе, содержащем гексагидроксоантимонат калия, проводится окрашивание кусочков органов основным координационным соединением осмия, отмывка в дистиллированной воде, обезвоживание в спирте или ацетоне, заключение кусочков в аралдит-эпон, изготовление ультратонких срезов, исследование тканей и клеток с помощью трансмиссионного электронного микроскопа, компьютерной обработкой электроннограмм.

Изобретение иллюстрировано: на фиг. №1 - Хондроциты фиброзно-хрящевой оболочки трахеи крысы. В цитоплазме хондроцитов выявляются кислые группы гликозоаминогликанов. Окраска основным координационным соединением осмия, фиг.2 - Респираторный отдел легких крысы. Клеточные элементы межальвеолярной перегородки, избирательное окрашивание гетерохроматина, эухроматина, ядрышка, перихроматиновых, интерхроматиновых гранул основным координационным соединением осмия, фиг.3 - Стенка альвеолы легких крыс. В альвеолоцитах обнаруживаются электронно-плотные гранулы кальций дигидрофосфата. В межклеточном пространстве - отложение диффузного электронноплотного материала натрий дигидрофосфата, фиг.4 - Интенсивное контрастирование координационным соединением осмия цитоплазмы и ядра клеток соединительной ткани межальвеолярной перегородки. В межклеточном пространстве наблюдается мелкозернистый преципитат антимоната натрия, фиг.5 - Отложения натрия дигидрофосфата в резервном сурфактанте. Ультратонкий срез легких крыс.

Способ осуществляется в три этапа, следующих друг за другом:

1. В начале способа к 2% водному раствору OsO₄, в восьмикратном молярном отношении добавляют насыщенный 2% (0,1 М) водный раствор гексагидроксоантимоната калия K[Sb(OH)₆]. Предварительно смешиваемые растворы каждый в отдельности в течение 30 минут нагревают на водяной бане при 100°C. Затем растворы смешивают, а затем постепенно охлаждают при постоянном энергичном встряхивании для обеспечения доступа атмосферного воздуха, богатого CO₂, который поглощается K₂O.

2. С целью химической коагуляции белков, маленькие (5 мм толщиной, 5 мм длиной) кусочки ткани органов человека или животного фиксируются в гистологическом фиксаторе (глутаральдегид) в течение 1 часа, затем с помощью 2% водного раствора гексагидроксоантимоната калия доводят значения фиксатора до pH 7,4 (добавляют по каплям). После этого поверхность кусочков органов быстро отмывается от фиксатора сначала в бидистиллированной воде, а затем в 2% водном растворе гексагидроксоантимоната калия. Затем в течение 4 часов и более, кусочки тканей органов окрашиваются в 4% растворе основного координационного соединения осмия и K₂CO₃ на бидистиллированной воде. Окрашивание производится при постоянном энергичном встряхивании для обеспечения доступа атмосферного воздуха, богатого CO₂, который поглощается K₂O. После окрашивания кусочки тканей препарируются путем разрезания на более тонкие (1-2 мм толщиной, 2-2,5 мм длиной), затем промываются в бидистиллированной воде, обезвоживаются в этиловом спирте или ацетоне и заливаются в аралдит-аралдит.

3. На этом этапе, на ультрамикротоме изготавливаются ультратонкие срезы тканей, которые изучаются с помощью трансмиссионного электронного микроскопа с последующей компьютерной обработкой электроннограмм с помощью 3D графики.

Пример использования.

Предложенный способ дополнительного электронноплотного контрастирования кислых групп в биомолекулах при гистохимическом выявления катионов натрия в ультраструктурах клеток и тканей был использован для гистохимического исследования респираторного отдела легких, а также трахеи интактных крыс. Маленькие (5 мм толщиной и 10 мм длиной) кусочки тканей легких и трахеи фиксировали в течение 1 часа в 4% растворе глутаральдегида, в который по каплям добавляли 2% гексагидроксоантимонатом калия в целях достижения физиологических значений pH раствора, равного 7,4. Быстро промывают сначала в бидистиллированной воде, а затем в 2% водном растворе гексагидроксоантимоната калия. Два кусочка (5 мм толщиной и 5 мм длиной) помещались в раствор реагента, который содержал 1 мл 4% тетраоксида осмия и 8 мл 2% гексагидроксоантимонатом калия. Объем кусочков органов эмпирически определяется тем, что концентрация натрия хлорида и катионов натрия, кальция и др. в органе приблизительно равна в 0,1 M. В течение 4 часов кусочки тканей органов окрашиваются при энергичном встряхивании в 2% растворе основного координационного соединения осмия с гексагидрооксоантимоната калия на бидистиллированной воде. После окрашивания кусочки быстро промываются в бидистиллированной воде. Затем кусочки тканей препарируются путем разрезания на более тонкие (1-2 мм толщиной, 2-2,5 мм длиной). С целью обезвоживания кусочки тканей проводятся через серию спиртов, ацетон и затем заливаются в аралдит-эпон. Затем на ультрамикротоме LKB NOVA были изготовлены полутонкие и ультратонкие срезы.

В случае изучения полутонких срезов волокнисто (фиброзно)-хрящевой оболочки трахеи и легких обнаруживается высокоинтенсивное гранулярное окрашивание цитоплазмы хондроцитов и хондробластов, клеток альвеол и межальвеолярных перегородок, которые богаты гликозаминогликанами (Фиг.1).

При исследовании ультратонких срезов легких с помощью трансмиссионного электронного микроскопа FEI Tecnai G2 Spirit было обнаружено диффузное избирательное окрашивание кислых клеточных ультраструктур и межклеточного вещества, а так же отсутствие осмиофилии цитоплазматических мембран. В ядрах клеток обнаруживается избирательное окрашивание гетерохроматина, эухроматина, ядрышка, перихроматиновых, интерхроматиновых гранул, для которых характерно повышенное содержание ионов фосфорной кислоты

В цитоплазме клеток альвеол обнаруживается слабоокрашенный или умеренно электронноплотный диффузный материал, слабоконтрастный гранулярный материал 0,01-0,05 мкм и единичные электронноплотные гранулы кальция дигидроортофосфата Ca(H₂PO₄)₂ размером 0,09-0,3 мкм (Фиг.3). В цитоплазме эритроцитов, которые содержатся в капиллярах легких, отмечается слабое окрашивание цитоплазмы, обнаруживаются очень маленькие электронно-плотные гранулы размером 0,01-0,02 мкм (Фиг.2).

Заключение о наличии включений кальция дигидроортофосфата Ca(H₂PO₄)₂ в клетках легких и эритроцитов сделано на основании ранее проведенного гистохимического исследования легких крыс, которое осуществлялось с помощью ализаринового красного C /Зиновьев С.В. Гистохимическая характеристика венозного русла респираторного отдела легких экспериментальных животных, подвергнутых хроническому переохлаждению, после введения в организм дигидрокверцетина // Бюллетень физиологии патологии дыхания. - №45. С.57-61/. В межклеточном веществе и в цитоплазме стенки аэрогематического барьера обнаруживаются скопления нейтральных липидов, к которым прилегают диффузные скопления электронноплотного материала размером 1-4 мкм (Фиг.2, 3).

На поверхности альвеолоцитов первого типа присутствует диффузно окрашенный слой сурфактанта, который имеет низкую электронную плотность. В сурфактанте различается два слоя гипофазы. На поверхности сурфактанта обнаруживаются единичные очень мелкие гранулы осмиофильного материала (Фиг.2, 3).

В альвеолах обнаруживаются окрашенный координационным соединением осмия материал, неупорядоченно расположенный между субклеточных структур в межклеточном веществе, в резервном сурфактанте, в скоплениях нейтральных липидов, который содержит молекулы натрия дегидроортофосфата (NaH₂PO₄), обладающий умеренной электронной плотностью, представленный гранулами размером 0,05-0,3 мкм. Края этих гранул размытые, с нечеткими контурами, при этом часть из них имеют округлую или звездчатую форму (Фиг.5).

Программное обеспечение трансмиссионного электронного микроскопа FEI Tecnai G2 Spirit позволяет провести компьютерную обработку электроннограмм. При предобработке электроннограмм с помощью 3D графики обнаруживаются кристаллы преципитата антимоната, который содержат натрий хлорид и имеет сложный план строения. При увеличении электронного микроскопа более 30000 раз, в случае компьютерной обработки электроннограмм наблюдается, что в составе цитоплазматических вакуолей и в межклеточном пространстве обнаруживаются мелкозернистый преципитат гексагидроксоантимоната калия (0,0001-0,005 мкм) с низкой или умеренной электронной плотностью, который образуется в результате взаимодействия с натрием хлоридом (Фиг.3, 4).

Способ позволяет синтезировать, очистить ацетоном основные координационные соединения осмия - Os[Sb(OH)₆]₄ от избытка тетраоксида осмия, которые используются для гистохимического выявления нуклеиновых кислот в присутствии NaCl и ионов натрия (Na⁺), кальция (Ca⁺), которые содержатся в исследуемых органах и тканях организма.

Технический результат использования способа состоит в том, что достигается качественное окрашивание тканей, клеток за счет подавления окрашивания тетраоксидом осмия фосфолипидов, с целью выявления нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), а так же натрия хлорида, катионов кальция, железа и др., что позволяет провести достоверное ультраструктурное исследование ультратонких срезов с помощью трансмиссионного электронного микроскопа.

Таким образом, предложенный нами способ можно использовать для электронно-микроскопического исследования ультраструктур клеток и межклеточного вещества органов и тканей человека и животных, которые имеют кислые значения pH среды, обловленные присутствием ионов фосфорной кислоты, серной кислоты, а также молекул натрия хлорида, или катионов натрия.