Способ диагностики степени дисплазии шейки матки

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для диагностики степени дисплазии шейки матки.

Рак шейки матки является широко распространенной в мире патологией, ежегодная заболеваемость составляет 13,2 случаев на 100000 женщин, а ежегодная смертность 5,9 случаев на 100000 женщин в год [1]. Цервикальный рак занимает третье место в структуре злокачественных новообразований среди женщин в мире, и первое место по частоте злокачественных опухолей у женщин 15-39 лет.

В России заболеваемость РШМ составляет 20,2 на 100000 женщин, в последние 5 лет отмечен рост на 12,4%, а запущенность вновь выявленных случаев заболевания составила 39,8% [2]. К заболеваниям шейки матки, предшествующим инвазивному РШМ, относят дисплазии эпителия или цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN). По определению ВОЗ, «дисплазия - это изменение, при котором часть толщи эпителия замещена клетками с различной степенью атипии, утратой стратификации и полярности без изменения стромы».

В 2008 г. Г. Цур Хаузену из Немецкого центра исследования рака в Гейдельберге Нобелевский комитет присудил премию по физиологии и медицине за открытие вирусов папилломы человека (ВПЧ), вызывающих РШМ [3].

Концепция канцерогенеза предполагает последовательную прогрессию от CIN 1 до CIN 2 и CIN 3, cancer in situ (CIS) и развития инвазивного рака на фоне персистирующей ВПЧ-инфекции высокого канцерогенного риска. На этапе CIN 1 может наблюдаться регрессия, персистенция и прогресс; вероятность регрессии очень низкая на стадии CIN 2, персистенция и прогрессия наиболее вероятна при CIN 3.

Для обозначения относительного риска профессии до цервикального рака CIN 1 относят к легким, CIN 2 и CIN 3 - к тяжелым, истинно предраковым повреждениям. CIN 3, не подвергающаяся лечению, имеет 30% вероятность перехода в инвазивный рак в течение 3х-летнего периода. В то время, как лишь 1% CIN 3 переходит в инвазивную стадию при условии, что проводится надлежащее лечение [4].

Градация тяжести поражения зависит от количества и расположения незрелых недифференцированных клеток в эпителиальном пласте его стратификации [5].

1. CIN I - недифференцированные клетки занимают нижнюю треть эпителиального пласта

2. CIN II - незрелые клетки занимают нижние две трети толщины эпителия;

3. CIN III - незрелые аномальные клетки занимают более чем двух третей толщи эпителиального пласта или всю его толщину, но инвазия в подлежащую строму отсутствует.

На сегодняшний день диагностика степени дисплазии шейки матки основана на первичном цитологическом обследование шейки матки и цервикального канала, что является классическим скрининговым методом. Диагностический алгоритм выявления патологии шейки матки сводится к сбору анамнеза, общему осмотру пациентки, осмотру в зеркалах и цитологическому исследованию методом Пап-тест на первом этапе.

При выявлении подозрения на патологию шейки матки пациентка подлежит второму этапу обследования (углубленной диагностике): кольпоскопия с прицельной биопсией влагалищной части шейки матки и кюретаж (биопсия) эндоцервикса с целью морфологической верификации диагноза [6, 7].

К основным недостаткам общепринятого цитологического исследования относятся: отсутствие стандартизованного забора материала и приготовления препарата, что на 40-80%) снижает эффективность цитологического исследования; возможность получения ложноотрицательного результата от 6 до 55%.

Кольпоскопия рассматривается как визуальный метод исследования с чувствительностью до 80-90% в определении патологических изменений влагалищной части шейки матки. Однако специфичность данного метода не превышает 30-60%. Гистологический метод исследования прицельно взятого биопсийного материала влагалищной части шейки матки не может быть применен часто и не дает прогноза в отношении прогрессии дисплазии. Применение данной методики возможно в случаях визуальных изменений шейки матки.

Наиболее информативным методом исследования эпителия шейки матки является гистологическое исследование препарата, проведенное после конизации или эксцизии шейки матки с выскабливанием цервикального канала. Однако известно, что даже если диагноз дисплазии морфологически верифицирован, вероятность перехода дисплазии в рак составляет менее 50%.

Сложности четкой градации степени дисплазии при гистологическом исследовании связаны повреждением биоматериала в процессе забора -обугливание тканей по краю среза, полимофизмом поражений - из разных локусов параллельно развивается диплазия разной степени тяжести, с расположением повреждений в труднодоступных участках - верхняя треть цервикального канала, в эндоцервикальных криптах, перечисленные факторы часто приводят к недооценке степени дисплазии.

Однако, тяжесть CIN является фактором определяющим тактику ведения пациентки, включая длительность периода наблюдения, выбор метода лечения.

Активное ведение женщин с CIN рекомендуется случаях: неудовлетворительной кольпоскопии; обширных поражений; длительности течения CIN I (>18-24 месяцев); возраста более 35 лет; невозможности дальнейшего наблюдения. Лечение CIN I проводится с использованием методов аблации или эксцизии.

Тактика ведения женщин с ON П-Ш в биоптате это эксцизионные методы лечения (петлевая эксцизия или конизация), позволяющие получить биоматериал для гистологического исследования.

Курацию пациенток с CIN III и CIS проводят только онкогинекологи [6].

Из патентных источников известен «Способ дифференциальной диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазии III степени и преинвазивного рака шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека» (см. патент RU 2506892, опубл. 20.02.2014, Бюл. №5). Сущностью данного способа является то, что с целью повышения эффективности комплексной дифференциальной диагностики между ЦИН III и carcinoma in situ при лабораторном исследовании определяют иммунологические показатели: содержание CD10×109 /л (CD10), CD20×109 /л (CD20), CD25×109 /л (CD25) лимфоцитов периферической крови, функциональный резерв нейтрофилов цервикальной слизи, у.е. (ФРНС), уровень ИЛ-10, пг/мл крови (ИЛ-10К) и уровни ИНФ-γ, пг/мл крови (ИНФ-γС) и ФНО-α, пг/мл (ФНО-αС) цервикальной слизи, на основании полученных данных вычисляют показатель F(×1):F(×1)=-15,671×CD10+13,993×CD20-15,035×CD25+0,488×ФРНС+0,633×ИЛ-10К+0,1×ИНФ-γС-0,081×ФНО-αС-4,786, и при значении F(×1) больше 0 диагностируют carcinoma in situ, если меньше - цервикальная интраэпителиальная неоплазия III степени. По мнению авторов, способ позволяет осуществить дифференциальную диагностику стадий канцерогенеза шейки матки, тем самым усовершенствовать подходы к лечению женщин с тяжелой дисплазией и преинвазивным раком шейки матки и сохранить полноценную репродуктивную функцию у данной категории пациенток. Однако, по нашему мнению, способ диагностики предполагает забор периферической крови и цервикальной слизи для проведения исследования, что потребует еще одного визита пациентки, помимо проведения эксцизионной биопсии (конизации), выполняемых не только для проведения гистологического исследования, но и являющиеся хирургическим лечением CIN 3, CIS.

Так же, из тех же источников известен «Способ диагностики тяжелой цервикальной дисплазии» (см. патент RU 2273855, опубл. 10.04.2006, Бюл. №10) в котором авторами с целью повышения степени достоверности диагностики диспластических процессов шейки матки в слизи цервикального канала определяют концентрацию β-трансформирующего фактора роста и при значении от 240 пг/мл диагностируют тяжелую дисплазию шейки матки. По мнению авторов этого способа, использование способа в медицинской практике позволяет осуществлять адекватную диагностику тяжести диспластических поражений шейки матки.

Однако, по нашему мнению, на результат исследования цервикальной слизи могут оказывать влияния такие факторы, как фаза менструального цикла, изменения уровня секреции половых гормонов в период беременности, менопаузы, наличие воспалительного процесса в шейке матки и влагалище, использование местных антисептиков и спермицидов, что меняет физиологиченские свойства цервикальной слизи и содержание в ней изучаемых факторов роста.

Таким образом, поиск прогностических признаков клеточной пролиферации с неблагоприятным прогнозом еще на стадии ранних клеточных изменений, когда кольпоскопия, цитологическое и гистологическое исследование недостаточно эффективны является актуальным и авторами предлагаемого способа предложено проводить иммуногистохимическое исследование с исследованием, определением экспрессии маркеров Р16 INK4a, Cyclin D1, Ki-67 в диспластических клетках.

Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является разработка способа диагностики степени дисплазии шейки матки, позволяющего уточнять диагностику степени дисплазии шейки матки.

Технический результат достигается тем, что дополнительно проводят иммуногистохимическое исследование эксцизионых биоптатов шейки матки, с определением маркеров Ki-67, р16 INK4a, Cyclin D1 в покровном эпителии и в железах, при значениях Ki-67 - 11-20% в покровном эпителии, 7-13% в железах, р16 INK4a - 4-8% в покровном эпителии, 0% в железах, Cyclin D1 -10-11% в покровном эпителии и железах, - диагностируют стадию CIN 1; при значениях Ki-67 - 55-75% в покровном эпителии, 73-91%) в железах, р16 INK4a 50-60%) в покровном эпителии, 80-95% в железах Cyclin D1 - 8-9%) в покровном эпителии и железах - диагностируют стадию CIN II; при значениях Ki-67 - 85-95%) в покровном эпителии, 92-95%) в железах, р16 INK4a -70-80% в покровном эпителии, 96-98% в железах, Cyclin D1 - 5-6% в покровном эпителии и железах, диагностируют стадию CIN III, при значениях Ki-67 - 96-100% в покровном эпителии, 96-100%) в железах, р16 INK4a -96-100% в покровном эпителии, 99-100% в железах, Cyclin D1 - 3-4% в покровном эпителии и железах, диагностируют стадию CIS.

Выбор в качестве маркеров дисплазии таких белков, как Р16 INK4a, Cyclin D1, Ki-67, обусловлены их ролью в развитии цервикального канцерогенеза. Белок р16 INK4a играет важную роль в регуляции клеточного цикла эукариот. Этот белок участвует в опосредованном белком ретинобластомы (pRB) контроле перехода клетки из фазы G1 в фазу S и запускает остановку клеточного цикла в процессе дифференцировки клеток. Т.о., экспрессия белка р16 INK4a во время нормального клеточного цикла оказывает антипролиферативный эффект.

Ki-67 - это ядерный белок, который связан с клеточной пролиферацией и экспрессируется во всех активных фазах митотического цикла S, G1, G2, и М, кроме G0 (фаза покоя). Для многих опухолевых процессов характерна гиперэкспрессия маркера пролиферации Ki-67.

Cyclin D1 - более узко «специализированный» маркер клеточного цикла по сравнению с Ki-67, он является одним из регуляторов клеточного деления. Циклины, ассоциированные с ними циклин-зависимые киназы и циклин-зависимые ингибиторы киназ играют важнейшую роль в развитии клеточного цикла. Cyclin D1 экспрессируется только в клетках входящих синтетическую фазу, за которой далее, в норме, следует дифференцировка клетки, ее фунциональное вызревание клетки, регулирует процессы митотического деления клеток.

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) по оценке экспрессии маркеров Р16 INK4a, Cyclin D1, Ki-67 проводили по стандартной методике:

1. Для открытия антигенных детерминант проводили обработку срезов в цитратном буфере [рН 6,0] в течение 30 минут при 95°С на водяной бане. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4°С. В качестве первичных антител при оценке экспрессии Р16 INK4a, Cyclin D1, Ki-67 использовали мышиные моноклональные антитела к данным маркерам, фирма производитель DAKO Corp).

2. Для визуализации реакции антиген-антитело использовали стрептавидин-биотиновую тест-систему [DAKO Corp] согласно инструкции. В качестве хромогена использовали ДАБ+[DAKO Corp].

3. Затем срезы докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам.

4. Реакцию оценивали с применением светового микроскопа (увеличение ×40) по следующим критериям. Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля использовали иммуногистохимическую реакцию без добавления первичных антител.

Выполнено ИГХ на 56 депарафинированных срезах с блоков тканей шейки матки, полученных от препаратов петлевой эксцизии (конизации) зоны трансформации. В качестве контроля использованы 31 образец ткани шейки матки больных с ВПЧ-инфекцией, но не имеющих CIN И CIS (см. табл. 1).

Для различных стадий диспластической трансформации шейки матки характерны следующие усредненные иммуногистохимические профили (см. табл. 2).

Приводим клинические примеры использования способа:

Пример 1.

Пациентка И., 57 лет. Обратилась в Областной консультативно диагностический центр (ОКДЦ) г. Ростов-на-Дону, по поводу положительного ВПЧ теста и наличия наличие плоскоклеточных интраэпителиальных поражений низкого риска (L-SIL) по данным цитологического исследования.

Из анамнеза известно, что женщина ранее перенесла диатероэлекоагуляцию шейки матки по поводу эктропиона. При проведении кольпоскопического исследования обнаружен, 3 тип зоны трансформации, т.е. цилиндрический эпителий цервикального канала и зона стыка эпителиев не визуализируется, доступный осмотру многослойный плоский эпителий в пределах нормы.

На основании клинико-анамнестических, кольпоскопических, данных цитологического исследования был выставлен диагноз - дисплазия легкой степени.

Пациентке была выполнена конизация шейки матки и выскабливание нижней трети цервикального канала, показаниями к оперативному лечению явилась неудовлетворительная кольпоскопия, 3 тип зоны трансформации, положительный ВПЧ тест, перенесенное в анамнезе деструктивное лечение.

Гистологическое заключение: очаги carcinoma in situ (CIS) в многослойном плоском эпителии и эпидермизированных железах.

ИГХ: экспрессия Р16 INK4a в эпидермизированных железах 100%, в покровном эпителии 98%, Ki 67 в покровном эпителии 97%, в эпидермизированных железах 98%, Cyclin D1 в покровном эпителии 3%.

Таким образом, высокие уровни экспрессии маркеров Р16 INK4a, Ki 67 и низкий уровень экспрессии Cyclin D1, наряду с характерными гистологическими изменениями привели к изменению диагноза, и постановке другого - carcinoma in situ (CIS).

В клинической ситуации несоответствие и низкая информативность результатов цитологического и кольпоскопических исследований, совместное ИГХ и гистологическое исследование позволило подтвердить необходимость выполненного лечебного подхода.

Пример 2.

Пациентка Г., 68 лет обратилась на прием к гинекологу в связи с кровомазанием на фоне менопаузы 18 лет.

При осмотре была выявлена выраженная атрофия многослойного плоского эпителия шейки матки и ВПЧ тест показал клинически значимую вирусную нагрузку 31 типа, результат цитологического исследования - материал недостаточно полноценный в виду отсутствия клеток цилиндрического эпителия и зоны трансформации.

При кольпоскопическом исследовании была обнаружена неполная окклюзия цервикального канала. Принимая во внимание наличие у пациентки аномальных кровянистых выделений из половых путей, выполнено бужирование цервикального канала и раздельное лечебно-диагностическое выскабливание полости матки и цервикального канала. Результат гистологического исследования соскоба показал - атрофичный эндометрий, обрывки эпителия с L-SIL без подлежащих тканей. Был поставлен предварительный диагноз атрофический цервицит, ВПЧ 31 тип, дисплазия шейки матки легкой степени.

Пациентке была выполнена конизация шейки матки, гистологическое заключение: CIN 3 в многослойном плоском эпителии и эпидермизированных железах.

ИГХ: экспрессия Р16 INK4a в эпидермизированных железах 97%, в покровном эпителии 75%, Ki 67 в покровном эпителии 90%, в эпидермизированых железах 95%; Cyclin D1 в покровном эпителии 6%.

Таким образом, выполнение ИГХ исследования совместно с традиционным гистологическим позволило правильно оценить степень CIN.

Заключительный диагноз: дисплазия шейки матки тяжелой степени (CIN 3), ВПЧ 31 тип.

Пример 3.

Пациентка Т., 36 лет, была приглашена на прием к онкогинекологу в связи с результатом цитологического исследования H-SIL, подозрение на карциному шейки матки, положительным ВПЧ тестом - ВПЧ 16 и 45 типы.

По данным кольпоскопического исследования - 2 тип зоны трансформации, граница плотного ацетобелого эпителия полностью визуализируется, H-SIL. Был поставлен предварительный диагноз H-SIL, очагово CIS, в связи с чем пациентке была выполнена конизация шейки матки.

Гистологическое заключение: очаги CIN 2 в зоне трансформации, отрицательные края резекции.

Данные ИГХ: экспрессия Р16 INK4a в эпидермизированных железах 85%, в покровном эпителии 50%, Ki 67 в покровном эпителии 75%, в эпидермизированых железах 80%; Cyclin D1l определяется 8% в покровном эпителии.

Совместное использование ИГХ и гистологического исследования, позволило правильно интерпретировать CIN и понизить ее тяжесть. Заключительный диагноз: ВПЧ 16, 45 типы. CIN 2.

Пример 4.

Пациентка Т., 32 года, обратилась в ОКДЦ в связи с планированием беременности.

Из анамнеза известно, что у нее был выявлялся ВПЧ 31 типа на протяжении 18 месяцев. Выполненное цитологическое исследование показало наличие интраэпителиальных поражений высокого риска (H-SIL).

При проведении кольпоскопии были выявленены повреждения соответствующие плоскоклеточным интраэпителиальным поражениям низкого риска (L-SIL) и 2 тип зона трасформации, когда визуализировался стык многослойного плоского и цилиндрического эпителиев и все поврежденные участки.

Был поставлен клинический диагноз - тяжелая дисплазия шейки матки.

Пациентке выполнена эксцизия шейки матки показанием к хирургическому лечению явился H-SIL в цитологическом мазке, несоответствие тяжести, выявленных повреждений при кольпоскопическом исследовании, персистенция ВПЧ высокого риска более 18 месяцев и возраст старше 30 лет.

Гистологическое заключение: очаги CIN 1 в эпидермизированных железах.

ИГХ: экспрессия Р16 INK4a в эпидермизированных железах 0%, в покровном эпителии 5%, Ki 67 в покровном эпителии 15%, в эпидермизированых железах 10%; 1 Cyclin D1 в покровном эпителии 10%.

Выполнение ИГХ исследования наряду с гистологическим позволило изменить диагноз пациентки на дисплазию легкой степени и разрешить отмену контрацепции с целью получения желанной беременности по завершении эпителизации шейки матки.

Способ легко воспроизводим в лечебных учреждениях, отделениях гинекологического профиля.

Технико-экономическая эффективность способа заключается в том, что он позволяет более точно провести диагностику степени дисплазии шейки матки.

Список литературы:

1. Каприн А.Д., Новикова Е.Г., Трушина О.И., Грецова О.П. Скрининг рака шейки матки - нерешенные проблемы / Исследования и практика в медицине. 2015, т.2, N 1

2. Состояние онкологической помощи населению России в 2017 году/ под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой М.: МНИОИ им. П.А. Герцена филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018. - 236 с.

3. Шейка матки, влагалище, вульва. Физиология, патология, кольпоскопия, эстетическая коррекция: руководство для практикующих врачей / под ред. С.И. Роговской, Е.В. Липовой. М.: Редакция журнала Status Praesens, 2014. 832 с.

4. Secondary Prevention of Cervical Cancer: ASCO Resource- Stratified Clinical Practice Guideline, March 2017. Journal of Global Oncology.. 36-41.

5. Письмо Министерства здравоохранения РФ от 2 ноября 2017 г. N 15-4/10/2-7676 О направлении клинических рекомендаций (протокола лечения) "Доброкачественные и предраковые заболевания шейки матки с позиции профилактики рака"

6. Дисплазия шейки матки - этиопатогенез, диагностика, оптимальная тактика лечения/ под ред. А.Э. Протасова, Т.И. Дзюбий, Г.А. Раскин, Н.И. Тапильская, И.Е. Зазерская, Э.Д. Хаджиева Учебное пособие. - СПб.: 2014. - 22 с.

7. Национальное руководство по гинекологии / под ред. Г.М. Савельевой, Г.Т. Сухих, В.Н. Серова, В.Е. Радзинского, И.Б. Манухина. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2017. 989 с.