Результат интеллектуальной деятельности: ЛИОФИЛИЗАТ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

Изобретение относится к ядерной медицине, а именно к лиофилизату для приготовления радиофармпрепарата с галлием-68 для обнаружения очагов неоваскуляризации в организме методом позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ).

Несмотря на серьезные успехи, достигнутые в диагностике и лечении онкологических заболеваний в последнее время, смертность от них остается на одном из первых мест. Для успешного лечения злокачественных новообразований крайне важно своевременно обнаружить эту патологию, поэтому во всем мире ведется поиск новых мишеней для обнаружения очагов злокачественного роста. Одной из таких мишеней является интегрин α_Vβ₃, экспрессирующийся в процессе роста новых кровеносных сосудов, который сопровождает рост злокачественного новообразования и практически не происходит во взрослом здоровом организме.

Для обнаружения таких зон роста используется прежде всего ПЭТ, поскольку она способны обнаруживать раковую опухоль или ее метастазы очень малых размеров (до 2 мм) независимо от места локализации патологии.

В качестве вектора для связывания с интегрином α_Vβ₃, чаще всего используют пептиды, содержащие аминокислотную последовательность аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) в открытой или циклической форме. Основная масса работ направлена на создание препаратов с фтором-18. Первый из них - [¹⁸F]галакто-RGD был исследован на людях в 2005 году. В этом исследовании, препарат показал высокую изменчивость накопления опухоли (стандартизированный уровень накопления (СУН) составил 1.2-10.0) у девяти пациентов с меланомой, саркомой, раком почки и виллезонодулярным синовитом. Было обнаружено, что препарат хорошо переносится, и никаких побочных эффектов от применения [¹⁸F]галакто-RGD не было зарегистрировано. За прошедшие годы были исследованы десятки соединений, меченных фтором-18. Еще два из них ((2 - [¹⁸F] фторпропиламид-цикло(RGDfK) и [¹⁸F]-Fluciclatid) в настоящее время проходит клинические исследования. Все эти соединения получаются обычно с недостаточно высоким выходом и требуют стадию очистки методом ВЭЖХ. Также жесткая привязка к циклотрону приводит к достаточно высокой стоимости этих соединений и ограничивает их дальнейшее клиническое применение. В качестве альтернативы препаратам с фтором-18 активно исследуются соединения, содержащие в качестве позитрон-излучающего радионуклида генераторные изотопы Cu-64 и Ga-68.

Линейный пептид с аминокислотной последовательностью RGD склонен к разложению в физиологических условиях [2], а также обладает невысокой аффинностью (IC50>100 nM) и селективностью по отношению к интегрину αvβ3. Поэтому Кесслер и его сотрудники [21, 22] разработали методику циклизации линейного пептида RGD с добавлением двух аминокислот и удлинением до пентапептида: цикло(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-) или c-(RGDfV). Причем одна из двух добавленных аминокислот присутствует в неестественной D-конфигурации (D-Phe). Полученное соединение позволило достигнуть очень высокой активности и специфичности (по отношению к интегрину тромбоцитов αIIbβ3). Циклическая структура и включение D-аминокислоты в дополнение к очень хорошим связующим свойствам гарантирует высокую стабильность соединения против ферментативного расщепления in vivo. Впоследствии было показано, что циклический пептид, при условии сохранения рецептор-связывающей конформации, показывает большую селективность и аффинность. Пентапептиды показывают наивысший эффект, при этом 5-ая аминокислота практически не влияет на связывание с рецепторами. В научных публикациях по исследованию RGD-пептидов для целей ядерной медицины на сегодняшний день наиболее часто встречается

Для связывания радионуклидов с RGD-пептидами в состав молекулы вводят специальные простетические (для связывания фтора-18) или хелатирующие (для связывания радиометаллов) группы. Для введения этих групп чаще всего используют свободную аминогруппу 5-ой аминокислоты циклического пептида (обычно это лизин), которая находится далеко от ключевой последовательности и не влияет на взаимодействии с интегрином. В ряде случаев в пептидную цепь вводились другие функциональные группы (карбоксильная, пропаргиловая). Для связывания радиометаллов используют хелаторы, образующие с ними прочные комплексы. В случае галлия это обычно такие макроциклические соединения как DOTA (1,4,7,10-тетраазациклодекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота) или NOTA (1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусная кислота), NODAGA (1,4,7-триазациклононан-N-глутаминовая кислота-N',N''-диуксусная кислота) (А.А. Ларенков и др., 2011).

В работе (Knetsch et al., 2011), наиболее близкой к настоящему изобретению, описывается получение, мечение и in vitro изучение [⁶⁸Ga]NODAGA-RGD. Реакцию мечения проводили следующим образом: к 10 мкл раствора NODAGA-RGD в воде добавляли 60 мкл 1,9 М раствора ацетата натрия, а затем 300 мкл раствора элюата генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин. Для биологического тестирования ее пропускали через колонку Sep-Pak С18 cartridge, промывали 2 мл изотонического раствора, меченный пептид смывали 0,5 мл 95% этанола. Затем \этанол удаляли током аргона при 70°C и остаток перерастворяли в 125 мкл натрий-фосфатного буфера (PBS).

Основным недостатком этого метода является то, что препарат получают из жидких реагентов, причем в зависимости от необходимого конечного объема препарата количество исходных реагентов разное. Это создает трудности в рутинном приготовлении РФП. Также пептид в растворе обладает ограниченным сроком годности - даже в замороженном виде не более 1-2 месяцев. Поэтому задачей данного изобретения является разработка состава лиофилизата для приготовления РФП, аналогичного по способу использования с наборами для приготовления РФП с технецием-99м, широко используемым в клинической практике. Помимо этого, в качестве векторной молекулы используется димер, т.е. в состав пептида входит 2 последовательности цикло-RGD (NODAGA-RGD2).

Поставленная задача решается тем, что был разработан состав лиофилизата, который позволяет стабильно получать РФП в клиническом учреждении. При этом срок годности лиофилизата составляет не менее 1 года.

Техническим результатом заявленного изобретения является состав лиофилизата, при добавлении в который 2 мл элюата генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga получают радиофармацевтический лекарственный препарат с высокой радиохимической чистотой (более 90%), при этом раствор имеет приемлемую кислотность и является изотоническим. РФП накапливается в очагах роста опухолей и может быть использован для обнаружения злокачественных новообразований.

Сущность изобретения поясняется на представленных структурах и изображениях:

ФИГ. 1. Структура пептидов RGD (слева) и цикло-RGD (справа)

ФИГ. 2. Структура пептида NODAGA-.

ФИГ. 3. ПЭТ-изображение мыши с перевитой глиобластомой U-87 MG.

ФИГ. 4. ПЭТ-изображение мыши с перевитой аденокарциномой молочной железы Са755.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРИМЕР 1. Получение лиофилизата.

Приготовление набора реагентов: навеску пептида NODAGA-RGD2 (0,002 г) растворяют в 100 мл воды для инъекций. Затем в колбу вносят 1,64 г ацетата натрия и перемешивают до полного растворения. Полученный раствор фильтруют через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Полученный фильтрат фасуют во флаконы для лекарственных средств порциями по 1,0 мл. Флаконы с раствором реагентов помещают в предварительно охлажденную камеру лиофильной сушки и проводят лиофильную сушку. По окончании процесса лиофилизации камеру лиофильной сушки заполняют аргоном, затем укупоривают флаконы резиновыми пробками и герметизируют алюминиевыми колпачками.

ПРИМЕР 2. Приготовление радиофармацевтического препарата в ручном режиме.

Во флакон с лиофилизатом вносят 2 мл элюата генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga в 0,1 М HCl, помещают в защитный свинцовый контейнер и нагревают на кипящей водяной бане в течении 10-15 мин. После охлаждения проводят анализ препарата.

Вариантом состава радиофармацевтического препарата является следующий (на 2 мл):

Радиохимическую чистоту композиции проверяют методом быстрой тонкослойной хроматографии (ITLC). На полоску хроматографической бумаги пластины ITLC-SG, представляющую собой стекловолокно, импрегнированное силикагелем, наносят препарат в количестве 0,001-0,005 мл и проводят хроматографирование восходящим методом, используя в качестве элюента 0,05М лимонную кислоту. В указанном режиме хроматографирования Rf меченного пептида составляет 0,0±0,05, а Rf свободных ионов галлия составляет 0,95±0,05. Радиохимическая чистота (РХЧ) составляет 96,2%. Кислотность раствора определенная с помощью рН-метра, составила 5,2. Изотоничность раствора контролируют измерением осмомоляльности раствора на приборе ОСКР-1М. Она составляет 280 ммоль/кг Н₂ОРФП на основе

ПРИМЕР 3. Приготовление радиофармацевтического препарата с использованием автоматизированного модуля синтеза.

РФП из лиофилизата может быть также приготовлен с использованием автоматизированного модуля синтеза РФП на основе отечественного генератора 68Ge/68Ga, производства ООО НПФ «Позитом-Про» (Москва). В этом случае значительно снижается радиационная нагрузка на персонал.

Синтез проводится в соответствии с инструкцией производителя. Анализ полученного препарата проводят также, как и в примере 2.

Пример 4. Изучение повеления радиофармацевтического препарата в организме лабораторных животных с модельными опухолями.

Показателем функциональной пригодности радиофармацевтического препарата для визуализации очагов злокачественного роста является его повышенное накопление в опухоли по сравнению нормальными органами/тканями. Эксперименты были проведены на животных с перевитой глиобластомой U-87 MG. Данная обухоль характеризуется агрессивным ростом и высокой степенью неоваскулярмзации. Опухоль перевивались опухолевым материалом, взятым от животного-донора, для чего опухоль извлекали, продавливали через мелкое сито для отделения от стромы. Полученную массу взвешивались. Далее добавляли питательную среду Хэнкса в соотношении 1:6. Полученную суспензию гомогенизировали при помощи стеклянной ступки и пестика. При таком разбавлении получали 10-15 млн клеток в мл. Животным опухолевые клетки перевивали подкожно по лопатку по 0,2 мл. Радиофармацевтический препарат вводили мышам с опухолью глиобластомы U-87 MG внутривенно в хвостовую вену в объеме 0,1 мл, введенная активность препарата составила 2,30 МБк на одно животное. Мыши были разбиты на 5 групп (по 3 особи) для каждого временного интервала исследования. Через 15, 30, 60, 90, 120 минут после инъекции РФП животных умерщвляли частичной декапитацией. Для радиометрии отбирали следующие органы и ткани:

- кровь (~0,5 мл);

- щитовидная железа;

- легкие;

- сердце;

- желудок с содержимым;

- печень;

- почки;

- мочевой пузырь;

- тонкий кишечник с содержимым;

- толстый кишечник с содержимым;

- поперечнополосатая мышца (~1,0 г);

Радиометрия проб проведена с использованием автоматического гамма-счетчика Wizard 2480 (PerkinElmer, USA). Полученные результаты представлены в таблице 1. Выраженная тропность препарата РФП «Васкуляр, ⁶⁸Ga» к опухолевому очагу глиобластомы и удержание в нем на фоне других мягких тканей подтверждается значениями коэффициента дифференциального накопления опухолевый очаг/мышца. Иная картина динамики изменения КДН наблюдается в отношении крови - значение опухолевый очаг /кровь будет варьироваться в небольших значениях в течение 120 минут, что подтверждает целесообразность визуализации патологии на ПЭТ на протяжении 120 минут после введения РФП.

Пример 5. Визуализация опухоли в организме животного методом ПЭТ.

Возможность использования РФП, полученного из лиофилизата, была подтверждена в следующем эксперименте. Радиофармацевтический препарат был введен мыши с перевитой глиобластомой U-87 MG внутривенно, в объеме 0,1 мл с активностью около 20 МБк/мл. Через 15, 35 минут после введения животных помещали в камеру с газовой анестезией (изофлуран/кислород, 1:1), затем сканировали на ПЭТ-томографе для лабораторных животных Genisys4 PET/X-RAY (SofieBiosciences, USA) в статическом режиме в течение 10 минут. После получали выходной файл формата *.dicom с его последующей обработкой в программе VivoQuant версии 2.5 и получением изображений с фильтром NIH rainbow. Полученный результат показан на рис. 3. Для сравнения на рис. 4 показано ПЭТ-изображение мыши с аденокарциномой молочной железы Са755, не экспрессирующей интегрины. Видно, что в этом случае накопление препарата в опухоли не превышает фоновых значений.