Способ стимуляции регенерации мышечных ветвей лицевого нерва в эксперименте

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии и предназначено для стимуляции процессов регенерации концов пересеченных периферических нервов.

В настоящее время предложены различные способы стимуляции репарации поврежденных периферических нервов в сочетании с направленной тубуляцией их концов.

Среди методов направленных на катализацию регенераторных процессов при реконструкции поврежденных периферических нервов, можно выделить метод использования мезенхимных стволовых клеток жировой ткани крысы в составе фибринового клея Tissucol-Kit на модели 5 мм диастаза седалищного нерва крысы (Р.Ф. Масгутов, Г.А. Масгутова, А.А. Рогожин и др. журнал "Гены и клетки" Том X №3 2015, "Стимуляция регенерации седалищного нерва крысы с использованием тубуляции в сочетании с аллотрансплантацией мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани". с. 1-5), способ стимулирования регенерации нерва (патент на изобретение №2464020 от 20.10.2012 г., авторы Ю.А. Чернышев, И.С. Рагинов, Г.А. Масгутова и др.), клеточная терапия (журнал "ActaNature" том 7 №3 2015. Е.С. Петрова "Восстановление поврежденного нерва с помощью клеточной терапии", с. 42-53), применение гидрогелевого матрикса (журнал "Клеточная трансплантология и тканевая инженерия", том II, №4, 2007 г. Г.А. Фомина, Р.Ф. Масгутов, В.Г. Штырлин и др. "Гидрогелевый матрикс на основе биосовместимых карбомеров для восполнения дефектов нервной ткани", с. 63-67), трехмерный матрикс-наполнитель кондуита (Патент на изобретение №2517117 от 27.05.2014 г. - "Способ стимулирования регенерации нерва с помощью наноструктурированного матрикса и генетических конструкций").

Однако в каждой из этих методик есть и свои недостатки: негативными последствиями применения стволовых клеток являются иммунный ответ реципиента на введение чужеродных клеток, стимуляция новообразований, развитие воспалений и соединительно-тканного рубца, активация макрофагов и др. (журнал "ActaNature" том 7 №3 2015. Е.С. Петрова "Восстановление поврежденного нерва с помощью клеточной терапии", с. 42-53; М.В. Угрюмов, А.Н. Коновалов, Е.И. Гусев //Вестник РАМН. 2004. №11. с. 8-17).

Критика аналогов

Наряду с работами, в которых отмечено влияние клеточной терапии на реципиента, опубликованы данные о том, что эффект применения клеточной терапии незначителен или отсутствует вовсе (Shi W., YaoJ., ChenX. //Artif. CellsBlood. Substil. Immobil. Biotechnol. 2010. V. 38. №1. P.299-37). Возможно, что этот эффект проявляется непродолжительное время, как в случае использования стволовых клеток на других экспериментальных моделях, что требует дальнейшего изучения.

Прототип

В качестве прототипа нами выбран способ стимуляции восстановления поврежденного нерва мезенхимальными стволовыми клетками (журнал Медицинские новости №10 2011. Д.Ю. Петрова, В.Н. Подгайский, М.К. Недзьведь и др. "Возможность восстановления поврежденных периферических нервов при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток ". с. 9-72. Техника стимуляции репарации мезенхимальными стволовыми клетками поврежденных периферических нервов состоит в следующем: В просвет анастомоза вводят суспензию мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в количестве 1х10⁶/мл. Вводимые клетки предварительно окрашивали витальным красителем РКН-26, для определения их локализации в просвете протеза после трансплантации.

Техника выделения МСК из жировой ткани. Проводится промывание липоаспират стерильным раствором Хенкса с инкубацией в течении 45 мин. с 0,075%-ым раствором коллагеназы I типа ("Sigma", Германия) в PBS (фосфатный буфер). Нейтрализацию фермента проводят равным объемом среды DMEM, содержащий 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (НИИ ЭиМ, РБ). Клетки отмывают 2 раза центрифугированием, клеточный осадок ресуспендируют и в среде DMEM, содержащий 10% ЭТС, 1% антибиотика и 1% глутамина, и засевают в культуральные чашки диаметром 60 мм. Через 24 часа производят смену культуральной среды для удаления не прикрепившихся клеток. В дальнейшем смена среды производится каждые четвертые сутки. По достижении культурами 70-80% конфлюэнтности, клетки их снимают с поверхности культурного пластика с помощью трипсина/ЭДТА, затем активность трипсина ингибируют добавлением среды DMEM, содержащей 10% ЭТС и после двукратного отмывания центрифугированием клетки засевают в культурные чашки для получения первого пассажа.

Недостатками прототипа являются: 1) сложная, длительная и дорогостоящая технология приготовления мезенхимальных стволовых клеток (МСК). 2) введение эмбриональных закладок или стволовых клеток в поврежденные нервные стволы нередко приводит к опухолевым перерождениям трансплантируемых в нерв стволовых клеток. 3) в технике приготовления используют 10% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), что может вызвать иммунный ответ у реципиента.

Целью изобретения является улучшения результатов посттравматической регенерации периферического нерва в виде более полного восстановления двигательной и чувствительной функции в иннервируемых тканях, преодоление протяженных разрывов нерва, сокращения сроков пребывания больных в стационаре и повышения качества жизни больных данного контингента.

Сущность изобретения.

Сущность предлагаемого способа иллюстрирована на фиг. 1, где фиг. поз. 1 - проводник, фиг. 1 поз. 2 - аутоплазма, фиг. 1 поз. 3 - центральный конец пересеченного нерва, фиг. 1 поз. 4 - проксимальный конец пересеченного нерва.

Под общей и местной анестезией в зоне расположения скуловой и щечной ветвей лицевого нерва экспериментального животного проводится разрез длиной 1,5-2 см. После послойного рассечения тканей и обнажения искомых ветвей, проводится выделение их из окружающих тканей в зоне от околоушной слюнной железы до угла рта. Путем иссечения участка длиной 13 мм создается модель дефекта, которая исключает возможность использования прямой нейрорафии. Проводник (фиг. 1 поз. 1) наполняют аутоплазмой (фиг. 1 поз. 2). В проводник помещают центральный конец пересеченного нерва (фиг. 1 поз. 3), и проксимальный конец пересеченного нерва (фиг. 1 поз. 4).

Аутоплазму получают из крови животного, взятой непосредственно перед операцией, путем центрифугирования (со скоростью 1000 об/мин в течение 20 мин.). Аутоплазму вводят шприцом в просвет проводника, который затем помещают в ложе иссеченного нерва и фиксируют узловыми швами к окружающим фасциям. Рана послойно ушивается.

Как показали сравнительные исследования, аутоплазма в проводнике оказывает стимуляцию регенераторных процессов, что проявляется в ускорении роста аксонов центрального конца нерва и составляет 1,5 мм в сутки, в то время как в пустом проводнике 1 мм в сутки.

Пример №1

Белая беспородистая крыса массой 200 гр. Под ингаляционным эфирным наркозом, создавалась модель повреждения двух мышечных ветвей лицевого нерва (скуловой и щечной) путем иссечения их участка лезвием протяженностью 13 мм.

В предварительно подготовленный проводник, с помощью инсулинового шприца, вводился наполнитель (аутоплазма), который затем устанавливался в адекватную позицию в ложе иссеченного участка нерва, после чего в него вводились поврежденные концы ветвей лицевого нерва. Фиксация проводника проводилась путем наложения одиночных узловых швов на фасции окружающих тканей. Рана послойно ушивалась.

Результаты: После вскрытия трубчатого проводника в содержащейся в нем аутоплазме находились проросшие через нее волокна, длина которых на 6-е сутки составляла 7 мм, что составило 1,5 мм в сутки.

Пример: №2

Белая беспородистая крыса массой 220 гр. Модель дефекта мышечных ветвей (скуловой и щечной) лицевого нерва длинной 13 мм, создавалась по аналогичной этапности.

В проводник вводилась аутоплазма, после чего проводник устанавливался в ложе дефекта нерва и в него вводились поврежденные концы нерва. Фиксация проводилась одиночными узловыми швами, накладываемыми на окружающие ткани. Рана послойно ушивалась

Результаты: После вскрытия трубчатого проводника в содержащейся в нем аутоплазме находились проросшие через нее волокна, длина которых на 8-е сутки составляла 10 мм, что составило 1,5 мм в сутки.

Признаки изобретения отличительные от прототипа:

1. В предлагаемом способе для стимуляции посттравматической регенерации используется аутоплазма крови.

В прототипе с этой целью применяется суспензия с мезенхимальными стволовыми клетками.

2. по предлагаемому способу для приготовления аутоплазмы используют кровь, взятую непосредственно перед операцией. Добавление консервантов не требуется.

3. скорость регенерации нервов в просвете проводника в аутоплазме составляет 1,5 мм, что составляет 1,5 мм в сутки, в то время как в проводнике без аутоплазмы рост составляет 1 мм в сутки.

Технический эффект от применения предлагаемого способа

Использование предлагаемого способа стимуляции регенерации нерва при тубулизации по сравнению с существующими способами имеет следующие преимущества: усиление скорости направленного роста аксонов в зоне пересеченного нерва, что подтверждает анализ гистопрепаратов с более выраженными процессами регенерации в результате усиления ангиогенеза с образованием продольно ориентированных пучков нежных коллагеновых волокон и пучков леммоцитов. Помимо восстановления целостности и проводимости нервов в более ранние сроки после травмы, репаративные процессы протекают лучше, воспалительные изменения менее выражены, что ведет к улучшению регенерации нервного волокна.

Скорость регенерации нервов в просвете проводника в аутоплазме составляет 1,5 мм в сутки.

Экономическая эффективность и технологическая доступность методики получения и применения аутоплазмы, непосредственно перед или во время операции. Минимален риск иммунных реакций организма на введение стимулятора.

Положительным эффектом предлагаемого способа является усиление регенераторных процессов направленного роста аксонов, особенно при наличии протяженных дефектов между концами поврежденного периферического нерва.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что заявляемый способ позволяет эффективно стимулировать регенерацию миелиновых волокон, улучшая восстановление функции проводимости нерва при его разрывах, за счет использования адекватного биосовместимого наполнителя внутри проводника в зоне потенциального пространства регенерации нерва.

Актуальность предлагаемой методики связана с важностью вопроса ранней посттравматической реконструкции поврежденного периферического нерва с последующим полноценным восстановлением функции иннервируемых им тканей.

Информация принятая во внимание

Способ стимуляции восстановления поврежденного нерва мезенхимальными стволовыми клетками (журнал Медицинские новости №10 2011. Д.Ю. Петрова, В.Н. Подгайский, М.К. Недзьведь и др. "Возможность восстановления поврежденных периферических нервов при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток". с. 9-72).