Тест-система для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV)

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.

Известен набор реагентов для выявления вируса лейкоза КРС по нуклеотидным последовательностям консервативных областей вирусного генома с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (патент РФ №2521330, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2013 г.), включающий термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контрольный образец - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент генома ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные соответствующими флуоресцентными красителями, для специфического сигнала и сигнала внутреннего контрольного образца.

Также известен тест-система для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контрольный образец - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент генома ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями, (патент РФ №2445370, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2012 г. - прототип). С помощью этого тест-системы проводят электрофоретическое определение размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности.

Однако известный тест- система используется для способа, в котором нуклеотидные последовательности непосредственно читаются по электрофореграмме. Длина фрагментов, которых может быть расшифрована этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза.

Общим недостатком известных технических решений является отсутствие возможности получения достоверной диагностики выявления генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) с целью выявления лейкоза на ранней стадии.

Техническим результатом заявляемого технического решения является получение достоверной диагностики выявления генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) с целью выявления лейкоза на ранней стадии.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV), включающем пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контрольный образец - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент генома ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) проводят реакцию в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля, для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5 конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый тест-система рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, так как относится к средствам диагностики генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV), что соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал F AM/Green - для тестирования сигнала от внутреннего контрольного образца - ВКО; на фиг. 2 канал JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома (Bovine leukosis virus, BLV).

Пример конкретного использования тест-системы для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV).

Для диагностики используют тест-систему в виде набора реагентов в соответствии инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-ЛЕЙКО3-КРС-ФАКТОР» для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ТУ 21.10.60-118-51062356-2016, для диагностики in vitro, (http://www.vetfaktor.ru/.).

Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР РВ (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2).

Состав набора приведен в таблицах 1 и 2.

* Возможна легкая опалесценция

В набор не входят реактивы для экстракции нуклеиновых кислот. Выделение ДНК может проводиться, например, с помощью наборов на основе сорбционного метода, в состав которых входит силика или микроцентрифужные колонки, и также наборов на основе фенол-хлороформной экстракции и т.п. Рекомендуется использовать набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР» либо аналогичный.

Предварительно сорбционным методом выделяют из биологического материала, геном провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV), взятый от животных.

Далее для постановки одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией используют тест-систему содержащий специфичные для участка генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) олигонуклеотидные праймеры, зонды, флуоресцентные красители и контрольные образцы в виде внутреннего и положительного. Для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, если соотношение фрагментов отклоняется в большую или меньшую сторону, то также наблюдаются повторности сомнительных образцов

Фрагмент генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и фрагмент генома бактериофага Т4 представлены следующими нуклеотидными последовательностями:

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.

Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Праймеры, специфичные для ДНК Bovine leukosis virus были отобраны на основе консервативного участка гена "pol" (Bovine leukemia virus complete genome, AF033818.1) и спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems). С помощью BLAST праймеры были проверены на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека. Термодинамический анализ выбранных праймеров был выполнен с помощью Vector NTI. Расчетная длина специфического фрагмента составила 98 пар нуклеотидов.

Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд TMBLV-P (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров TMBLV-F и TMBLV-R). Зонд был помечен красителем R6G. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1. Основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР были описаны с помощью программы "Oligo 6.0".

В качестве внутреннего контрольного образца использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169 - 170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

Пример использования тест-системы. Для исследования используют цельную кровь. Исследования проводили для взрослых особей и телят старше 14-ти дневного возраста. Кровь отбирали из яремной или хвостовой вены в стерильные пробирки с 3% раствором ЭДТА из расчета 10:1.

Для взятия крови используют одноразовые системы.

Пробы цельной крови с ЭДТА использовали для экстракции ДНК без предварительной подготовки.

Анализ исследуемых проб с использованием тест-системы состоял из трех этапов:

- экстракция нуклеиновых кислот (НК);

- проведение ПЦР РВ;

- учет результатов анализа.

Экстракцию (выделение) НК из исследуемых проб проводили следующим образом. Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО) по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) BLV.

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения (ВК-) вместо исследуемой пробы вносят ОКО, в качестве которого используют деионизированную воду (пробирку обозначить как ВК-).

Подготовка образцов к проведению ПЦР проводят следующим образом.

Для проведения ПЦР общий объем реакционной смеси должен составлять 25 мкл, а объем ДНК-пробы - 10 мкл. Успешное прохождение реакции контролировали путем использования положительного контрольного образца (ПКО) BLV, ВКО BLV и ДНК буфера, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) использовали суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) использовали смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1, по 5000 копий специфического фрагмента в 10 мкл (в соотношении 1:1).

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию ПЦР:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ BLV;

10 мкл смеси ПЦР БУФЕР BLV;

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл ДНК соответствующей пробы, полученной по п. 7.1 (включая пробу ВК-);

в) в пробирку с положительным контролем ПЦР (К+) 10 мкл ПКО BLV.

Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией с помощью прибора «Rotor-Gene Q».

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и программируют прибор согласно инструкции производителя.

После завершения программы амплификации отработанные пробирки утилизируют в соответствии с МУ 1.3. 2569 -09. и проводят интерпретацию результатов анализа.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE(HEX)/Yellow (фиг. 2) и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых по каналу FAM/Green (фиг. 1) значение Ct отсутствует или превышает 32 цикл (и при этом по каналу JOE(HEX)/Yellow отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green указывает на присутствие ингибиторов в пробе (ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции.

Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.

Образец считается положительным (ДНК провируса лейкоза КРС присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow (фиг. 2), при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 32 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow более 32), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.

В случае получения значения Ct на канале JOE(HEX)/Yellow менее 32 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.

Образец считается отрицательным (ДНК провируса лейкоза КРС отсутствует) если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct по каналу FAM/Green и Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, фиг. 1, 2).

Для доказательства эффективности использования тест-системы для ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с электрофоретической детекцией. В результате исследований чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при обнаружении ДНК провируса лейкоза КРС на 4,2-5% выше, чем ПЦР с электрофоретической детекцией.