Тест-система для выявления ДНК хламидий у сельскохозяйственных животных и птиц

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.

Известен набор для определения бактерий семейства Chlamydiaceae, включающий пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена возбудителя хламидий, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями (патент РФ 2486255, кл. C12Q 1/68, 2013 г.).

Также известен тест-система для выявления хламидий в клинических образцах методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2241042, C12Q 1/68, 2004 г. - прототип), включающий выделение ДНК из биологического материала от инфицированных животных включающий пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена возбудителя хламидий, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями.

Общим недостатком известных технических решений является недостаточная чувствительность и специфичность, что влияет на получение достоверной диагностики выявления генома возбудителя ДНК хламидий у сельскохозяйственных животных и отсутствие возможности диагностировать хламидий у птиц.

Техническим результатом является получение достоверной диагностаки возбудителя ДНК хламидий и расширение функциональных возможностей.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления ДНК хламидий у сельскохозяйственных животных и птиц, включающем пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклео-тидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена возбудителя хламидий, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нук-леотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК хламидий и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

ChlmF 5' -AAAGAACCCTTGTTAAG -3'

ChlmR 5' -TAACTCCCTGGCTCATC -3'

ChlmPR6G- 5' -AAAAGGCACGCCGTCAAC-3' -BHQ1

T4f TAC ATATAAATC ACGC AAA

T4r TCGTATGGCTAATCTTATT

Ttmf F AM-ACATTGGCACTGACCGAG-BHQ1.

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики возбудителя ДНК хламидий (Chlamydiaceae) инфекции животных проводят реакцию в одной ПНР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома Chlamydiaceae олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПНР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый тест-система рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологиии, для диагностики Chlamydiaceae инфекции у животных,что соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скрин-шоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM - для тестирования сигнала от внутреннего контрольного образца - ВКО; на фиг. 2 - Канал HEX - для тестирования наличия ДНК Chlamydiaceae, на фиг. 3 - таблица количественных данных для JOE(HEX)/Yellow {Chlamydiaceae) и FAM/Green (ВКО).

Тест-система для выявления генома возбудителя ДНК хламидий (Chlamydiaceae) у сельскохозяйственных животных и птиц применяют следующим образом.

Предварительно выделяют ДНК генома возбудителя хламидий (Chlamydiaceae) из биологического материала, взятый от инфицированных животных и птиц по выбору: мазки со слизистых, фрагменты тканей и органов, сперма, моча сорбционным методом. Затем проводят постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с добавлением внутреннего положительного контроля, в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов, затем проводят 45 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентномеченного зонда и контрольных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК хламидий (Chlamydiaceae) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

ChlmF 5' -AAAGAACCCTTGTTAAG -3'

ChlmR 5^Л -TAACTCCCTGGCTCATC -3'

ChlmPR6G- 5' -AAAAGGCACGCCGTCААС-3' -BHQ1

T4f ТАСАТАТАААТС ACGCAAA

T4r TCGTATGGCTAATCTTATT

Ttmf F AM-AC ATTGGC ACTGACCGAG-BHQ1.

Далее по накоплению флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: JOE(HEX) /Yellow для специфического сигнала; FAM/Green для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.

Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Выбранные праймеры позволяют тестировать все значимые для ветеринарии хламидий Chlamydia suis Chlamydia abortus Chlamydia psittaci Chla-mydia felis Chlamydia pecorum Chlamydia avium Chlamydia muridarum Chla-mydia sp.Chlamydia gallinacean референс последовательность Chlamydophila abortus strain EBA 16S and 23 S ribosomal RNA operon, complete sequence Sequence ID: U76710.2 Length: 4854 на этой последовательности в зоне с 2250 по 2450 выбран консервативный фрагмент для хламидий размер ампликона составляет 125 пар нуклеотидов

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, име-ющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Fam. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПНР.

Пример конкретного применения теста-системы для выявления генома возбудителя хламидий (Chlamydiaceae) у с.-х животных и птиц. Для исследования используют от инфицированных животных хламидий (Chlamydiaceae) по выбору следующий материал: Для исследования используют следующий материал:

- Мазки и соскобы слизистых оболочек (ротоглотки, конъюнктивы, урогенитального тракта, прямой кишки, у птиц - клоаки). Снимают с помо-щью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора;

- Фрагменты тканей и паренхиматозных органов павших или вынуж-денно убитых животных и птиц (миндалины, селезенка, легкие, печень, ку-сочки плодовых оболочек, аборт-плоды). Отбирают в стерильный контейнер.

- Сперму, отбирают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл

- Мочу отбирают в количестве 10 - 20 мл в специальный сухой стерильный флакон или контейнер.

- Помет птиц, массой не менее 0,5 г, в сухой стерильный контейнер.

Затем проводят подготовку проб. Соскобы со слизистых конъюнктивы и ротоглотки в физиологическом растворе исследуют без предварительной подготовки.

Сперму в объеме 0,5 мл разводят равным объемом физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 11-12 тыс об/мин в течение 10 мин, осадок, ресуспендированный в 100 мкл физиологического раствора, используют для экстракции ДНК.

Мочу в объеме 10 мл центрифугируют при 3 тыс об/мин в течение 10-15 мин. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 мл материала и повторяют центрифугирование. Надосадочную жидкость осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и 100 мкл его используют для экстракции ДНК. До получения осадка мочу нельзя охлаждать или замораживать.

Исследуемые пробы тканей и органов гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, добавляют пятикратный объем стерильного физиологического раствора или фосфатного буфера и тщательно перемешивают. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и отстаивают в течение 5-7 мин после чего откручивают на миницентрифуге при 1,5-2,0 тыс.об/мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.

Из помета птиц готовят 10% суспензию в физиологическом растворе, центрифугируют при 1,5 тыс об/мин в течение 5 мин, 100 мкл надосадочной жидкости используют для экстракции ДНК. Далее осуществляют анализ, состоящий из трех этапов:

- экстракция нуклеитидных кислот (НК);

- проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;

- учет результатов анализа.

Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое-количество одноразовых пробирок объемом - 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для ОКО, по 10 мкл ВКО хламидий (Chlamydiaceae) в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл.

Проводят одноэтапную ПЦР РВ в одной пробирке. Для проведения ПЦР используют наборы позволяющие специфически амплифицировать фрагмент генома Chlamydiaceae и ДНК внутреннего положительного контроля (бактериофага Т4) в мультиплексной полимеразной цепной реакции. Детекция продуктов амплификации осуществляется в режиме реального времени с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Наборы состоят из комплектов реагентов для проведения ПНР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2).

Наборы выпускаются в двух вариантах:

1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы);

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы). Составы наборов приведены в Таблицах 1 и 2.

Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению «ПЦР-ХЛАМИДИЯ-ФАКТОР», набора реагентов для выявления ДНК хламидий в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. ТУ 21.10.60-108-51062356-2016. http://www.vetfaktor.ru/.

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы вносят ОКО (пробирку обозначают как ВК-).

Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.

Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при темпера-туре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С. Подготавливают образцы к проведению ПЦР следующим образом. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют используя ПКО Chlamydiaceae, ВКО Chlamydiaceae и ДНК БУФЕР, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК Chlamydiaceae и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1, взятых по 5000 копий специфического фрагмента в 10 мкл (в соотношении 1:1).

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР смесь Chlamydiaceae

10 мкл смеси ПЦР БУФЕР Chlamydiaceae

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Затем перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси. Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы;

в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) - 10 мкл ПКО Chlm. Проводят реакцию ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.

Параметры температурно-временного режима амплификации на прибоpax «Rotor-Gene Q», «ДТ-96», «CFX96» и LightCycIer® 96 указаны в Приложениях 1, 2, 3 и 4 Инструкции соответственно. Для проведения амплификации был использован прибор «ДТ-96» Температурно-временной режим амплификации на «ДТ96» представлен в таблице 3.

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора. Программируют прибор согласно инструкции производителя и в соответствии с Приложениями 1, 2, 3 и 4 Инструкции.

Далее проводят интерпретацию результатов анализа. Во всех пробах за исключением пробы - отрицательный образец - (К-) наблюдается кривая роста флуоресценции (фигура 1). В четырех пробах, включая клинический образец k88_3668 и положительный контрольный образец (+) в двух повторах, наблюдается кривая роста флуоресценции. В пробирке - отрицательный образец - (К-) - кривая роста флуоресценции отсутствует (фигура 2).

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору и в соответствии с Приложениями 1, 2, 3 и 4 Инструкции.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Образец считается положительным (ДНК возбудителя (Chlamydiaceae) присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow (фиг. 2), при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 32 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow более 32), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.

В случае получения значения Ct на канале JOE(HEX)/Yellow менее 32 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.

Образец считается отрицательным (ДНК возбудителя (Chlamydiaceae) отсутствует) если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct по каналу FAM/Green и Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, фиг. 1, 2).

Для оценки чувствительности ПЦР РВ проводили постановку реакции с использованием в качестве матрицы титрованного препарата транкрипта, полученного на рекомбинантной плазмиде, содержащей ограниченный праймерами ChlmF и ChlmR фрагмент генома возбудителя (Chlamydiaceae). Чувствительность системы составила 10⁵ г-экв/мл.