Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ПРИСУТСТВИЯ ФОСФАТИДИЛСЕРИНА НА ПОВЕРХНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ

Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования и может использоваться для оценки степени присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.

Известно, что в эритроцитах фосфолипиды расположены асимметрично. Фосфатидилхолин и сфингомиелин локализованы на внешней половине липидного бислоя, фосфатидилэтаноламин на внешней и внутренней половине мембраны. Отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин локализован исключительно на внутренней стороне липидного бислоя (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood. 1997. Vol. 89. P. 1121-1132). Выход фосфатидилсерина на поверхность мембран клеток крови при многих патологических состояниях ускоряет свертывание крови, приводит к тромботическим состояниям (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell. Mol. Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 971-988).

Известен способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов, который включает добавление к эритроцитам флюоресцентного белка аннексина V и последующее измерение флюоресценции с помощью проточного цитофлюориметра (Kuypers F.A., Lewis R.A., HuaM. etal. Blood. 1996. Vol. 87. P. 1179-1183).

Однако для этого требуется дорогостоящее оборудование (проточный цитофлюориметр) и дорогие реактивы.

В качестве прототипа выбран способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов (Шереметьев Ю.А., Поповичева А.Н., Успенский А.Н., Александров А.А., Успенская О.А. Способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов. Патент RU 2665171.2018), который включает фиксацию эритроцитов с помощью раствора глутарового альдегида в течение 30 минут, их отмывание забуференным физиологическим раствором. После этого к клеткам добавляют хлористый лантан в финальной концентрации 20 мкМ и наблюдают за появлением агрегатов с помощью светового микроскопа. По появлению агрегатов эритроцитов судят о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.

Однако этот способ позволяет определить только наличие на поверхности мембран эритроцитов фосфатидилсерина. В то же время важной задачей является определение степени присутствия фосфатидилсерина эритроцитов на поверхности мембран эритроцитов.

Задача предполагаемого изобретения - совершенствование способа.

Технический результат - возможность определить степень присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.

Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем фиксацию эритроцитов с помощью раствора глутарового альдегида в течение 30 минут, их отмывание забуференным физиологическим раствором, помещение в кювету агрегометра, добавление к клеткам хлористого лантана в финальных концентрациях 15-25 мкМ, включение перемешивающего устройства, перемешивание в кювете агрегометра в течение 30 с, остановка перемешивания, процесс оседания агрегатов эритроцитов регистрируют в виде агрегатограммы, о степени присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов судят по максимальной амплитуде агрегатограммы. При концентрациях хлористого лантана меньше 15 мкМ агрегация эритроцитов отсутствует. При концентрации хлористого лантана больше 25 мкМ происходит агрегация и донорских (нормальных) эритроцитов.

Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты фиксируют в 0.25% растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере, в течение 30 минут при комнатной температуре. После фиксации эритроциты один раз отмывают забуференным физиологическим раствором (10 мМ трис-HCI, 150 мМ NaCI, рН 7.4) с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут. 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных эритроцитов в забуференном физиологическом растворе помещают в кювету агрегометра, добавляют 0.1 мл хлористого лантана в финальных концентрациях 15-25 мкМ, включают перемешивающее устройство, перемешивают в кювете агрегометра в течение 30 с, останавливают перемешивание, процесс оседания агрегатов регистрируют в виде агрегатограммы, по максимальной амплитуде агрегатограммы судят о степени присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.

Известно, что инкубация отмытых эритроцитов при 37°С в течение 24 ч приводит к развитию эриптоза, на поверхности мембран появляется фосфатидилсерин (Klarl В.А. et al. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2006. Vol. 290. C. 244-253). Инкубация эритроцитов в присутствии ионов кальция приводит к увеличению степени присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.

Пример 1. Эритроциты донора фиксировали глутаровым альдегидом. К 0.9 мл 0.5% суспензии нормальных фиксированных эритроцитов, помещенных в кювету агрегометра, добавляли 0.1 мл хлористого лантана в финальной концентрации 20 мкМ, включали перемешивающее устройство, проводили перемешивание в кювете агрегометра в течение 30 с, после этого перемешивание останавливали. Процесс оседания агрегатов эритроцитов регистрировали на лазерном агрегометре. Агрегация эритроцитов отсутствует (рис. 1). На поверхности мембран эритроцитов фосфатидилсерин отсутствует.

Пример 2. Суспензию эритроцитов инкубировали при 37°С в течение 24 ч. После этого эритроциты фиксировали глутаровым альдегидом и помещали в кювету агрегометра. К 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных эритроцитов добавляли 0.1 мл хлористого лантана в финальной концентрации 20 мкМ, включали перемешивающее устройство, проводили перемешивание в кювете агрегометра в течение 30 с, после этого перемешивание останавливали. Процесс оседания агрегатов эритроцитов регистрировали на лазерном агрегометре. Максимальная амплитуда агрегатограммы составила 15% (рис. 2). Степень присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов составила 15%.

Пример 3. Суспензию эритроцитов инкубировали в присутствии 1 мМ кальция при 37°С в течение 24 ч. После этого эритроциты фиксировали глутаровым альдегидом. К 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных эритроцитов добавляли 0.1 мл хлористого лантана в финальной концентрации 20 мкМ, включали перемешивающее устройство, проводили перемешивание в кювете агрегометра в течение 30 с, после этого перемешивание останавливали. Процесс оседания агрегатов эритроцитов регистрировали на лазерном агрегометре. Максимальная амплитуда агрегатограммы составила 30% (рис. 3). Степень присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов составила 30%, что в 2 раза больше, чем у эритроцитов, инкубированных без кальция.

Регистрацию процесса оседания агрегатов эритроцитов осуществляли фотометрическим методом на лазерном агрегометре ЛА 230-2 НПФ «Биола».

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить степень присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов человека и может найти применение для изучения эритроцитов при различных патологических состояниях и в опытах in vitro по изучению механизмов эриптоза.