×
10.09.2019
219.017.c9b9

СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
№ охранного документа
0002699728
Дата охранного документа
09.09.2019
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения фракции внеклеточной нуклеиновой кислоты в биологическом образце. Способ включает: (1) секвенирование нуклеиновых кислот биологического образца, содержащего свободные нуклеиновые кислоты, для получения результатов секвенирования для множества данных секвенирования; (2) определение на основе результатов секвенирования количества молекул нуклеиновой кислоты с длиной, попадающей в пределы заданного диапазона, определяя отношение свободных нуклеиновых кислот в биологическом образце. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 16 ил., 8 табл., 3 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии в частности к способу и устройству для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце и к их применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

С 1977 г. исследователи успешно обнаруживали ДНК, происходящую из раковых опухолей, в периферической крови больных с опухолью, также подтверждалось присутствие cff-ДНК а плазме беременных женщин. Определение или оценка ДНК, происходящей из раковых опухолей, в периферической крови больных с опухолями и фракции внеклеточной фетальной ДНК в плазме беременных женщин, т.е. определение фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце имеет большое значение.

Однако остается потребность в усовершенствовании текущего способа определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Варианты осуществления настоящего изобретения направлены на поиск решения, по меньшей мере, одной из проблем, существующих на данном уровне техники, по меньшей мере, до некоторой степени. В связи с этим целью настоящего изобретения является предоставление способа, способного точно и эффективно определять фракцию внеклеточных нуклеиновых кислот в предварительно определенном источнике биологического образца.

Следует отметить, что технические решения настоящего изобретения достигаются на основе следующих открытий.

В настоящее время существует два основных направления определения фракции внеклеточной фетальной ДНК в периферической крови: 1) используя преимущества различных ответов фрагментов материнской ДНК и фрагментов внеклеточной фетальной ДНК в мононуклеарных клетках периферической крови на метилирование специфических маркеров; 2) с помощью отбора множества репрезентативных сайтов SNPs на основе различий среди сайтов однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs). Оба метода имеет определенные ограничесния: метод 1) требует большого количества плазмы, а метод 2) требует захвата зондов и высокой глубины секвенирования или необходимости получения информации от родителей. Однако до сих пор не было опубликовано сообщений об определении фракции внеклеточной фетальной ДНК с помощью полного секвенирования генома с малой глубиной охвата. Исследования показали, что фрагменты внеклеточной фетальной ДНК в материнском кровотоке большинство из которых короче 313 п.о., обычно короче чем фрагменты внеклеточной ДНК матери. Под влиянием этого изобретатели создали способ определения фракции внеклеточной ДНК на основе секвенирования плазмы беременных женщин, причем способ имеет широкое применение и может быть применен к внеклеточной ДНК из разных источников. Например, этот способ может быть также применен для определения фракции ДНК, происходящей от раковых опухолей в периферической крови больного с опухолью.

В первом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает: осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в биологическом образце, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования; определение количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, в биологическом образце на основе результата секвенирования; и определение фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце на основе количества внеклеточных нуклеиновых кислот, с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон. Изобретатели также неожиданно нашли, что фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце, особенно фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или фракция внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих из опухоли, в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, предположительно страдающего опухолевым процессом, или подвергаемого обследованию на предмет опухоли, может быть точно и эффективно определена с помощью способа по настоящему изобретению.

В вариантах осуществления настоящего изобретения биологический образец представляет собой образец периферической крови.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточная нуклеиновая кислота из предварительно определенного источника выбрана из одного из следующего: внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот или материнских внеклеточных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих из опухоли, или внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих не из опухоли, в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, предположительно страдающего опухолевым процессом, или подвергаемого обследованию на предмет опухоли. Следовательно, фракция внеклеточных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или фракция внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих из опухоли, в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, может быть легко определена.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточные нуклеиновые кислоты представляют собой ДНК.

В вариантах осуществления настоящего изобретения результат секвенирования включает длины внеклеточных нуклеиновых кислот.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточные нуклеиновые кислоты в биологическом образце секвенируются с помощью секвенирования спаренных концов, секвенирования единичных концов или секвенирования единичных молекул. Следовательно, длины внеклеточных нуклеиновых кислот могут быть легко получены, что способствует последующим стадиям.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточные нуклеиновые кислоты представляют собой ДНК.

В вариантах осуществления настоящего изобретения определение количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, в биологическом образце на основе результата секвенирования дополнительно включает: выравнивание результатов секвенирования относительно референсного генома так, чтобы создать массив данных, состоящий из множества уникально картированных считываний, где каждое считывание в массиве данных может быть картировано только по положению в референсном геноме; определение длины внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующей каждому уникально картированному считыванию в массиве данных; и определение количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон. Следовательно, количество внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, в биологическом образце может быть легко определено, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения определение длины внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующей каждому уникально картированному считыванию, в массиве данных дополнительно включает: определение длины каждого считывания, уникально картированного относительно референсного генома как длины внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующей считыванию. Следовательно, длина внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующая каждому уникально выровненному считыванию, в массиве данных может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения в случае, когда внеклеточные нуклеиновые кислоты в биологическом образце секвенируются с помощью секвенирования спаренных концов определение длины внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующей каждому уникально картированному считыванию, в массиве данных включает: определение положения в соответствии с референсным геномом 5'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты на основе данных секвенирования на одном конце каждого уникально картированного считывания, полученного при секвенировании спаренных концов; определение положения в соответствии с референсным геномом 3'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты на основе данных секвенирования на другом конце того же уникально картированного считывания, полученного при секвенировании спаренных концов; и определение длины внеклеточной нуклеиновой кислоты на основе положения 5'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты и положения 3'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты. Следовательно, длина внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующей каждому уникально картированному считыванию, в массиве данных может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенный диапазон определяется на основе множества контрольных образцов, в каждом из которых известна фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника. Следовательно, предварительно определенный диапазон может быть определен с точным и надежным результатом.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенный диапазон определяется на основе, по меньшей мере, 20 контрольных образцов.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенный диапазон определяется с помощью следующих стадий: (a) определения длин внеклеточных нуклеиновых кислот во множестве контрольных образцов; (b) установления множества кандидатных диапазонов длины и определения процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученного от каждого из множеств контрольных образцов, присутствующих в каждом кандидатном диапазоне длины; (c) определения коэффициента корреляции между каждым кандидатным диапазоном длины и фракцией внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника на основе процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученного от каждого из множеств контрольных образцов, представленного в каждом кандидатном диапазоне длины, и фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в контрольных образцах; и (d) определения кандидатного диапазона длины с наибольшим коэффициентом корреляции как предварительно определенного диапазона. Следовательно, предварительно определенный диапазон может быть определен точно и эффективно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения кандидатный диапазон длины составляет интервал от 5 п.о. до 20 п.о.

В вариантах осуществления настоящего изобретения определение фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце на основе количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, дополнительно включает:

определение процента внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне на основе количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон; и

определение фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце на основе процента внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, в соответствии с предварительно определенной функцией, где предварительно определенная функция определяется на основе множества контрольных образцов. Следовательно, фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть определена эффективно, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенную функцию получают с помощью следующих стадий:

(i) определения процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующего в предварительно определенном диапазоне; и

(ii) выравнивание процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующего в предварительно определенном диапазоне, с известной фракцией внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника для определения предварительно определенной функции. Следовательно, предварительно определенная функция может быть определена точно и эффективно, что способствует проведению последующих стадий.

В вариантах осуществления настоящего изобретения процент внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующего в предварительно определенном диапазоне, выравнивается с известной фракцией внеклеточной нуклеиновой кислоты из предварительно определенного источника с помощью линейного выравнивания.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточная нуклеиновая кислота из предварительно определенного источника представляет собой фетальную внеклеточную нуклеиновую кислоту, полученную из образца периферической крови беременной женщины, и предварительно определенный диапазон составляет от 185 п.о. до 204 п.о. Следовательно, фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть определена точно на основе предварительно определенного диапазона. В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная функция представляет собой d=0,0334*p+1,6657, где d представляет собой фракцию внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот, и p представляет собой процент внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне. Фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть эффективно определена на основе предварительно определенной функции, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец периферической крови, полученный от беременной женщины, в котором известна фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот. Следовательно, предварительно определенный диапазон определяется точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец периферической крови, полученный от женщины, беременной нормальным плодом мужского пола, в котором фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот известна как определяемая хромосомой Y. Следовательно, предварительно определенный диапазон определяется точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения фракция внеклеточных нуклеиновых кислот в контрольном образце представляет собой фракцию фетальной внеклеточной ДНК, которая определяется хромосомой Y. Следовательно, предварительно определенный диапазон может быть определен путем эффективного использования фракции внеклеточных нуклеиновых кислот контрольного образца, и затем количество внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, и фракция фетальной внеклеточной ДНК в образце, полученном от обследуемой беременной женщины, могут быть дополнительно определены.

Во втором аспекте в настоящем изобретении дополнительно предлагается устройство для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце. В вариантах осуществления настоящего изобретения устройство включает: секвенатор с конфигурацией для секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в биологическом образце, так чтобы получать результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования; прибор для подсчета, связанный с секвенатором, и с конфигурацией для определения количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, в биологическом образце, на основе результата секвенирования; и прибор для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот, связанный с прибором для подсчета, и с конфигурацией для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце, на основе количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон. Изобретатели неожиданно обнаружили, что устройство по настоящему изобретению подходит для осуществления способа определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце, описанной в настоящем документе выше, с помощью которого может быть точно и эффективно определена фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце, особенно фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или фракция внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих от опухоли, в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, предположительно страдающего опухолевым процессом, или подвергаемого обследованию на предмет опухоли.

В вариантах осуществления настоящего изобретения биологический образец представляет собой образец периферической крови.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточная нуклеиновая кислота из предварительно определенного источника выбрана из одного из следующего: внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот или материнских внеклеточных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих из опухоли, или внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих не из опухоли, в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, предположительно страдающего опухолевым процессом, или подвергаемого обследованию на предмет опухоли. Следовательно, фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или фракция внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих из опухоли, в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, может быть легко определена.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновые кислоты представляют собой ДНК.

В вариантах осуществления настоящего изобретения результат секвенирования включает длины внеклеточных нуклеиновых кислот.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточные нуклеиновые кислоты в биологическом образце секвенируются с помощью секвенирования спаренных концов, секвенирования единичных концов или секвенирования единичных молекул. Следовательно, длины внеклеточных нуклеиновых кислот могут быть легко получены, что способствует последующим стадиям.

В вариантах осуществления настоящего изобретения прибор для подсчета дополнительно включает: блок для выравнивания с конфигурацией для выравнивания результата секвенирования относительно референсного генома так, чтобы создать массив данных, состоящий из множества уникально картированных считываний, где каждое считывание в массиве данных может быть картировано только по положению в референсном геноме; первый блок, определяющий длину, связанный с блоком для выравнивания с конфигурацией для определения длины внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующей каждому уникально картированному считыванию в массиве данных; и блок, определяющий количество, связанный с первым блоком, определяющим длину, с конфигурацией для определения количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон. Следовательно, количество внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, в биологическом образце может быть легко определено, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первый прибор для определения длины оснащен для определения длины каждого считывания, уникально картированного относительно референсного генома, как длины внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующей каждому считыванию. Следовательно, длина внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующая каждому уникально картированному считыванию в массиве данных, может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения в случае, когда внеклеточные нуклеиновые кислоты в биологическом образце секвенируются с помощью секвенирования спаренных концов, первый блок для определения длины дополнительно включает: модуль для определения положения 5'-конца с конфигурацией для определения положения 5'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты в соответствии с референсным геномом на основе данных секвенирования на одном конце каждого уникально картированного считывания, полученного при секвенировании спаренных концов; модуль для определения положения 3'-конца, связанный с модулем для определения положения 5'-конца, и с конфигурацией для определения положения 3'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты в соответствии с референсным геномом на основе данных секвенирования на другом конце того же уникально картированного считывания, полученного при секвенировании спаренных концов; и модуль расчета длины, связанный с модулем для определения положения 3'-конца, и с конфигурацией для определения длины внеклеточной нуклеиновой кислоты на основе положения 5'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты и положения 3'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты. Следовательно, длина внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующая каждому уникально картированному считыванию в массиве данных, может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения устройство дополнительно включает прибор, определяющий предварительно определенный диапазон, с конфигурацией для определения предварительно определенного диапазона на основе множества контрольных образцов, в каждом из которых известна фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника, необязательно предварительно определенный диапазон определяется на основе, по меньшей мере, 20 контрольных образцов.

В вариантах осуществления настоящего изобретения прибор, определяющий предварительно определенный диапазон, дополнительно включает: второй блок, определяющий длину, с конфигурацией для определения длин внеклеточных нуклеиновых кислот в множестве контрольных образцов; первый блок, определяющий процент, связанный со вторым блоком, определяющим длину, и с конфигурацией для установления множества кандидатных диапазонов длины и определения процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученного от каждого из множества контрольных образцов, присутствующих в каждом кандидатном диапазоне длин; блок, определяющий коэффициент корреляции, связанный с первым блоком, определяющим процент, и оснащенный для определения коэффициента корреляции между каждым кандидатным диапазоном длины и фракцией внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника на основе процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученного от каждого из множества контрольных образцов, присутствующих в каждом кандидатном диапазоне длины, и фракцией внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в контрольных образцах; и блок, определяющий предварительно определенный диапазон, связанный с блоком, определяющим коэффициент корреляции, и с конфигурацией для выбора кандидатного диапазона длины с наибольшим коэффициентом корреляции как предварительно определенного диапазона. Следовательно, предварительно определенный диапазон может быть определен точно и эффективно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения кандидатный диапазон длины составляет интервал от 1 п.о. до 20 п.о.

В вариантах осуществления настоящего изобретения множество кандидатных диапазонов длины имеет размер шага от 1 п.о. до 2 п.о.

В вариантах осуществления настоящего изобретения прибор для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот дополнительно включает: второй блок, определяющий процент, с конфигурацией для определения процента внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, на основе количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон; и блок для расчета фракции внеклеточных нуклеиновых кислот, связанный со вторым блоком, определяющим процент, и с конфигурацией для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце на основе процента внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, в соответствии с предварительно определенной функцией, где предварительно определенная функция определяется на основе множества контрольных образцов. Следовательно, фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть определена эффективно, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения устройство дополнительно включает прибор, определяющий предварительно определенную функцию, который включает: третий блок, определяющий процент, с конфигурацией для определения процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующих в предварительно определенном диапазоне; и блок выравнивания, связанный с третьим блоком, определяющим процент, с конфигурацией для выравнивания процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующего в предварительно определенном диапазоне, с известной фракцией внеклеточной нуклеиновой кислоты из предварительно определенного источника для определения предварительно определенной функции. Следовательно, предварительно определенная функция может быть определена точно и эффективно, что способствует проведению последующих стадий.

В вариантах осуществления настоящего изобретения процент внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, выравнивается с известной фракцией внеклеточной нуклеиновой кислоты из предварительно определенного источника с помощью линейного выравнивания.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточная нуклеиновая кислота из предварительно определенного источника представляет собой фетальную внеклеточную нуклеиновую кислоту, полученную из образца периферической крови беременной женщины, и предварительно определенный диапазон составляет от 185 п.о. до 204 п.о. Следовательно, фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть определена точно на основе предварительно определенного диапазона.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная функция представляет собой d=0,0334*p+1,6657, где d представляет собой фракцию внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот, и p представляет собой процент внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне. Фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть эффективно определена на основе предварительно определенной функции, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец периферической крови, полученный от беременной женщины, в котором известна фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот.

В вариантах осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец периферической крови, полученный от женщины, беременной нормальным плодом мужского пола, в котором фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот известна как определяемая хромосомой Y. Следовательно, предварительно определенный диапазон определяется точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения фракция внеклеточных нуклеиновых кислот в контрольном образце представляет собой фракцию фетальной внеклеточной ДНК, которая определяется устройством, подходящим для определения хромосомы Y. Следовательно, предварительно определенный диапазон может быть определен путем эффективного использования фракции внеклеточных нуклеиновых кислот контрольного образца, и затем количество внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, и фракция фетальной внеклеточной ДНК в образце, полученном от беременной женщины для определения, могут быть дополнительно определены.

Следует отметить, что способ и устройство для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце в соответствии с настоящим изобретением имеют, по меньшей мере, следующие преимущества:

1) Универсальность: могут быть определены внеклеточные фетальные (в особенности плода женского пола) фракции ДНК во всех образцах, удовлетворяющих контролю качества.

2) Точность определения NIPT может быть улучшена.

3) Простота исполнения: фракции внеклеточной фетальной ДНК могут быть определены прямо, просто используя автономные данные.

В третьем аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения различия полов близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает: осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования; определение первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования с помощью способа, описанного в настоящем документе выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце; определение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, полученных для хромосомы Y по результатам секвенирования; и определение различия полов близнецов на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и второй фракции внеклеточной фетальной ДНК. Изобретатели неожиданно обнаружили, что различие полов близнецов у беременной женщины может быть точно и эффективно определено с помощью способа по настоящему изобретению.

В вариантах осуществления настоящего изобретения вторая фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется по следующей формуле:

fra.chry=(chry.ER%-Female.chry.ER%)/(Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%,

где fra.chry представляет собой вторую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от здорового мужчины относительно суммарных данных этого секвенирования.

Следовательно, вторая фракция внеклеточной фетальной ДНК может быть определена точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения определение различия полов близнецов, основанное на первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и на второй фракции внеклеточной фетальной ДНК дополнительно включает: (a) определение отношения второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и (b) определение различия полов близнецов путем сравнения отношения, определенного в (a), с предварительно определенными первым порогом и вторым порогом. Следовательно, различие полов близнецов может быть определено эффективно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первый порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами женского пола, и второй порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами мужского пола.

В вариантах осуществления настоящего изобретения оба плода близнецов являются плодами женского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем первый порог, оба плода близнецов являются плодами мужского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем второй порог, и близнецы включают плод мужского пола и плод женского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК равно первому порогу или второму порогу, или между первым порогом и вторым порогом.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первый порог составляет 0,35, и второй порог составляет 0,7.

В четвертом аспекте в настоящем изобретении предлагается система определения различия полов близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения система включает:

устройство, определяющее первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, представляющее собой устройство, представленное в настоящем описании выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце с конфигурацией для осуществления секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования, и с конфигурацией для определения первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования;

устройство, определяющее вторую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, с конфигурацией для определения второй фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, по результатам секвенирования; и

устройство, определяющее различия полов, с конфигурацией для определения различия полов близнецов на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и второй фракции внеклеточной фетальной ДНК.

Изобретатели неожиданно обнаружили, что различие полов близнецов у беременной женщины может быть точно и эффективно определено с помощью системы по настоящему изобретению.

В вариантах осуществления настоящего изобретения вторая фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется в соответствии со следующей формулой:

fra.chry=(chry.ER%-Female.chry.ER%)/(Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%,

где fra.chry представляет собой вторую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от здорового мужчины относительно суммарных данных этого секвенирования. Следовательно, вторая фракция внеклеточной фетальной ДНК может быть определена точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения устройство для определения различия полов дополнительно включает: блок для определения отношения с конфигурацией для определения отношения второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и блок сравнения с конфигурацией для сравнения отношения, определенного с помощью блока для определения отношения, с предварительно определенными первым порогом и вторым порогом, так чтобы определить половые различия близнецов. Следовательно, различие полов близнецов может быть эффективно определено.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первый порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами женского пола, и второй порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами мужского пола.

В вариантах осуществления настоящего изобретения оба плода близнецов являются плодами женского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем первый порог, оба плода близнецов являются плодами мужского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем второй порог, и близнецы включают плод мужского пола и плод женского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК равно первому порогу или второму порогу, или между первым порогом и вторым порогом.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первый порог составляет 0,35, и второй порог составляет 0,7.

В пятом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения хромосомной анеуплоидии близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает:

осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования;

определение первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования с помощью способа, описанного в настоящем документе выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце;

определение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы по результатам секвенирования; и

определение того, имеют ли обследуемые близнецы анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК.

Следовательно, хромосомная анеуплоидия близнецов может быть точно и эффективно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третья фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется в соответствии со следующей формулой:

fra.chri=2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, где fra.chri представляет собой третью фракцию внеклеточной фетальной ДНК, i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы. и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22; chri.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; adjust.chri.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для предварительно определенной хромосомы, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальными близнецами, относительно суммарных данных этого секвенирования.

Следовательно, третья фракция внеклеточной фетальной ДНК может быть определена точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения определение того, имеют ли обследуемые близнецы анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, основанное на первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и на третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК дополнительно включает: (a) определение отношения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и (b) определение того, имеют ли обследуемые близнецы анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, путем сравнения отношения, определенного в (a), с предварительно определенными третьим порогом и четвертым порогом. Следовательно, хромосомная анеуплоидия близнецов может быть эффективно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третий порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами, не имеющими анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, и четвертый порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами, имеющими анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы.

В вариантах осуществления настоящего изобретения оба плода близнецов не имеют анеуплоидии в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем третий порог, оба плода близнецов имеют анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем четвертый порог, и один из плодов близнецов имеет анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, тогда как другой плод близнецов не имеет анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК равно третьему порогу или четвертому порогу, или между третьим порогом и четвертым порогом.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третий порог составляет 0,35, и четвертый порог составляет 0,7.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная хромосома представляет собой, по меньшей мере, одну из хромосом, выбранных из хромосом 18, 21 и 23.

В шестом аспекте в настоящем изобретении предлагается система определения хромосомной анеуплоидии у близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения система включает:

устройство для определения первой фракции внеклеточной фетальной ДНК, представляющее собой устройство, представленное выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце с конфигурацией для осуществления секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования, и с конфигурацией для определения первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования;

устройство для определения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК с конфигурацией для определения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы по результатам секвенирования; и

первое устройство, определяющее анеуплоидию, с конфигурацией для определения того, имеют ли обследуемые близнецы анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК. Изобретатели неожиданно обнаружили, что хромосомная анеуплоидия у близнецов может быть точно и эффективно определена с помощью системы по настоящему изобретению.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третья фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется в соответствии со следующей формулой:

fra.chri=2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, где fra.chri представляет собой третью фракцию внеклеточной фетальной ДНК, i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22; chri.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; adjust.chri.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для предварительно определенной хромосомы, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальными близнецами, относительно суммарных данных этого секвенирования. Следовательно, третья фракция внеклеточной фетальной ДНК может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первое устройство для определения анеуплоидии дополнительно включает:

блок для определения отношения с конфигурацией для определения отношения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и

блок сравнения с конфигурацией для сравнения отношения, определенного с помощью блока для определения отношения, с предварительно определенными третьим порогом и четвертым порогом, так, чтобы определить имеют ли обследуемые близнецы анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы. Следовательно, хромосомная анеуплоидия у близнецов может быть эффективно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третий порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами, не имеющими анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, и четвертый порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами, имеющими анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы.

В вариантах осуществления настоящего изобретения оба плода близнецов не имеют анеуплоидии в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем третий порог, оба плода близнецов имеют анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем четвертый порог, и один из плодов близнецов имеет анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, тогда как другой плод близнецов не имеет анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК равно третьему порогу или четвертому порогу, или между третьим порогом и четвертым порогом. Следовательно, хромосомная анеуплоидия у близнецов может быть эффективно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третий порог составляет 0,35, и четвертый порог составляет 0,7.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная хромосома представляет собой, по меньшей мере, одну из хромосом, выбранных из хромосом 18, 21 и 23.

В седьмом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения хромосомной анеуплоидии у близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает:

осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования;

определение фракции xi ряда данных секвенирования, полученных для хромосомы i в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования, где i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22;

определение показателя T хромосомы i в соответствии с Ti=(xiii, где i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, μi представляет собой средний процент данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных ее секвенирования, σi представляет собой стандартное отклонение процентов данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных ее секвенирования,

определение показателя L хромосомы i в соответствии с Li=log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), где i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, T2i=(xii*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) и (d(T2i,a) представляют собой функцию t плотности распределения вероятностей, где a представляет собой степень свободы, fra представляет собой первую фракцию внеклеточной, фетальной ДНК, определенную с помощью способа, представленного в настоящем описании выше для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце, или фетальную фракцию, определенную для хромосомы Y (fra.chr.Y%), fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где fra.chry представляет собой фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно указанных суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от предварительно определенного здорового мужчины относительно суммарных данных этого секвенирования;

построение четырехквадрантной диаграммы с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью первой прямой линии, где T=предварительно определенный пятый порог, и второй прямой линии, где L=предварительно определенный шестой порог, где оба плода близнецов рассматриваются как имеющие трисомию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в первый квадрант; один из плодов близнецов рассматривается как имеющий трисомию, а другой из плодов близнецов рассматривается как нормальный, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий во второй квадрант; оба плода близнецов рассматриваются как нормальные, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в третий квадрант; близнецы определяются как имеющие низкую фетальную фракцию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в четвертый квадрант, такой результат не принимается. Изобретатели неожиданно обнаружили, что определение хромосомной анеуплоидии у близнецов у беременной женщины и определение того, будет ли у обследуемых близнецов определена анеуплоидия в отношении предварительно определенной хромосомы, может быть достигнуто точно и эффективно с помощью способа определения хромосомной анеуплоидии у близнецов в соответствии с настоящим изобретением.

В восьмом аспекте в настоящем изобретении предлагается система определения хромосомной анеуплоидии у близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения система включает:

устройство для определения величины xi в конфигурации для секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования, и с конфигурацией для определения фракции xi ряда данных секвенирования, полученных для хромосомы i в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования, где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22;

устройство для определения показателя T с конфигурацией для определения показателя T хромосомы i в соответствии с Ti=(xiii, где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, μi представляет собой средний процент данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных секвенирования, σi представляет собой стандартное отклонение процентов данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных секвенирования,

устройство для определения показателя L с конфигурацией для определения показателя L хромосомы i в соответствии с Li=log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, T2i=(xii*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) и (d(T2i,a) представляют собой функцию t плотности распределения вероятностей, где a представляет собой степень свободы, fra представляет собой фракцию внеклеточной, фетальной ДНК, определенную с помощью способа, представленного в настоящем описании выше, или фетальную фракцию, определенную для хромосомы Y (fra.chr.Y%),

fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где fra.chry представляет собой фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно указанных суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от предварительно определенного здорового мужчины относительно суммарных данных этого секвенирования;

второе устройство для определения анеуплоидии с конфигурацией для построения четырехквадрантной диаграммы с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью первой прямой линии, где T=предварительно определенный пятый порог, и второй прямой линии, где L=предварительно определенный шестой порог,

где оба плода близнецов рассматриваются как имеющие трисомию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в первый квадрант; один из плодов близнецов рассматривается как имеющий трисомию, а другой из плодов близнецов рассматривается как нормальный, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий во второй квадрант; оба плода близнецов рассматриваются как нормальные, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в третий квадрант; близнецы определяются как имеющие низкую фетальную фракцию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в четвертый квадрант, такой результат не принимается. Изобретатели неожиданно обнаружили, что определение хромосомной анеуплоидии у близнецов у беременной женщины и определение того, будет ли у обследуемых близнецов определена анеуплоидия в отношении предварительно определенной хромосомы, может быть достигнуто точно и эффективно с помощью системы определения хромосомной анеуплоидии у близнецов в соответствии с настоящим изобретением.

В девятом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения химерного плода. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает:

осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной плодом, необязательно плодом мужского пола, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования;

определение первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования с помощью способа, представленного в настоящем описании выше, или определение фетальной фракции хромосомы Y (fra.chrY%) в качестве первой фракции внеклеточной фетальной ДНК в соответствии со следующей формулой:

fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где fra.chry представляет собой первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от предварительно определенного здорового мужчины относительно суммарных данных этого секвенирования;

определение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы, в результатах секвенирования; и

определение того, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении предварительно определенной хромосомы на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК.

Следовательно, может быть точно проанализировано, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы.

В вариантах осуществления настоящего изобретения способ может дополнительно иметь следующие дополнительные технические характеристики:

В вариантах осуществления настоящего изобретения третья фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется следующей формулой:

fra.chri=2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, где fra.chri представляет собой третью фракцию внеклеточной фетальной ДНК, i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22; chri.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования; adjust.chri.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для предварительно определенной хромосомы, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом, относительно суммарных данных этого секвенирования. Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В вариантах осуществления настоящего изобретения определение того, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении предварительно определенной хромосомы, основанное на первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и на третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК дополнительно включает: (a) определение отношения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и (b) определение того, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении предварительно определенной хромосомы, путем сравнения отношения, определенного в (a), с множеством предварительно определенных порогов. Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы, может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В вариантах осуществления настоящего изобретения множество предварительно определенных порогов включает, по меньшей мере один, выбранный из:

седьмого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является полной моносомой,

восьмого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является моносомной химерой,

девятого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является нормальной,

десятого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является полностью трисомной.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная хромосома обследуемого плода является полной моносомой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем седьмой порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является моносомной химерой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК не ниже, чем седьмой порог, и не выше чем восьмой порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является нормальной, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем восьмой порог и ниже чем девятый порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является трисомной химерой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК не ниже, чем девятый порог и не выше, чем десятый порог; и

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является полной трисомой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем десятый порог.

В вариантах осуществления настоящего изобретения седьмой порог составляет, по меньшей мере, -1 и ниже 0, необязательно равен -0,85;

восьмой порог выше, чем седьмой порог и ниже 0, необязательно равен -0,3;

девятый порог выше 0 и ниже 1, необязательно равен 0,3;

десятый порог выше, чем девятый порог и ниже 1, необязательно равен 0,85. Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы, может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В десятом аспекте в настоящем изобретении предлагается система определения химерного плода. В вариантах осуществления настоящего изобретения система включает:

устройство, определяющее первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, представляющее собой устройство, представленное выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце с конфигурацией для осуществления секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной плодом, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования, и с конфигурацией для определения первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, или с конфигурацией для определения фетальной фракции хромосомы Y (fra.chrY%) в качестве первой фракции внеклеточной фетальной ДНК в соответствии со следующей формулой:

fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где fra.chry представляет собой первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от предварительно определенного здорового мужчины относительно суммарных данных этого секвенирования;

устройство, определяющее третью фракцию внеклеточной фетальной ДНК, с конфигурацией для определения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе результатов секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы в результатах секвенирования; и

устройство, определяющее химеру, с конфигурацией для определения того, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении предварительно определенной хромосомы, на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и третей фракции внеклеточной фетальной ДНК.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ, представленный в настоящем документе выше, для определения химерного плода может быть эффективно осуществлен с помощью системы, представленной в настоящем документе выше, так что будет ли обследуемый плод являться химерным плодом, может быть эффективно проанализировано.

В вариантах осуществления настоящего изобретения система, представленная выше для определения химерного плода, может дополнительно включать следующие дополнительные технические характеристики:

В вариантах осуществления настоящего изобретения третья фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется следующей формулой:

fra.chri=2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, где fra.chri представляет собой третью фракцию внеклеточной фетальной ДНК, i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22; chri.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования; adjust.chri.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для предварительно определенной хромосомы, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом, относительно суммарных данных этого секвенирования. Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы, может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В вариантах осуществления настоящего изобретения устройство для определения химеры включает:

блок для определения отношения с конфигурацией для определения отношения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и

блок сравнения с конфигурацией для сравнения отношения, определенного с помощью блока для определения отношения, с множеством предварительно определенных порогов, так чтобы определить будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении предварительно определенной хромосомы.

В вариантах осуществления настоящего изобретения множество предварительно определенных порогов включает, по меньшей мере, один, выбранный из:

седьмого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является полной моносомой,

восьмого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является моносомной химерой,

девятого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является нормальной,

десятого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является полностью трисомной.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная хромосома обследуемого плода является полной моносомой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем седьмой порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является моносомной химерой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК не ниже, чем седьмой порог, и не выше чем восьмой порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является нормальной, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем восьмой порог и ниже, чем девятый порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является трисомной химерой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК не ниже, чем девятый порог и не выше, чем десятый порог; и

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является полной трисомой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем десятый порог.

В вариантах осуществления настоящего изобретения седьмой порог выше -1 и ниже 0, необязательно равен -0,85;

восьмой порог выше, чем седьмой порог и ниже 0, необязательно равен -0,3;

девятый порог выше 0 и ниже 1, необязательно равен 0,3;

десятый порог выше, чем девятый порог и ниже 1, необязательно равен 0,85.

Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы, может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В одиннадцатом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения химерного плода. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает:

осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной плодом, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования;

определение фракции xi ряда данных секвенирования, полученных для хромосомы i в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования, где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22;

определение показателя T хромосомы i в соответствии с Ti=(xiii, где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, μi представляет собой среднюю величину процентов данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных этого секвенирования, σi представляет собой стандартное отклонение процентов данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных ее секвенирования;

определение показателя L хромосомы i в соответствии с Li=log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, T2i=(xii*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) и (d(T2i,a) представляют собой функцию t плотности распределения вероятностей, где a представляет собой степень свободы, fra представляет собой фракцию внеклеточной фетальной ДНК, определенную с помощью способа, представленного в настоящем описании выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце;

построение четырехквадрантной диаграммы с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью третьей прямой линии, где T=предварительно определенный одиннадцатый порог, и четвертой прямой линии, где L=предварительно определенный двенадцатый порог, где показатель T не выше 0,

где плод рассматривается как имеющий полную моносому или моносомную химеру в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в первый квадрант;

плод рассматривается как имеющий моносомную химеру в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий во второй квадрант;

плод рассматривается как нормальный в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в третий квадрант;

плод рассматривается как имеющий низкую фетальную фракцию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в четвертый квадрант, такой результат не принимается,

построение четырехквадрантной диаграммы с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью пятой прямой линии, где T=предварительно определенный тринадцатый порог, и шестой прямой линии, где L=предварительно определенный четырнадцатый порог, где показатель T выше 0,

где плод рассматривается как имеющий полную трисомию или трисомную химеру в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в первый квадрант;

плод рассматривается как имеющий трисомную химеру в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий во второй квадрант;

плод рассматривается как нормальный в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в третий квадрант;

плод рассматривается как имеющий низкую фетальную фракцию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в четвертый квадрант, такой результат не принимается,

необязательно одиннадцатый порог и тринадцатый порог каждый независимо равен 3, и двенадцатый порог и четырнадцатый порог каждый независимо равен 1.

Следовательно, ситуации с химерным плодом могут быть эффективно проанализированы.

Дополнительные аспекты и преимущества вариантов осуществления настоящего изобретения будут даны кроме того в последующих описаниях, станут кроме того очевидны из последующих описаний или будут усвоены из практики осуществления вариантов настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Эти и другие аспекты и преимущества вариантов осуществления настоящего изобретения будут понятны и более легко восприняты из последующих описаний, сделанных со ссылкой на фигуры, в которых:

Фиг. 1 представляет собой схему последовательности осуществления способа определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 2 представляет собой схему последовательности осуществления способа определения количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 3 представляет собой схему последовательности осуществления способа определения длины внеклеточной нуклеиновой кислоты в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 4 представляет собой схему последовательности осуществления способа определения предварительно определенного диапазона в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 5 представляет собой схему последовательности осуществления способа определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 6 представляет собой схему последовательности осуществления способа определения предварительно определенной функции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 7 представляет собой структурную диаграмму устройства для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 8 представляет собой структурную диаграмму прибора для подсчета в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 9 представляет собой структурную диаграмму первого блока для определения длины в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 10 представляет собой структурную диаграмму прибора для определения предварительно определенного диапазона в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 11 представляет собой структурную диаграмму прибора для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 12 представляет собой структурную диаграмму прибора для определения предварительно определенной функции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 13 представляет собой линейную диаграмму подбора коэффициента корреляции между фракцией внеклеточной фетальной ДНК, определяемой хромосомой Y, и процентом молекул ДНК, присутствующих в диапазоне 185 п.о.-204 п.о. для каждого образца полученного от 37 беременных женщин, известных как беременные нормальным плодом мужского пола, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; и

Фиг. 14-16 представляют собой четырехквадрантные диаграммы показателей L и показателей L 11 исследуемых образцов в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Варианты осуществления настоящего изобретения будут подробно описаны ниже, эти варианты приведены в качестве примеров, иллюстраций и используются для общего объяснения настоящего раскрытия, следовательно, не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение.

Способ определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце

В соответствии с вариантами осуществления первого аспекта настоящего изобретения предлагается способ определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце. Изобретатели неожиданно нашли, что фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце, особенно фракция фетальных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или фракция нуклеиновых кислот, происходящих из опухоли, в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, может быть точно и эффективно определена с помощью способа по настоящему изобретению.

Следует отметить, что выражение «фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце», используемое в настоящем описании, относится к фракции количества внеклеточных нуклеиновых кислот из конкретного источника относительно суммарного количества внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце. Например, если биологический образец представляет собой периферическую кровь, полученную от беременной женщины, внеклеточные нуклеиновые кислоты из предварительно определенного источника представляют собой внеклеточные фетальные нуклеиновые кислоты, «фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце», т.е. фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот, представляет собой фракцию количества внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот относительно суммарного количества внеклеточных нуклеиновых кислот в периферической крови, полученной от беременной женщины, что иногда также может обозначаться как «фракция внеклеточной фетальной ДНК в периферической крови, полученной от беременной женщины» или фракция внеклеточной фетальной ДНК. В качестве другого примера, если биологический образец представляет собой образец периферической крови, полученный от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, предположительно страдающего опухолевым процессом, или подвергаемого обследованию на предмет опухоли, внеклеточные нуклеиновые кислоты из предварительно определенного источника представляют собой внеклеточные нуклеиновые кислоты, происходящие из опухоли, «фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце», т.е. фракция внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих из опухоли, обозначает фракцию количества внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих из опухоли, относительно суммарного количества внеклеточных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, предположительно страдающего опухолевым процессом, или подвергаемого обследованию на предмет опухоли. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения и со ссылкой на фиг. 1 способ вклчает следующие стадии.

S100: секвенирование нуклеиновых кислот

Внеклеточные нуклеиновые кислоты в биологическом образце секвенируют так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования.

В вариантах осуществления настоящего изобретения биологический образец представляет собой образец периферической крови. В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточная нуклеиновая кислота из предварительно определенного источника представляет собой внеклеточные фетальные нуклеиновые кислоты в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или происходящие из опухоли внеклеточные нуклеиновые кислоты. Следовательно, фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или фракция происходящих из опухоли внеклеточных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, предположительно страдающего опухолевым процессом, или подвергаемого обследованию на предмет опухоли, может быть легко определена. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточные нуклеиновые кислоты представляют собой ДНК. Следует отметить, что термин «данные секвенирования» используемый в настоящем описании, относится к «считываниям данных секвенирования», которые соответствуют нуклеиновым кислотам, подвергаемым секвенированию.

В вариантах осуществления настоящего изобретения результат секвенирования включает длины внеклеточных нуклеиновых кислот.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточные нуклеиновые кислоты в биологическом образце секвенируются с помощью секвенирования спаренных концов, секвенирования единичных концов или секвенирования единичных молекул. Следовательно, длины внеклеточных нуклеиновых кислот могут быть легко получены, что способствует последующим стадиям.

S200: определение количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон

Количество внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, в биологическом образце определяют на основе результата секвенирования.

Следует отметить, что термин «длина», используемый в настоящем описании, относится к «длине нуклеиновой кислоты (считывания)» в парах оснований (п.о.).

В вариантах осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фиг. 2 S200 дополнительно включает следующие стадии:

S210: результат секвенирования выравнивают относительно референсного генома. Конкретно результат секвенирования выравнивают относительно референсного генома так, чтобы создать массив данных, состоящий из множества уникально картированных считываний, где каждое считывание в массиве данных может быть картировано только по положению в референсном геноме; предпочтительно не получают неправильно картированного считывания, или получают самое большее одно неправильно картированное считывание или самое большее два неправильно картированных считывания.

S220: определяют длинау внеклеточной нуклеиновой кислоты. Конкретно, определяется длина внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующая каждому уникально картированному считыванию в массивах данных.

S230: определяют количество внеклеточных нуклеиновых кислот, попадающих в предварительно определенный диапазон. Конкретно определяют количество внеклеточных нуклеиновых кислот, с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон.

Следовательно, количество внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, в биологическом образце может быть легко определено, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения в S220 длину каждого считывания уникально картированного относительно референсного генома определяют как длину внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующей считыванию. Следовательно, длина внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующая каждому уникально картированному считыванию, в массиве данных может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения в случае, когда внеклеточные нуклеиновые кислоты в биологическом образце секвенируются с помощью секвенирования спаренных концов со ссылкой на фиг. 3, S220 включает следующие стадии.

S2210: определение положения в соответствии с референсным геномом 5'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты. Конкретно оно определяется как положение в соответствии с референсным геномом 5'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты на основе данных секвенирования на одном конце каждого уникально картированного считывания, полученного при секвенировании спаренных концов.

S2220: определение положения в соответствии с референсным геномом 3'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты. Конкретно оно определяется как положение в соответствии с референсным геномом 3'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты на основе данных секвенирования на другом конце того же уникально картированного считывания, полученного при секвенировании спаренных концов.

S2230: определение длины внеклеточной нуклеиновой кислоты. Конкретно длина внеклеточной нуклеиновой кислоты определяется на основе положения 5'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты и положения 3'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты.

Следовательно, длина внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующая каждому уникально выровненному считыванию, в массиве данных может быть точно определена.

S300: определение фракции внеклеточных нуклеиновых кислот

Фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце определяется на основе количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной попадающей в предварительно определенный диапазон.

Кроме того способ по настоящему изобретению дополнительно включает определение предварительно определенного диапазона (S400, не показано на фигурах). В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенный диапазон определяется на основе множества контрольных образцов, в каждом из которых известна фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника. Следовательно, предварительно определенный диапазон может быть определен с точным и надежным результатом. В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенный диапазон определяется на основе, по меньшей мере, 20 контрольных образцов.

В вариантах осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фиг. 4 S400 включает следующие стадии.

S410: определение длин внеклеточных нуклеиновых кислот во множестве контрольных образцов.

S420: определение процента внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в каждом кандидатном диапазоне длины. Конкретно устанавливается множество кандидатных диапазонов длины и определяется процент внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных от каждого из множеств контрольных образцов, присутствующих в каждом кандидатном диапазоне длины.

S430: определение коэффициент корреляции. Конкретно определяется коэффициент корреляции между каждым кандидатным диапазоном длины и фракцией внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника на основе процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных от каждого из множеств контрольных образцов, представленного в каждом кандидатном диапазоне длины, и фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в контрольных образцах; и

S440: определение предварительно определенного диапазона. Конкретно определяется кандидатный диапазон длины с наибольшим коэффициентом корреляции как предварительно определенный диапазон.

Следовательно, предварительно определенный диапазон может быть определен точно и эффективно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения кандидатный диапазон длины составляет интервал от 1 п.о. до 20 п.о.

В вариантах осуществления настоящего изобретения множество кандидатных диапазонов длины составляет размер шага от 1 п.о. до 2 п.о.

В вариантах осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фиг. 5 S300 дополнительно включает следующие стадии:

S310: определение процента внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне. Конкретно процент внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, определяется на основе количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон.

S320: определение фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце. Конкретно фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце определяется на основе процента внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, в соответствии с предварительно определенной функцией, где предварительно определенная функция определяется на основе множества контрольных образцов.

Следовательно, фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть определена эффективно, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает определение предварительно определенной функции (S500, на фигурах не показано).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фиг. 6 S500 включает следующие стадии.

S510: определение процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующих в предварительно определенном диапазоне.

S520: процент внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, выравнивается с известной фракцией внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника для определения предварительно определенной функции.

Следовательно, предварительно определенная функция может быть определена точно и эффективно, что способствует проведению последующих стадий.

В вариантах осуществления настоящего изобретения процент внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, выравнивается с известной фракцией внеклеточной нуклеиновой кислоты из предварительно определенного источника с помощью линейного выравнивания.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточная нуклеиновая кислота из предварительно определенного источника представляет собой внеклеточную фетальную нуклеиновую кислоту, полученную из образца периферической крови беременной женщины, и предварительно определенный диапазон составляет от 185 п.о. до 204 п.о. Следовательно, фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть определена точно на основе предварительно определенного диапазона.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная функция представляет собой d=0,0334*p+1,6657, где d представляет собой фракцию внеклеточных нуклеиновых кислот, и p представляет собой процент внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне. Фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть эффективно определена на основе предварительно определенной функции, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

Следует отметить, что выражение «процент внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне», относится к процентному количеству внеклеточных нуклеиновых кислот, распределенных в конкретном предварительно определенном диапазоне длины, относительно суммарного количества внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце.

В вариантах осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец периферической крови, полученный от беременной женщины, в котором известна фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот. Следовательно, предварительно определенный диапазон определяется точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец периферической крови, полученный от женщины, беременной нормальным плодом мужского пола, в котором фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот известна как определяемая хромосомой Y. Следовательно, предварительно определенный диапазон определяется точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец периферической крови, полученный от женщины, беременной нормальным плодом. Следовательно, предварительно определенный диапазон определяется точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения фракция внеклеточных нуклеиновых кислот в контрольном образце представляет собой фракцию внеклеточной фетальной ДНК, которая определяется хромосомой Y. Следовательно, предварительно определенный диапазон может быть определен путем эффективного использования фракции внеклеточных нуклеиновых кислот контрольного образца, и затем количество внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, и фракция внеклеточной фетальной ДНК в образце, полученном от обследуемой беременной женщины, могут быть дополнительно определены.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения способ может дополнительно включать следующие стадии.

1) Полное секвенирование генома (WGS): определяемый образец подвергают полному геномному секвенированию с использованием высокопроизводительной платформы. Внеклеточные фетальные ДНК плазмы, которые являются относительно короткими и в которых только небольшое количество превышает 300 п.о. в длину, секвенируют с помощью секвенирования единичных концов или секвенирования спаренных концов пока не получают длины всех необходимых внеклеточных фетальных ДНК, и необходимо секвенировать всю молекулу внеклеточной ДНК, если используется секвенирование единичных концов.

2) Получение уникально картированных считываний: считывания тестируемого образца выравниваются относительно последовательности референсного генома.

3) Получение длины ДНК, соответствующей каждому уникально картированному считыванию, на основе информации о выравнивании каждого уникально картированного считывания.

4) Получение одного или более диапазонов с высокой корреляцией: один или более диапазонов с ваысокой корреляцией выбирают в соответствии с распределением длин молекул ДНК.

5) Получение формулы функции: ее получают как формулу функции между процентом ДНК, присутствующим в одном или более диапазоне с высокой корреляцией, полученной в 4), и известной фракцией внеклеточной фетальной ДНК.

6) Получение процента ДНК, присутствующих в одном или более выбранных диапазонах, т.е. процента ДНК, присутствующих в одном или более диапазонах длины.

7) Получение фракции внеклеточной фетальной ДНК исследуемого образца на основе формулы функции и процента ДНК в исследуемом образце, присутствующей в одном или более диапазонах длины.

Конкретно стадия 4) включает следующие этапы:

I. Выбор контрольного образца, т.е. образца, в котором известна фракция внеклеточной фетальной ДНК.

II. Все образцы подвергают секвенированию WGS, и получают информацию о длинах молекул ДНК, представленных каждым уникально выровненным считыванием, с помощью информации об уникальном выравнивании, полученной путем уникального выравнивания считываний относительно хромосомы.

III. Количество молекул ДНК с длиной, выбранной от 0 п.о. до M п.о. (M представляет собой величину максимальной длины, внеклеточная молекула ДНК может иметь длину до 400 п.о.), получают для всех контрольных образцов.

IV. Множество диапазонов окон (диапазонов длин) получают путем движения окна с определенной протяженностью окна с конкретным размером шага, рассчитывают процент молекул ДНК, присутствующих в каждом диапазоне окон, т.е. процент молекул ДНК, присутствующих в каждом диапазоне длины. Следует отметить, что количество молекул ДНК, присутствующих в каждом диапазоне окон, т.е. распределенных в каждом диапазоне длины, при делении на суммарное количество молекул ДНК определяют как процент молекул ДНК, присутствующих в каждом диапазоне окон. Например, 1 п.о., 5 п.о., 10 п.о. или 15 п.о. могут быть взяты как окно, и любой размер, выбранный из от 1 п.о. до длины окна, может быть взят как размер шага. Конкретно, в качестве примера, если 5 п.о. взято как окно, и 2 п.о. взято как размер шага, то может быть получено распределение молекул ДНК как [1 п.о., 5 п.о.], [2 п.о., 6 п.о.], [4 п.о., 8 п.о.], [6 п.о., 10 п.о.] и тому подобное. В качестве другого примера если 5 п.о. взято как окно, и 5 п.о. взято как размер шага, то может быть получено распределение молекул ДНК как [1 п.о., 5 п.о.], [6 п.о., 10 п.о.], [11 п.о., 15 п.о.] и тому подобное. Описываемое в настоящем документе «суммарное количество молекул ДНК» относится к суммарному количеству молекул ДНК с различной длиной.

V. Определяется диапазон окон или сочетание диапазонов окон (т.е. диапазон длин или множество диапазонов длин), в которых процент присутствующих молекул ДНК высоко коррелирует с известной фракцией внеклеточной фетальной ДНК, и устанавливается формула функции.

Устройство для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце

Во втором аспекте в настоящем изобретении дополнительно предлагается устройство для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце. Изобретатели неожиданно обнаружили, что устройство по настоящему изобретению подходит для осуществления способа определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце, описанной в настоящем документе выше, с помощью которого может быть точно и эффективно определена фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце, особенно фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или фракция внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих от опухоли, в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, предположительно страдающего опухолевым процессом, или подвергаемого обследованию на предмет опухоли.

В вариантах осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фиг. 7 устройство включает: секвенатор 100, прибор 200 для подсчета и прибор 300 для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот.

Конкретно, секвенатор 100 оснащен для секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в биологическом образце, так чтобы получать результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования. Прибор 200 для подсчета связан с секвенатором 100 и оснащен для определения количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, в биологическом образце, на основе результата секвенирования. Прибор 300 для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот связан с прибором 200 для подсчета и оснащен для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце, на основе количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон.

В вариантах осуществления настоящего изобретения тип биологического образца особенно не ограничивается. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения биологический образец представляет собой образец периферической крови. В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточная нуклеиновая кислота из предварительно определенного источника выбрана из одного из следующего: внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот или внеклеточных материнских нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих из опухоли, или внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих не из опухоли, в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, предположительно страдающего опухолевым процессом, или подвергаемого обследованию на предмет опухоли. Следовательно, фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, или фракция внеклеточных нуклеиновых кислот, происходящих из опухоли, в образце периферической крови, полученном от индивидуума, страдающего опухолевым процессом, предположительно страдающего опухолевым процессом, или подвергаемого обследованию на предмет опухоли может быть легко определена. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновые кислоты представляют собой ДНК.

В вариантах осуществления настоящего изобретения результат секвенирования включает длины внеклеточных нуклеиновых кислот.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточные нуклеиновые кислоты в биологическом образце секвенируются с помощью секвенирования спаренных концов, секвенирования единичных концов или секвенирования единичных молекул. Следовательно, длины внеклеточных нуклеиновых кислот могут быть легко получены, что способствует последующим стадиям.

В вариантах осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фиг. 8 прибор 200 для подсчета дополнительно включает: блок 210 для выравнивания, первый блок 220 для определения длины и блок 230 для определения количества. Конкретно блок 210 для выравнивания оснащен для выравнивания результата секвенирования относительно референсного генома так, чтобы создать массив данных, состоящий из множества уникально картированных считываний, где каждое считывание в массиве данных может быть картировано только по положению в референсном геноме. Первый блок 220, определяющий длину, связан с блоком 210 для выравнивания и оснащен для определения длины внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующей каждому уникально картированному считыванию в массиве данных. Блок 230, определяющий количество, связан с первым блоком 220, определяющим длину, и оснащен для определения количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон. Следовательно, количество внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, в биологическом образце может быть легко определено, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первый прибор 220 для определения длины оснащен для определения длины каждого считывания, уникально картированного относительно референсного генома, как длины внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующей считыванию. Следовательно, длина внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующая каждому уникально картированному считыванию в массиве данных, может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фиг 9 в случае, когда внеклеточные нуклеиновые кислоты в биологическом образце секвенируются с помощью секвенирования спаренных концов, первый блок 220 для определения длины дополнительно включает: модуль 2210 для определения положения 5'-конца, модуль 2220 для определения положения 3'-конца и модуль 2230 для расчета длины. Конкретно, модуль 2210 для определения положения 5'-конца оснащен для определения положения 5'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты в соответствии с референсным геномом на основе данных секвенирования на одном конце каждого уникально картированного считывания, полученного при секвенировании спаренных концов. Модуль 2220 для определения положения 3'-конца связан с модулем 2210 для определения положения 5'-конца и оснащен для определения положения 3'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты в соответствии с референсным геномом на основе данных секвенирования на другом конце того же уникально картированного считывания, полученного при секвенировании спаренных концов. Модуль 2230 для расчета длины связан с модулем 2220 для определения положения 3'-конца и оснащен для определения длины внеклеточной нуклеиновой кислоты на основе положения 5'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты и положения 3'-конца внеклеточной нуклеиновой кислоты. Следовательно, длина внеклеточной нуклеиновой кислоты, соответствующая каждому уникально картированному считыванию в массиве данных, может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения устройство дополнительно включает прибор 400, определяющий предварительно определенный диапазон, с конфигурацией для определения предварительно определенного диапазона на основе множества контрольных образцов, в каждом из которых известна фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника, необязательно предварительно определенный диапазон определяется на основе, по меньшей мере, 20 контрольных образцов.

В вариантах осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фиг. 10 прибор 400, определяющий предварительно определенный диапазон, дополнительно включает: второй блок 410, определяющий длину, первый блок 420, определяющий процент, блок 430, определяющий коэффициент корреляции, и блок 440, определяющий предварительно определенный диапазон. Конкретно, второй блок 410, определяющий длину, оснащен для определения длин внеклеточных нуклеиновых кислот в множестве контрольных образцов. Первый блок 420, определяющий процент, связан со вторым блоком 410, определяющим длину, и оснащен для установления множества кандидатных диапазонов длины и определения процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученного от каждого из множеств контрольных образцов, присутствующих в каждом кандидатном диапазоне длин. Блок 430, определяющий коэффициент корреляции, связан с первым блоком 420, определяющим процент, и оснащен для определения коэффициента корреляции между каждым кандидатным диапазоном длины и фракцией внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника на основе процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученного от каждого из множеств контрольных образцов, представленных в каждом кандидатном диапазоне длины, и фракцией внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в контрольных образцах. Блок 440, определяющий предварительно определенный диапазон, связан с блоком 430, определяющим коэффициент корреляции, и оснащен для выбора кандидатного диапазона длины с наибольшим коэффициентом корреляции как предварительно определенного диапазона. Следовательно, предварительно определенный диапазон может быть определен точно и эффективно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения кандидатный диапазон длины составляет интервал от 1 п.о. до 20 п.о.

В вариантах осуществления настоящего изобретения множество кандидатных диапазонов длины имеет размер шага от 1 п.о. до 2 п.о.

В вариантах осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фиг. 11 прибор 300 для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот дополнительно включает: второй блок 310, определяющий процент, блок 320 для расчета фракции внеклеточных нуклеиновых кислот. Конкретно, второй блок 310, определяющий процент, оснащен для определения процента внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, на основе количества внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон. Блок 320 для расчета фракции внеклеточных нуклеиновых кислот связан со вторым блоком 310, определяющим процент, и оснащен для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце на основе процента внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, в соответствии с предварительно определенной функцией, где предварительно определенная функция определяется на основе множества контрольных образцов. Следовательно, фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть определена эффективно, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения устройство дополнительно включает прибор 500, определяющий предварительно определенную функцию. Со ссылкой на фиг. 12 прибор 500, определяющий предварительно определенную функцию, включает: третий блок 510, определяющий процент, и блок 520 выравнивания. Конкретно, третий блок 510, определяющий процент, оснащен для определения процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующего в предварительно определенном диапазоне. Блок 520 выравнивания связан с третьим блоком 510, определяющим процент, и оснащен для выравнивания процента внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, с известной фракцией внеклеточной нуклеиновой кислоты из предварительно определенного источника для определения предварительно определенной функции. Следовательно, предварительно определенная функция может быть определена точно и эффективно, что способствует проведению последующих стадий. В вариантах осуществления настоящего изобретения процент внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных из каждого контрольного образца, присутствующих в предварительно определенном диапазоне, выравнивается с известной фракцией внеклеточной нуклеиновой кислоты из предварительно определенного источника с помощью линейного выравнивания.

В вариантах осуществления настоящего изобретения внеклеточная нуклеиновая кислота из предварительно определенного источника представляет собой внеклеточную фетальную нуклеиновую кислоту, полученную из образца периферической крови беременной женщины, и предварительно определенный диапазон составляет от 185 п.о. до 204 п.о. Следовательно, фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть определена точно на основе предварительно определенного диапазона.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная функция представляет собой d=0,0334*p+1,6657, где d представляет собой фракцию внеклеточных нуклеиновых кислот, и p представляет собой процент внеклеточных нуклеиновых кислот, присутствующих в предварительно определенном диапазоне. Фракция внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце может быть эффективно определена на основе предварительно определенной функции, что дает возможность получения точного и надежного результата и хорошей воспроизводимости.

В вариантах осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец периферической крови, полученный от беременной женщины, в котором известна фракция внеклеточных фетальных нуклеиновых кислот.

В вариантах осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец периферической крови, полученный от женщины, беременной нормальным плодом мужского пола, в котором фракция внеклеточных нуклеиновых кислот известна как определяемая хромосомой Y. Следовательно, предварительно определенный диапазон определяется точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец периферической крови, полученный от женщины, беременной нормальным плодом мужского пола. Следовательно, предварительно определенный диапазон определяется точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения фракция внеклеточных нуклеиновых кислот в контрольном образце представляет собой фракцию внеклеточной фетальной ДНК, которая определяется устройством, подходящим для определения хромосомы Y. Следовательно, предварительно определенный диапазон может быть определен путем эффективного использования фракции внеклеточных нуклеиновых кислот контрольного образца, и затем количество внеклеточных нуклеиновых кислот с длиной, попадающей в предварительно определенный диапазон, и фракция внеклеточной фетальной ДНК в образце, полученном от обследуемой беременной женщины, могут быть дополнительно определены.

Способ и система определения половых различий близнецов

В третьем аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения различия полов близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает: осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования; определение первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования с помощью способа, описанного в настоящем документе выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце; определение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, по результатам секвенирования; и определение различия полов близнецов на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и второй фракции внеклеточной фетальной ДНК. Изобретатели неожиданно обнаружили, что различие полов близнецов у беременной женщины может быть точно и эффективно определено с помощью способа по настоящему изобретению.

В вариантах осуществления настоящего изобретения вторая фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется в соответствии со следующей формулой:

fra.chry=(chry.ER%-Female.chry.ER%)/(Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%,

где fra.chry представляет собой вторую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от здорового мужчины, относительно суммарных данных этого секвенирования.

Следовательно, вторая фракция внеклеточной фетальной ДНК может быть определена точно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения определение различия полов близнецов, основанное на первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и второй фракции внеклеточной фетальной ДНК дополнительно включает: (a) определение отношения второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и (b) определение различия полов близнецов путем сравнения отношения, определенного в (a), с предварительно определенными первым порогом и вторым порогом. Следовательно, различие полов близнецов может быть определено эффективно.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первый порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами женского пола, и второй порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами мужского пола.

В вариантах осуществления настоящего изобретения оба плода близнецов являются плодами женского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем первый порог, оба плода близнецов являются плодами мужского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем второй порог, и близнецы включают плод мужского пола и плод женского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК равно первому порогу или второму порогу, или между первым порогом и вторым порогом.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первый порог составляет 0,35, и второй порог составляет 0,7.

В четвертом аспекте в настоящем изобретении предлагается система определения различия полов близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения система включает:

устройство, определяющее первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, представляющей собой устройство, представленное в настоящем описании выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце и с конфигурацией для осуществления секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования, и с конфигурацией для определения первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования;

устройство, определяющее вторую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, с конфигурацией для определения второй фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, по результатам секвенирования; и

устройство, определяющее различия полов, с конфигурацией для определения различия полов близнецов на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и второй фракции внеклеточной фетальной ДНК.

Изобретатели неожиданно обнаружили, что различие полов близнецов у беременной женщины может быть точно и эффективно определено с помощью системы по настоящему изобретению.

В вариантах осуществления настоящего изобретения вторая фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется в соответствии со следующей формулой:

fra.chry=(chry.ER%-Female.chry.ER%)/(Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%,

где fra.chry представляет собой вторую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от здорового мужчины, относительно суммарных данных этого секвенирования. Следовательно, вторая фракция внеклеточной фетальной ДНК может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения устройство для определения различия полов дополнительно включает: блок для определения отношения с конфигурацией для определения отношения второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и блок сравнения с конфигурацией для сравнения отношения, определенного с помощью блока для определения отношения, с предварительно определенными первым порогом и вторым порогом, так чтобы определить половые различия близнецов. Следовательно, различие полов близнецов может быть эффективно определено.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первый порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами женского пола, и второй порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами мужского пола.

В вариантах осуществления настоящего изобретения оба плода близнецов являются плодами женского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем первый порог, оба плода близнецов являются плодами мужского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем второй порог, и близнецы включают плод мужского пола и плод женского пола, если отношение второй фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК равно первому порогу или второму порогу, или между первым порогом и вторым порогом.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первый порог составляет 0,35, и второй порог составляет 0,7.

Способ и система определения хромосомной анеуплоидии у близнецов

В пятом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения хромосомной анеуплоидии у близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает:

осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования;

определение первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования с помощью способа, описанного в настоящем документе выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце; или определение фетальной фракции, полученной для хромосомы Y (fra.chrY%), как первой фракции внеклеточной фетальной ДНК в соответствии со следующей формулой:

fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где fra.chry представляет собой первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от предварительно определенного здорового мужчины, относительно суммарных данных этого секвенирования.

определение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы по результатам секвенирования; и

определение того, имеют ли обследуемые близнецы анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК.

Следовательно, хромосомная анеуплоидия у близнецов может быть точно и эффективно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третья фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется в соответствии со следующей формулой:

fra.chri=2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, где fra.chri представляет собой третью фракцию внеклеточной фетальной ДНК, i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы. и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22; chri.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; adjust.chri.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для предварительно определенной хромосомы, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальными близнецами, относительно суммарных данных этого секвенирования. Следовательно, третья фракция внеклеточной фетальной ДНК может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения определение того, имеют ли обследуемые близнецы анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, основанное на первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и на третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК дополнительно включает: (a) определение отношения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и (b) определение того, имеют ли обследуемые близнецы анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, путем сравнения отношения, определенного в (a), с предварительно определенными третьим порогом и четвертым порогом. Следовательно, хромосомная анеуплоидия у близнецов может быть эффективно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третий порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами, не имеющими анеуплоидии в отношении предварительно определенной хромосомы, и четвертый порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами, имеющими анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы.

В вариантах осуществления настоящего изобретения оба плода близнецов не имеют анеуплоидии в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем третий порог, оба плода близнецов имеют анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем четвертый порог, и один из плодов близнецов имеет анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, тогда как другой плод близнецов не имеет анеуплоидии в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК равно третьему порогу или четвертому порогу, или между третьим порогом и четвертым порогом.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третий порог составляет 0,35, и четвертый порог составляет 0,7.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная хромосома представляет собой, по меньшей мере, одну из хромосом, выбранных из хромосом 18, 21 и 23.

В шестом аспекте в настоящем изобретении предлагается система определения хромосомной анеуплоидии у близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения система включает:

устройство для определения первой фракции внеклеточной фетальной ДНК, представляющее собой устройство, представленное в настоящем описании выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце и оснащенное для осуществления секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования, и оснащенное для определения первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования или определения фетальной фракции, полученной для хромосомы Y (fra.chrY%), как первой фракции внеклеточной фетальной ДНК в соответствии со следующей формулой:

fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где fra.chry представляет собой первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от предварительно определенного здорового мужчины, относительно суммарных данных этого секвенирования;

устройство для определения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК с конфигурацией для определения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы по результатам секвенирования; и первое устройство, определяющее анеуплоидию, с конфигурацией для определения того, имеют ли обследуемые близнецы анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК. Изобретатели неожиданно обнаружили, что хромосомная анеуплоидия у близнецов может быть точно и эффективно определена с помощью системы по настоящему изобретению.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третья фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется в соответствии со следующей формулой:

fra.chri=2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, где fra.chri представляет собой третью фракцию внеклеточной фетальной ДНК, i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22; chri.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; adjust.chri.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для предварительно определенной хромосомы, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальными близнецами, относительно суммарных данных этого секвенирования. Следовательно, третья фракция внеклеточной фетальной ДНК может быть точно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения первое устройство для определения анеуплоидии дополнительно включает:

блок для определения отношения с конфигурацией для определения отношения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и

блок сравнения с конфигурацией для сравнения отношения, определенного с помощью блока для определения отношения, с предварительно определенными третьим порогом и четвертым порогом, так, чтобы определить имеют ли обследуемые близнецы анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы. Следовательно, хромосомная анеуплоидия у близнецов может быть эффективно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третий порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами, не имеющими анеуплоидии в отношении предварительно определенной хромосомы, и четвертый порог определяется на основе множества контрольных образцов, полученных от женщин, беременных, как известно, близнецами, имеющими анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы.

В вариантах осуществления настоящего изобретения оба плода близнецов не имеют анеуплоидии в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем третий порог, оба плода близнецов имеют анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем четвертый порог, и один из плодов близнецов имеет анеуплоидию в отношении предварительно определенной хромосомы, тогда как другой плод близнецов не имеет анеуплоидии в отношении предварительно определенной хромосомы, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК равно третьему порогу или четвертому порогу, или между третьим порогом и четвертым порогом. Следовательно, хромосомная анеуплоидия у близнецов может быть эффективно определена.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третий порог составляет 0,35, и четвертый порог составляет 0,7.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная хромосома представляет собой, по меньшей мере, одну из хромосом, выбранных из хромосом 18, 21 и 23.

В седьмом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения хромосомной анеуплоидии у близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает:

осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования;

определение фракции xi ряда данных секвенирования, полученных для хромосомы i в результатах секвенирования, относительно суммарным данныхх секвенирования, где i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22;

определение показателя T хромосомы i в соответствии с Ti=(xiii, где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, μi представляет собой средний процент данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных этого секвенирования, σi представляет собой стандартное отклонение процентов данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных этого секвенирования,

определение показателя L хромосомы i в соответствии с Li=log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, T2i=(xii*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) и d(T2i,a) представляют собой функцию t плотности распределения вероятностей, где a представляет собой степень свободы, fra представляет собой фракцию внеклеточной фетальной ДНК, определенную с помощью способа, представленного в настоящем описании выше для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце, или фетальную фракцию, определенную для хромосомы Y (fra.chr.Y%), fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где fra.chry представляет собой фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно указанных суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от предварительно определенного здорового мужчины относительно суммарных данных этого секвенирования;

построение четырехквадрантной диаграммы с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью первой прямой линии, где T=предварительно определенный пятый порог, и второй прямой линии, где L=предварительно определенный шестой порог, где оба плода близнецов рассматриваются как имеющие трисомию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в первый квадрант; один из плодов близнецов рассматривается как имеющий трисомию, а другой из плодов близнецов рассматривается как нормальный, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий во второй квадрант; оба плода близнецов рассматриваются как нормальные, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в третий квадрант; близнецы определяются как имеющие низкую фетальную фракцию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в четвертый квадрант, такой результат не принимается. Изобретатели неожиданно обнаружили, что определение хромосомной анеуплоидии у близнецов беременной женщины и определение того, будет ли у обследуемых близнецов определена анеуплоидия в отношении предварительно определенной хромосомы, может быть достигнуто точно и эффективно с помощью способа определения хромосомной анеуплоидии у близнецов в соответствии с настоящим изобретением.

В восьмом аспекте в настоящем изобретении предлагается система определения хромосомной анеуплоидии у близнецов. В вариантах осуществления настоящего изобретения система включает:

устройство для определения величины xi в конфигурации для секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной близнецами, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования, и с конфигурацией для определения фракции xi ряда данных секвенирования, полученных для хромосомы i в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования, где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22;

устройство для определения показателя T с конфигурацией для определения показателя T хромосомы i в соответствии с Ti=(xiii, где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, μi представляет собой средний процент данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных этого секвенирования, σi представляет собой стандартное отклонение процентов данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных этого секвенирования,

устройство для определения показателя L с конфигурацией для определения показателя L хромосомы i в соответствии с Li=log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, T2i=(xii*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) и d(T2i,a) представляют собой функцию t плотности распределения вероятностей, где a представляет собой степень свободы, fra представляет собой первую фракцию внеклеточной, фетальной ДНК, определенную с помощью способа, представленного в настоящем описании выше, или фетальную фракцию, определенную для хромосомы Y (fra.chr.Y%), fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где fra.chry представляет собой вторую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно указанных суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от предварительно определенного здорового мужчины относительно суммарных данных этого секвенирования;

второе устройство для определения анеуплоидии с конфигурацией для построения четырехквадрантной диаграммы с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью первой прямой линии, где T=предварительно определенный пятый порог, и второй прямой линии, где L=предварительно определенный шестой порог, где оба плода близнецов рассматриваются как имеющие трисомию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в первый квадрант; один из плодов близнецов рассматривается как имеющий трисомию, а другой из плодов близнецов рассматривается как нормальный, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий во второй квадрант; оба плода близнецов рассматриваются как нормальные, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в третий квадрант; близнецы определяются как имеющие низкую фетальную фракцию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в четвертый квадрант, такой результат не принимается. Изобретатели неожиданно обнаружили, что определение хромосомной анеуплоидии у близнецов беременной женщины и определение того, будет ли у обследуемых близнецов определена анеуплоидия в отношении предварительно определенной хромосомы, может быть достигнуто точно и эффективно с помощью способа определения хромосомной анеуплоидии у близнецов в соответствии с настоящим изобретением.

Следует отметить, что «референсная база данных», описываемая в «μi, представляет собой среднюю величину процентов данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных этого секвенирования», относится к внеклеточным нуклеиновым кислотам в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной нормальным плодом (плодом женского пола, плодом мужского пола, одним плодом или близнецами) или к данным секвенирования (считываниям).

«Данные секвенирования» в выражении «данные секвенирования, полученные для Y хромосомы», обозначат считывания, полученные при секвенировании.

В вариантах осуществления настоящего изобретения термины «xi», «ERi» и «Chri.ER%» в настоящем описании являются видоизменяемыми, что означает, что xi может представлять собой результат, полученный после проведения коррекции на GC. Конкретно, содержание ER и GC в каждой хромосоме может быть выровнено путем использования известных данных, полученных от нормальных образцов для получения формулы отношения, т.е. . Рассчитывается средняя величина ER. Для образца, подвергаемого анализу, величина ER после коррекции рассчитывается в соответствии со следующей формулой и основывается на представленной выше формуле отношения и ER и GC образца.

Способ и система определения химерного плода

В девятом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения химерного плода. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает:

осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной плодом, необязательно плодом мужского пола, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования;

определение первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования с помощью способа, представленного в настоящем описании выше, или определение фетальной фракции хромосомы Y (fra.chrY%) в качестве первой фракции внеклеточной фетальной ДНК в соответствии со следующей формулой:

fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где fra.chry представляет собой первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y, в результатах секвенирования относительно суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относительно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от предварительно определенного здорового мужчины относительно суммарных данных этого секвенирования;

определение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы, в результатах секвенирования; и

определение того, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении предварительно определенной хромосомы на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК.

Следовательно, может быть точно проанализировано, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы.

В вариантах осуществления настоящего изобретения способ может дополнительно иметь следующие дополнительные технические характеристики.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третья фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется следующей формулой:

fra.chri=2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, где fra.chri представляет собой третью фракцию внеклеточной фетальной ДНК, i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22; chri.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования; adjust.chri.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для предварительно определенной хромосомы, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом, относительно суммарных данных этого секвенирования. Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В вариантах осуществления настоящего изобретения определение того, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении предварительно определенной хромосомы, основанное на первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и на третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК дополнительно включает: (a) определение отношения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и (b) определение того, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении предварительно определенной хромосомы, путем сравнения отношения, определенного в (a), с множеством предварительно определенных порогов. Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы, может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В вариантах осуществления настоящего изобретения множество предварительно определенных порогов включает, по меньшей мере, один, выбранный из:

седьмого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является полной хромосомой,

восьмого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является моносомной химерой,

девятого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является нормальной,

десятого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является полностью трисомной.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная хромосома обследуемого плода является полной моносомой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем седьмой порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является моносомной химерой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК не ниже, чем седьмой порог, и не выше чем восьмой порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является нормальной, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем восьмой порог и ниже чем девятый порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является трисомной химерой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК не ниже, чем девятый порог и не выше, чем десятый порог; и

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является полной трисомой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем десятый порог.

В вариантах осуществления настоящего изобретения седьмой порог составляет, по меньшей мере, -1 и ниже 0, необязательно равен -0,85;

восьмой порог выше, чем седьмой порог и ниже 0, необязательно равен -0,3;

девятый порог выше 0 и ниже 1, необязательно равен 0,3;

десятый порог выше, чем девятый порог и ниже 1, необязательно равен 0,85. Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы, может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В десятом аспекте в настоящем изобретении предлагается система определения химерного плода. В вариантах осуществления настоящего изобретения система включает:

устройство, определяющее первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, представляющей собой устройство, представленное в настоящем описании выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце и оснащенное для осуществления секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной плодом, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования, и с конфигурацией для определения первой фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе данных секвенирования, или с конфигурацией для определения фетальной фракции хромосомы Y (fra.chrY%) в качестве первой фракции внеклеточной фетальной ДНК в соответствии со следующей формулой:

fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где fra.chry представляет собой первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, chry.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для хромосомы Y в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования; Female.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом женского пола, относиттельно суммарных данных этого секвенирования; и Man.chry.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для хромосомы Y, в образце периферической крови, полученном от предварительно определенного здорового мужчины относительно суммарных данных этого секвенирования;

устройство, определяющее третью фракцию внеклеточной фетальной ДНК, с конфигурацией для определения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК на основе результатов секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы в результатах секвенирования; и

устройство, определяющее химеру, с конфигурацией для определения того, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении предварительно определенной хромосомы, на основе первой фракции внеклеточной фетальной ДНК и третей фракции внеклеточной фетальной ДНК.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ, представленный в настоящем документе выше, для определения химерного плода может быть эффективно осуществлен с помощью системы, представленной в настоящем документе выше, так что будет ли обследуемый плод являться химерным плодом, может быть эффективно проанализировано.

В вариантах осуществления настоящего изобретения система, представленная выше, для определения химерного плода может дополнительно включать следующие дополнительные технические характеристики.

В вариантах осуществления настоящего изобретения третья фракция внеклеточной фетальной ДНК определяется следующей формулой:

fra.chri=2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, где fra.chri представляет собой третью фракцию внеклеточной фетальной ДНК, i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22; chri.ER% представляет собой процент данных секвенирования, полученных для предварительно определенной хромосомы в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования; adjust.chri.ER% представляет собой средний процент данных секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, полученных для предварительно определенной хромосомы, в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, предварительно определенной как беременная нормальным плодом, относительно суммарных данных этого секвенирования. Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы, может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В вариантах осуществления настоящего изобретения устройство для определения химеры включает:

блок для определения отношения с конфигурацией для определения отношения третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК; и

блок сравнения с конфигурацией для сравнения отношения, определенного с помощью блока для определения отношения, с множеством предварительно определенных порогов, так чтобы определить будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении предварительно определенной хромосомы.

Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы, может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В вариантах осуществления настоящего изобретения множество предварительно определенных порогов включает, по меньшей мере, один, выбранный из:

седьмого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является полной хромосомой,

восьмого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является моносомной химерой,

девятого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является нормальной,

десятого порога, определенного на основе множества контрольных образцов с предварительно определенной хромосомой, в отношении которой известно, что она является полностью трисомной.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предварительно определенная хромосома обследуемого плода является полной моносомой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК ниже, чем седьмой порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является моносомной химерой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК не ниже, чем седьмой порог, и не выше чем восьмой порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является нормальной, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем восьмой порог и ниже, чем девятый порог;

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является трисомной химерой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК не ниже, чем девятый порог и не выше, чем десятый порог; и

предварительно определенная хромосома обследуемого плода является полной трисомой, если отношение третьей фракции внеклеточной фетальной ДНК к первой фракции внеклеточной фетальной ДНК выше, чем десятый порог.

В вариантах осуществления настоящего изобретения седьмой порог выше -1 и ниже 0, необязательно равен -0,85;

восьмой порог выше, чем седьмой порог и ниже 0, необязательно равен -0,3;

девятый порог выше 0 и ниже 1, необязательно равен 0,3;

десятый порог выше, чем девятый порог и ниже 1, необязательно равен 0,85. Следовательно, будет ли обследуемый плод являться химерным плодом в отношении конкретной хромосомы, может быть проанализировано с дополнительно улучшенной эффективностью.

В одиннадцатом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ определения химерного плода. В вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает:

осуществление секвенирования внеклеточных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце периферической крови, полученном от женщины, беременной плодом, так, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования;

определение фракции xi ряда данных секвенирования, полученных для хромосомы i в результатах секвенирования, относительно суммарных данных секвенирования, где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22;

определение показателя T хромосомы i в соответствии с Ti=(xiii, где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, μi представляет собой среднюю величину процентов данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных этого секвенирования, σi представляет собой стандартное отклонение процентов данных секвенирования хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных, относительно суммарных данных ее секвенирования;

определение показателя L хромосомы i в соответствии с Li=log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), где i представляет собой серийный номер хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22, T2i=(xii*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) и (d(T2i,a) представляют собой функцию t плотности распределения вероятностей, a представляет собой степень свободы, fra представляет собой фракцию внеклеточной фетальной ДНК, определенную с помощью способа, представленного в настоящем описании выше, для определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот в биологическом образце;

построение четырехквадрантной диаграммы с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью третьей прямой линии, где T=предварительно определенный одиннадцатый порог, и четвертой прямой линии, где L=предварительно определенный двенадцатый порог, где показатель T не выше 0,

где плод рассматривается как имеющий полную моносому или моносомную химеру в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в первый квадрант;

плод рассматривается как имеющий моносомную химеру в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий во второй квадрант;

плод рассматривается как нормальный в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в третий квадрант;

плод рассматривается как имеющий низкую фетальную фракцию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в четвертый квадрант, такой результат не принимается,

построение четырехквадрантной диаграммы с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью пятой прямой линии, где T=предварительно определенный тринадцатый порог, и шестой прямой линии, где L=предварительно определенный четырнадцатый порог, где показатель T выше 0,

где плод рассматривается как имеющий полную трисомию или трисомную химеру в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в первый квадрант;

плод рассматривается как имеющий трисомную химеру в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий во второй квадрант;

плод рассматривается как нормальный в отношении предварительно определенной хромосомы, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в третий квадрант;

плод рассматривается как имеющий низкую фетальную фракцию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L как попадающий в четвертый квадрант, такой результат не принимается.

Необязательно одиннадцатый порог и тринадцатый порог каждый независимо равен 3, и двенадцатый порог и четырнадцатый порог каждый независимо равен 1.

Следовательно, ситуации с химерным плодом могут быть эффективно проанализированы.

Следует отметить, что выражение «нормальный плод мужского пола/плод женского пола/плод» обозначает, что хромосома плода является нормальной, например, «нормальный плод мужского пола» относится к плоду мужского пола с нормальными хромосомами. Более того, «нормальный плод мужского пола/плод женского пола/плод» может относиться к единственному плоду или к близнецам, «нормальный плод мужского пола» может представлять собой единствекнный нормальный плод или нормальных близнецов; «нормальный плод» не ограничивает ни половые различия плода, ни ограничения в отношении единственного плода или близнецов.

Варианты осуществления настоящего изобретения подробно будут описаны ниже со ссылкой на примеры, но специалистам в данной области техники должно быть понятно, что последующие примеры используются только для иллюстрации настоящего изобретения, таким образом, не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Пример, в котором конкретное условие не описано, должен осуществляться в нормальных условиях или в условиях, рекомендованных производителем. Реагенты или приборы, не описанные производителями, представляют собой обычные продукты, доступные на рынке.

Пример 1

Фракции внеклеточной фетальной ДНК в образцах плазмы, полученных от 11 обследуемых беременных женщин определяют в соответствиис методом определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источникав биологическом образце по настоящему изобретению следующим образом.

1) Сбор и обработка образца

2 мл периферической крови, полученной в течение беременности от каждой из 11 обследуемых беременных женщин и от 37 женщин, беременных, как известно, плодами мужского пола, обрабатывали для отделения плазмы так, чтобы получить образец периферической крови от каждой обследуемой беременной женщины и от женщин, беременных, как известно, плодами мужского пола.

2) Создание библиотеки

Библиотеку создавали в соответствии с требованиями для создания библиотеки плазмы Complete Genomics Inc.

3) Секвенирование

Метод секвенирования осуществляли, точно следуя стандартной последовательности действий Complete Genomics Inc.

4) Анализ данных

Распределение длин фрагментов ДНК анализировали по считываниям, полученным с помощью секвенирования спаренных концов, и метод показан на фиг. 1. Конкретные стадии были следующими:

a) Рассчитывали длины фрагментов ДНК в образцах периферической крови, полученных от каждой из 11 обследуемых беременных женщин и от 37 женщин, беременных, как известно, плодами мужского пола. Конкретно, 19 п.о. на одном конце каждого уникально картированного считывания и 12 п.о. на другом конце того же самого уникально картированного считывания выбирали для определения начальных и концевых положений уникально картированного считывания, соответствующих референсному геному, и таким образом получали длину фрагмента ДНК на основе начальных и концевых положений уникально картированного считывания, соответствующих референсному геному.

b) Получали множество диапазонов окон для образцов периферической крови, полученных от каждой из 37 женщин, беременных, как известно, плодами мужского пола, с помощью движения окна с определенной длиной окна в соответствии с определенным размером шага, рассчитывали процент молекул ДНК, присутствующих в каждом диапазоне окон, т.е. процент молекул ДНК, присутствующих в каждом диапазоне длины. Следует отметить, что количество молекул ДНК, присутствующих в каждом диапазоне окон, т.е. распределенных в каждом диапазоне длины, при делении на суммарное количество молекул ДНК определяли как процент молекул ДНК, присутствующих в каждом диапазоне окон. Например, 1 п.о., 5 п.о., 10 п.о. или 15 п.о. могут быть взяты как окно, и любой размер, выбранный из от 1 п.о. до длины окна, может быть взят как размер шага. Конкретно, в качестве примера, если 5 п.о. взято как окно, и 2 п.о. взято как размер шага, то может быть получено распределение молекул ДНК как [1 п.о., 5 п.о.], [2 п.о., 6 п.о.], [4 п.о., 8 п.о.], [6 п.о., 10 п.о.] и тому подобное. В качестве другого примера если 5 п.о. взято как окно, и 5 п.о. взято как размер шага, то может быть получено распределение молекул ДНК как [1 п.о., 5 п.о.], [6 п.о., 10 п.о.], [11 п.о., 15 п.о.] и тому подобное.

c) Выбирали один или более диапазонов, в которых процент молекул ДНК, присутствующих в образцах периферической крови, полученных от 37 женщин, беременных, как известно, плодами мужского пола, сильно коррелировал с известной фетальной фракцией. Для определенного диапазона длин фракции внеклеточной фетальной ДНК в образцах периферической крови, полученных от 37 женщин, беременных, как известно, плодами мужского пола, определялись Y хромосомой (относительно конкретного метода определения может быть сделана ссылка на статью Fuman Jiang, Jinghui Ren, et al. Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies. BMC Med Genomics. 2012 Dec 1;5:57. doi: 10.1186/1755-8794-5-57, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки), и рассчитывались коэффициент корреляции между каждой фракцией внеклеточной феталной ДНК и процентом молекул ДНК с длиной, попадающей в M. Кроме того, выбирали диапазон длин M с максимальной абсолютной величиной коэффициента корреляции, например, M=185-204 п.о., коэффициент корреляции R=0,87, как показано на фиг. 13; или M=121-150 п.о., коэффициент корреляции R=0,6199.

d) Определяли функциональное отношение между процентом молекул ДНК в образце периферической крови, полученном от беременной женщины, присутствующей в диапазоне длин M, и определяли фракцию внеклеточной фетальной ДНК (записываемую как d). Конкретно, в отношении указанных выше 37 образцов с известными фракциями d внеклеточной фетальной ДНК (образцов, полученных от 37 женщин, беременных, как известно, плодами мужского пола), строили график линейного выравнивания с использованием процентов pi (i=1, 2, …, 48) молекул ДНК, присутствующих в 185-204 п.о., и фракций внеклеточных фетальных ДНК di (i=1, 2, …, 48), так что получали формулу взаимоотношений между ними: d=a*p+b, где d=0,0334*p+1,6657.

e) Распределение длин фрагментов ДНК и процент молекул ДНК, присутствующих в M, получали для каждого образца, полученного от 11 обследуемых беременных женщин. Процент p фрагментов ДНК, присутствующих в 185-204 п.о., получали для каждого образца, полученного от обследуемых беременных женщин, и результаты показаны в таблице 1 ниже.

f) Определяли фракции внеклеточной фетальной ДНК исследуемых образцов. Фракцию внеклеточной фетальной ДНК dj для каждого исследуемого образца рассчитывали прямо в соответствии с процентом pj (j представлял собой метку исследуемого образца) фрагмента ДНК, присутствующего в 185 п.о. -204 п.о., полученном выше, для каждого исследуемого образца и получали формулу взаимоотношений: d=a*p+b.

g) Полученные результаты фракций внеклеточной фетальной ДНК исследуемых образцов представлены в таблице 1, в которой для образцов, полученных от 37 женщин, беременных, как известно, плодами мужского пола, фракции внеклеточной фетальной ДНК, определяемые chrY, в основном совпадали с фракциями, полученными с помощью способа по настоящему изобретению.

Таблица 1

Процент молекул ДНК, присутствующих в 185-204 п.о. (%) Фракция внеклеточной фетальной ДНК (определяемая chrY) Фракция внеклеточной фетальной ДНК (определяемая процентом молекул ДНК, присутствующих в 185 п.о.-204 п.о., т.е.способом по настоящему изобретению Образец
45,33932509 0,14872 0,145567224 тестируемый образец
45,85055949 0,12618 0,129861913 тестируемый образец
47,80808312 0,06752 0,06972606 тестируемый образец
46,78175523 0,10438 0,101255234 тестируемый образец
47,76095629 0,07148 0,071173814 тестируемый образец
45,18367884 0,15494 0,150348735 тестируемый образец
45,61282777 0,13413 0,13716512 тестируемый образец
48,50026322 0,04923 0,04846203 тестируемый образец
47,30076126 0,08555 0,085311176 тестируемый образец
47,12684798 0,09149 0,090653857 тестируемый образец
47,59287602 0,07892 0,076337302 тестируемый образец

Пример 2

Определение половых различий близнецов и определение хромосомной анеуплоидии у близнецов осуществляли с использованием образцов периферической крови, полученных от 11 женщин, беременных близнецами, описанных в примере 1, в соответствии со способом определение половых различий близнецов и способом определения хромосомной анеуплоидии у близнецов на основании результатов фракций внеклеточной фетальной ДНК, полученных в примере 1.

1. Определение половых различий плодов обследуемой беременной женщины

Пол каждого плода 11 обследуемых беременных женщин определяли на основе результатов фракций внеклеточной фетальной ДНК, полученных в примере 1, и в соотвтетствии со следующими стадиями:

a) fra.chry рассчитывали для хромосомы Y;

b) fra.size определяли по различиям в пределах предварительно определенной области между матерью и плодом;

c) Стандарт определения:

I. Если величина fra.chry/fra.size ниже 0,35, оба плода близнецов являются плодами женского пола;

II. Если ошибка! Не найдено никакого референсного источника. Если величина fra.chry/fra.size не ниже 0,35 и не выше 0,7, близнецы включают плод мужского пола и плод женского пола;

III. Если ошибка! Не найдено никакого референсного источника. Если величина fra.chry/fra.size выше 0,7, оба плода близнецов являются плодами мужского пола.

Результаты показаны в таблице ниже:

Результаты определения половых различий плодов 11 обследуемых беременных женщин

No. образца fra.chry fra.size fra.chry/
fra.size
Результат определения Результаты кариотипа
S1 0,131431 0,118 1,113822 [мальчик, мальчик] [мальчик, мальчик]
S2 -0,00014 0,126652 -0,00114 [девочка, девочка] [девочка, девочка]
S3 -0,00019 0,125 -0,00151 [девочка, девочка] [девочка, девочка]
S4 0,141033 0,150125 0,939435 [мальчик, мальчик] [мальчик, мальчик]
S5 0,071202 0,088074 0,808433 [мальчик, мальчик] [мальчик, мальчик]
S6 0,06227 0,133 0,468195 [девочка, мальчик] [девочка, мальчик]
S7 -0,00044 0,132 -0,0033 [девочка, девочка] [девочка, девочка]
S8 -0,00396 0,074 -0,05353 [девочка, девочка] [девочка, девочка]
S9 0,185233 0,172 1,076936 [мальчик, мальчик] [мальчик, мальчик]
S10 0,072432 0,086 0,842233 [мальчик, мальчик] [мальчик, мальчик]
S11 0,000339 0,092792 0,003653 [девочка, девочка] [девочка, девочка]

1. Определение хромосомной анеуплодии у близнецов с помощью фетальных фракций

Хромосомную анеуплоидию у близнецов 11 обследуемых беременных женщин определяли с помощью фетальных фракций на основе результатов фракций внеклеточной фетальной ДНК, определенных в примере 1, и в соответствии со следующими стадиями:

a) fra.chry рассчитывали для хромосомы i (i=13, 18, 21);

b) fra.size определяли по различиям в пределах предварительно определенной области между матерью и плодом;

c) Стандарт определения:

I. Если ошибка! Не найдено никакого референсного источника. Если величина fra.chry/fra.size ниже 0,35 хромосома i у обоих плодов близнецов является нормальной;

II. Если ошибка! Не найдено никакого референсного источника. Если величина fra.chry/fra.size не ниже 0,35 и не выше 0,7, хромосома i одного из плодов близнецов является трисомой, а у другого плода близнецов является нормальной;

III. Если ошибка! Не найдено никакого референсного источника. Если величина fra.chry/fra.size выше 0,7, хромосома i у обоих плодов близнецов является трисомой.

Результаты показаны в таблице ниже:

Результаты определения хромосомной анеуплоидии близнецов 11 обследуемых беременных женщин с помощью фетальных фракций

No. образца fra.chr13 fra.chr18 fra.chr21 fra.size fra.chr13/
fra.size
fra.chr18/
fra.size
fra.chr21/
fra.size
Результат определения Результаты кариотипа
S1 0,113979 0,017835 -0,01762 0,118 0,965921 0,151144 -0,14933 [T13,T13] [T13,T13]
S2 -0,00586 0,004833 0,009971 0,126652 -0,0463 0,03816 0,078728 [нормальая, нормальная] [нормальая, нормальная]
S3 0,001131 0,003996 0,121607 0,125 0,009048 0,031968 0,972856 [T21,T21] [T21,T21]
S4 -0,01175 -0,01269 0,004841 0,150125 -0,07829 -0,08455 0,032246 [нормальая, нормальная] [нормальая, нормальная]
S5 2,20E-05 -0,01032 0,011321 0,088074 0,00025 -0,11721 0,128539 [нормальая, нормальная] [нормальая, нормальная]
S6 0,040963 -0,00491 -0,00723 0,133 0,307992 -0,03693 -0,05438 [T13, нормальная] [T13, нормальная]
S7 0,005557 -0,01147 0,0754 0,132 0,042098 -0,08688 0,571212 [T21, нормальная] [T21, нормальная]
S8 0,014679 0,031445 -0,01884 0,074 0,198365 0,424932 -0,25462 [T18, нормальная] [T18, нормальная]
S9 0,010402 0,082992 0,007482 0,172 0,060477 0,482512 0,0435 [T18, нормальная] [T18, нормальная]
S10 0,001905 0,074566 -0,00051 0,086 0,022151 0,867052 -0,00592 [T18,T18] [T18,T18]
S11 0,014591 -0,00375 -0,01728 0,092792 0,157244 -0,04041 -0,1862 [нормальая, нормальная] [нормальая, нормальная]

2. Определение хромосомной анеуплодии у близнецов беременной женщины с помощью показателя T и показателя L

Хромосомную анеуплоидию у близнецов 11 обследуемых беременных женщин определяли с помощью показателя T и показателя L на основе результатов фракций внеклеточной фетальной ДНК, определенных в примере 1, и в соответствии со следующими стадиями:

a) Полное секвенирование генома (WGS): проводили полное секвенирование генома исследуемого образца с использованием высокопроизводительной платформы Illumina.

b) получали информацию о положении эффективных считываний: считывания тестируемого образца уникально картировали относительно референсной геномной последовательности hg19 для получения информации о положении в соответствии с референсным геномом уникально картированных считываний.

c) Получали процент эффективных считываний: получали процент эффективных считываний в каждой хромосоме относительно суммарных эффективных считываний, полученных в b).

d) Коррекция на GC:

Содержание UR и GC в каждой хромосоме выравнивали путем использования известных данных, полученных из нормальных образцов для получения формулы отношения: и рассчитывали среднюю величину ER. Для образца, подвергаемого анализу, величину ER после коррекции рассчитывали в соответствии с указанной выше формулой отношения и ER и GC образца.

e) Рассчитывали показатель T: Ti=(xiii,

где i: серийный номер хромосомы (i=13, 18, 21);

xi: процент эффективных считываний хромосомы i в нализируемом образце;

μi: средний процент эффективных считываний хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных;

σi: стандартное отклонение процентов эффективных считываний хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных;

f) рассчитывали показатель L:

Показатель L хромосомы i определяли в соответствии с формулой:

Li=log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)),

где i представляет собой серийный номер хромосомы, T2i=(xii*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) и (d(T2i,a) представляют собой функцию t плотности распределения вероятностей, a представляет собой степень свободы, fra представляет собой первую фракцию внеклеточной фетальной ДНК, определенную с помощью способа, представленного в примере 1,

g) строили четырехквадрантную диаграмму с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью первой прямой линии, где T=3, и второй прямой линии, где L=0,8 (образец с фетальной фракцией <5% рассматривали как не прошедший контроля качества), подробности описаны следующим образом:

I. Оба плода близнецов рассматриваются как имеющие трисомию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L (T>3, L>0,8) как попадающий в первый квадрант;

II. Один из плодов близнецов рассматривается как имеющий трисомию, а другой из плодов близнецов рассматривается как нормальный, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L (T>3, L≤0,8) как попадающий во второй квадрант;

III. Оба плода близнецов рассматриваются как нормальные, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L (T≤3, L≤0,8) как попадающий в третий квадрант;

IV. Близнецы определяются как имеющие низкую фетальную фракцию, если используемый для определения образец определен по показателю T и по показателю L (T≤3, L>0,8) как попадающий в четвертый квадрант, такой образец рассматривали как не прошедший контроля качества.

Четырехквадрантные диаграммы, построенные на основе показателей T и показателей L 11 образцов, используемых для определения, представлены на фиг. 14-16. Из фиг. 14-16 можно видеть, что хромосомная анеуплоидия у близнецов 11 обследуемых беременных женщин, определенная по показателю T и показателю L, совпадает с определенной на стадии 2 с помощью фетальной фракции.

Пример 3. Определение химерного плода

В последующих примерах смесь фрагментов ДНК получали из тканей абортивного материала, и плазма, полученная от небеременной женщины, в определенной степени имитировала образец, полученный от беременной женщины. Количество аномальных хромосом (трисомия, полная моносомия, трисомная химера, моносомная химера) плода (мужского пола) определяли в соответствии со следующим методом, который включает следующие стадии.

1) Полное секвенирование генома (WGS): проводили полное секвенирование генома исследуемого образца с использованием высокопроизводительной платформы.

b) Получали информацию о положении эффективных считываний: считывания тестируемого образца уникально выравнивали относительно референсной геномной последовательности для получения информации о положении в соответствии с референсным геномом уникально картированных считываний.

c) Получали фракцию уникально картированных считываний в каждой хромосоме и процентное количество гуанинов (оснований G) и цитозинов (оснований C) уникально картированных считываний относительно суммарного количества оснований в каждой хромосоме: получено процентное количество эффективных считываний в каждой хромосоме в исследуемом образце относительно суммарного количества этих эффективных считываний и процентное количество оснований G и C в эффективных считываниях в каждой хромосоме относительно суммарного количества этих оснований с использованием информации о положении и информации об эффективных считываниях.

4) Рассчитывали фракцию ДНК для хромосомы i, которую представляли как fra.chri,

fra.chri=2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, где fra.chri представляет собой фракцию внеклеточной фетальной ДНК, i представляет собой серийный номер предварительно определенной хромосомы, и i представляет собой любое целое число в диапазоне от 1 до 22;

chri.ER%: ER% (краткосрочный процент эффективных считываний, процент уникально картированных считываний) хромосомы i в образце;

adjust.chri.ER%: теоретическая величина ER% хромосомы i в образце;

5) Рассчитывали фетальную для хромосомы Y, которую представляли как fra.chry;

fra.chry=(chry.ER%-Female.chr.ER%)/Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, где chry.ER%: ER% (краткосрочный процент эффективных считываний, процент уникально картированных считываний) хромосомы Y в исследуемом образце;

Female.chry.ER%: среднее ER% хромосомы Y в исследуемом образце, полученном от женщины, беременной плодом женского пола;

Man.chry.ER%: среднее ER% хромосомы Y в исследуемом образце, полученном от мужчины.

6) Стандарт определения

I. Если fra.chri/fra.chry<A1 (A1 представляет собой определенную константу, и A1>-1, например, -0,85), хромосома i плода является полной моносомой;

II. Если fra.chri/fra.chry∈[A1,A2] (A1 и A2 представляют собой определенные константы, и -1<A1<A2<0, например, [-0,85, -0,3]), хромосома i плода является моносомной химерой;

III. Если fra.chri/fra.chry∈[A2,A3] (A2 и A3 представляют собой определенные константы, и A2<0<A3, например, [-0,3, -0,3]), хромосома i плода является нормальной;

IV. Если fra.chri/fra.chry∈[A3,A4] (A3 и A4 представляют собой определенные константы, и 0<A3<A4<1, например, [0,3, 0,85]), хромосома i плода является трисомной химерой;

V. Если fra.chri/fra.chry>A4 (A4 представляет собой определенную константу, например, 0,85), хромосома i плода является полной трисомой.

3.1. Хромосомную анеуплоидию определяли в 19 образцах (M1'''M19), каждый из которых представляет собой смесь фрагментов ДНК, полученных из ткани абортивного материала, и плазму, полученную от небеременной женщины (подробности показаны в таблице A), и 2 образца плазмы (N1, N2), полученных соответственно от 2 женщин, беременных плодом мужского пола (плод мужского пола у одной женщины представлял собой T18 химеру, а плод мужского пола другой беременной женщины представлял собой T21 химеру).

1) Сбор и обработка образца

2 мл периферической крови обрабатывали для отделения плазмы.

2) Создание библиотеки

Библиотеку создавали в соответствии с требованиями для создания библиотеки плазмы Complete Genomics Inc.

3) Секвенирование

Метод секвенирования осуществляли, точно следуя стандартной последовательности действий Complete Genomics Inc.

4) Анализ данных

a) Полное секвенирование генома (WGS): проводили полное секвенирование генома исследуемого образца с использованием высокопроизводительной платформы (длины молекул всех внеклеточных ДНК получали с помощью секвенирования единичных концов или секвенирования спаренных концов, что является важным. При использовании секвенирования единичных концов необходимо секвенирование полной молекулы внеклеточной ДНК).

b) Получали информацию о положении эффективных считываний: считывания тестируемого образца уникально выравнивали относительно референсной геномной последовательности для получения информации о положении в соответствии с референсным геномом уникально картированных считываний.

c) Получали процент эффективных считываний: получали процент эффективных считываний в каждой хромосоме относительно суммарных эффективных считываний, полученных в b).

d) Коррекция на GC:

Содержание UR и GC в каждой хромосоме выравнивали путем использования известных данных, полученных из нормальных образцов, для получения формулы отношения: и рассчитывали среднюю величину ER. Для образца, подвергаемого анализу, величину ER после коррекции рассчитывали в соответствии с указанной выше формулой отношения и ER и GC образца.

e) fra.chri рассчитывали для хромосомы I (i=13, 18 21);

f) fra.chry рассчитывали для хромосомы Y;

g)fra.size рассчитывали с помощью метода определения фракции внеклеточной фетальной ДНК по настоящему изобретению;

h) рассчитывали показатель T: Ti=(xiii,

где i: серийный номер хромосомы (i=1,2,…22);

xi: процент эффективных считываний хромосомы i в анализируемом образце;

μi: средний процент эффективных считываний хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных;

σi: стандартное отклонение процентов эффективных считываний хромосомы i, выбранной в качестве референсной системы в референсной базе данных;

i) рассчитывали показатель L:

сначала рассчитывали величину T2: T2i=(xii*(1+fra/2))/σi;

затем рассчитывали показатель L: Li=log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)),

где d(Ti,a) и (d(T2i,a) представляют собой функцию t плотности распределения вероятностей, a представляет собой степень свободы, fra представляет собой fra.chry или fra.size.

Хромосомную анеуплодию исследуемого образца определяли по fra.chry, которая была определена для хромосомы Y (как показано в таблице A).

a) Стандарт определения

I. Если fra.chri/fra.chry<-0,85, хромосома i плода является полной моносомой;

II. Если fra.chri/fra.chry∈[-0,85, -0,3], хромосома i плода является моносомной химерой;

III. Если fra.chri/fra.chry∈[-0,3, 0,3], хромосома i плода является нормальной;

IV. Если fra.chri/fra.chry∈[0,3, 0,85], хромосома i плода является трисомной химерой;

V. Если fra.chri/fra.chry> 0,85, хромосома i плода является полной трисомой.

Хромосомную анеуплоидию исследуемого образца определяли по показателю T и показателю L (fra.chry определяли для хромосомы Y) (как показано в таблице B).

a) строили четырехквадрантную диаграмму на основе показателей T и показателей L;

b) когда T≤0, строили четырехквадрантную диаграмму с T в качестве вертикальной координаты и абсолютной величиной L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью прямой линии, когда T=3, и прямой линии, когда L=1 (образец с фетальной фракцией <5% рассматривали как не прошедший контроля качества),

I. Плод рассматривался как имеющий моносому или моносомную химеру, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T>3, L>1), как попадающий в первый квадрант;

II. Плод рассматривался как имеющий моносомную химеру, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T>3, L≤1), как попадающий во второй квадрант;

III. Плод рассматривался как нормальный, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T≤3, L≤1), как попадающий в третий квадрант;

IV. Плод рассматривался как имеющий низкую фетальную фракцию, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T≤3, L>1), как попадающий в четвертый квадрант, такой образец рассматривали как не прошедший контроля качества.

Когда T>0, строили четырехквадрантную диаграмму с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью прямой линии, когда T=3, и прямой линии, когда L=0,8 (образец с фетальной фракцией <5% рассматривали как не прошедший контроля качества),

I. Плод рассматривался как имеющий трисому или трисомную химеру, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T>3, L>1), как попадающий в первый квадрант;

II. Плод рассматривался как имеющий трисомную химеру, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T>3, L≤1), как попадающий во второй квадрант;

III. Плод рассматривался как нормальный, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T≤3, L≤1), как попадающий в третий квадрант;

IV. Плод рассматривался как имеющий низкую фетальную фракцию, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T≤3, L>1), как попадающий в четвертый квадрант, такой образец рассматривали как не прошедший контроля качества.

Хромосомную анеуплодию исследуемого образца определяли по fra.size, которая была определена с помощью метода определения фракции внеклеточной фетальной ДНК по настоящему изобретению (как показано в таблице C).

a) Стандарт определения

I. Если fra.chri/fra.chry<-0,85, хромосома i плода является полной моносомой;

II. Если fra.chri/fra.chry∈[-0,85, -0,3], хромосома i плода является моносомной химерой;

III. Если fra.chri/fra.chry∈[-0,3, 0,3], хромосома i плода является нормальной;

IV. Если fra.chri/fra.chry∈[0,3, 0,85], хромосома i плода является трисомной химерой;

V. Если fra.chri/fra.chry> 0,85, хромосома i плода является полной трисомой.

Хромосомную анеуплоидию исследуемого образца определяли по показателю T и показателю L (fra.size определяли с помощью метода определения фракции внеклеточной фетальной ДНК по настоящему изобретению (как показано в таблице D, фиг. 2).

a) строили четырехквадрантную диаграмму на основе показателей T и показателей L;

b) когда T≤0, строили четырехквадрантную диаграмму с T в качестве вертикальной координаты и абсолютной величиной L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью прямой линии, когда T=3, и прямой линии, когда L=1 (образец с фетальной фракцией <5% рассматривали как не прошедший контроля качества),

I. Плод рассматривался как имеющий моносому или моносомную химеру, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T>3, L>1), как попадающий в первый квадрант;

II. Плод рассматривался как имеющий моносомную химеру, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T>3, L≤1), как попадающий во второй квадрант;

III. Плод рассматривался как нормальный, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T≤3, L≤1), как попадающий в третий квадрант;

IV. Плод рассматривался как имеющий низкую фетальную фракцию, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T≤3, L>1), как попадающий в четвертый квадрант, такой образец рассматривали как не прошедший контроля качества.

Когда T>0, строили четырехквадрантную диаграмму с T в качестве вертикальной координаты и L в качестве горизонтальной координаты с зонированием с помощью прямой линии, когда T=3, и прямой линии, когда L=1 (образец с фетальной фракцией <5% рассматривали как не прошедший контроля качества),

I. Плод рассматривался как имеющий трисому или трисомную химеру, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T>3, L>1), как попадающий в первый квадрант;

II. Плод рассматривался как имеющий трисомную химеру, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T>3, L≤1), как попадающий во второй квадрант;

III. Плод рассматривался как нормальный, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T≤3, L≤1), как попадающий в третий квадрант;

IV. Плод рассматривался как имеющий низкую фетальную фракцию, если исследуемый образец определен по показателю T и по показателю L (T≤3, L>1), как попадающий в четвертый квадрант, такой образец рассматривали как не прошедший контроля качества.

В этом варианте осуществления используемый в настоящем описании отрицательный образец представлял собой образец плазмы, полученный от нормальной женщины, которая не была беременна; положительный образец получали путем смешивания фрагментов ДНК, которые получали из случайных разрывов ДНК ткани абортивного материала в соответствии с размером диапазона от 150 п.о. до 200 п.о. и плазмы, полученной от нормальной женщины, которая не была беременна; (T21, T18 каждый представлял собой плод мужского пола; T13 представлял собой плод женского пола); позитивный химерный образец получали путем смешивания фрагментов ДНК плацентарной ткани (которые получали из случайных разрывов ДНК плацентарной ткани в соответствии с размером диапазона от 150 п.о. до 200 п.о.), фрагменты ДНК китайской клеточной линии (которые получали из случайных разрывов ДНК китайской клеточной линии в соответствии с размером диапазона от 150 п.о. до 200 п.о.) и плазмы, полученной от нормальной женщины, (T21, T18 каждый представлял собой плод мужского пола; T13 представлял собой плод женского пола).

No. образца Кариотип ткани абортивного материала Фетальная фракция Отношение химер Форма экспрессии
M1 трисомия 13 3,5% 0 T13-3,5%
M2 трисомия 13 5% 0 T13-5%
M3 трисомия 13 8% 0 T13-8%
M4 трисомия 13 8% 0 T13-8%
M5 трисомия 18 10% 30% T18-10%-30%
M6 трисомия 18 10% 70% T18-10%-70%
M7 трисомия 18 10% 70% T18-10%-70%
M8 трисомия 18 10% 70% T18-10%-70%
M9 трисомия 18 3,5% 0 T18-3,5%
M10 трисомия 18 5% 0 T18-5%
M11 трисомия 18 5% 0 T18-5%
M12 трисомия 18 8% 0 T18-8%
M13 трисомия 18 10% 30% T21-10%-30%
M14 трисомия 18 10%- 70% T21-10%-70%
M15 трисомия 18 10% 70% T21-10%-70%
M16 трисомия 18 10% 70% T21-10%-70%
M17 трисомия 18 3,5% 0 T21-3,5%
M18 трисомия 18 5% 0 T21-5%
M19 трисомия 18 8% 0 T21-8%
No. образца Результаты кариотипирования
N1 47,XN +18[3]/46,XN[20]
N2 47,XN +21[30]/46,XN[18]

Таблица A. Определение хромосомной анеуплоидии с помощью фракции смешанной ДНК, определенной для хромосомы Y

No. образца fra.chr13 fra.chr18 fra.chr21 fra.chry fra.chr13/
fra.chry
fra.chr18/
fra.chry
fra.chr21/
fra.chry
Результат определения
M1 0,03531 -4,8E-06 -0,00742 0,00069 T13-3,5%
M2 0,04731 -0,01207 0,007764 -0,00002 T13-5%
M3 0,08136 -0,00477 -0,00129 -0,0002 T13-8%
M4 0,0796 -0,00738 -0,0013 -0,00157 T13-8%
M5 -0,01079 0,03401 -0,00442 0,105215 -0,10259 0,323243 -0,04197 T18-10%-30%
M6 -0,00192 0,069573 -0,00043 0,090435 -0,02127 0,769319 -0,00471 T18-10%-70%
M7 0,001756 0,058363 -0,00968 0,087785 0,020009 0,664844 -0,11022 T18-10%-70%
M8 -0,01081 0,082063 -0,00917 0,106115 -0,1019 0,773343 -0,08638 T18-10%-70%
M9 0,007816 0,0341 -0,00038 0,03723 0,209951 0,915928 -0,01009 T18-3,5%
M10 0,013116 0,0512 -0,00607 0,04843 0,270834 1,057196 -0,12525 T18-5%
M11 0,000956 0,0513 -0,01176 0,0566 0,016899 0,90636 -0,2077 T18-5%
M12 -0,00237 0,07693 -0,004 0,08877 -0,02674 0,866622 -0,04501 T18-8%
M13 0,001246 -0,01028 0,04323 0,110455 0,011285 -0,09311 0,391381 T21-10%-30%
M14 0,000266 -0,01586 0,06554 0,092805 0,002871 -0,17095 0,706212 T21-10%-70%
M15 -0,00041 0,004795 0,07461 0,110035 -0,00376 0,043578 0,678057 T21-10%-70%
M16 -0,00235 -0,00759 0,06985 0,097155 -0,02422 -0,07817 0,718954 T21-10%-70%
M17 0,005776 0,010345 0,0481 0,03478 0,166086 0,297445 1,382979 T21-3,5%
M18 0,007786 0,006345 0,0557 0,04853 0,160447 0,130747 1,147744 T21-5%
M19 0,009846 -0,00828 0,07449 0,06855 0,143639 -0,12086 1,086652 T21-8%
N1 0,007053 0,043212 0,000938 0,110337 0,063922 0,391637 0,008501 47,XN +18[3]/46,XN[20]
N2 -0,01105 0,002921 0,081665 0,167834 -0,06581 0,017404 0,486582 47,XN +21[30]/46,XN[18]

Примечания:

fra.chr13: представляет собой смешанную фракцию ДНК, определенную для хромосомы 13;

fra.chr18: представляет собой смешанную фракцию ДНК, определенную для хромосомы 18;

fra.chr21: представляет собой смешанную фракцию ДНК, определенную для хромосомы 21;

fra.chry: представляет собой смешанную фракцию ДНК, определенную для хромосомы Y;

T21-10%-30%: фрагменты ДНК, полученные из клеточной линии с трисомией 21, смешанной с плазмой женщины в соответствии с фракцией 10% и отношением химер 30%.

Таблица B. Определение хромосомной анеуплоидии с помощью показателя T и показателя L (фракцию смешанной ДНК определяли для хромосомы Y)

No. образца T.chr13 L.chr13 T.chr18 L.chr18 T.chr21 L.chr21 fra.chry Результат определения
M1 4,345751 -0,00053 -0,60057 0,00069 T13-3,5%
M2 5,436515 -1,216 0,52145 -0,00002 T13-5%
M3 10,46607 -0,47762 -0,09072 -0,0002 T13-8%
M4 9,126057 -0,70384 -0,08565 -0,00157 T13-8%
M5 -1,43378 0,018171 4,16099 0,292408 -0,39025 0,023403 0,105215 T18-10%-30%
M6 -0,20845 0,015392 7,977908 12,56388 -0,03313 0,031699 0,090435 T18-10%-70%
M7 0,210445 0,015766 7,151443 4,550099 -0,82976 0,035673 0,087785 T18-10%-70%
M8 -1,19968 0,019721 8,763087 10,86877 -0,7035 0,030472 0,106115 T18-10%-70%
M9 0,963351 0,189495 3,96625 9,33211 -0,03142 0,162273 0,03723 T18-3,5%
M10 1,8534 0,251063 6,429505 19,56264 -0,51602 0,082144 0,04843 T18-5%
M11 0,112697 0,031697 6,659763 23,63495 -1,01942 0,072816 0,0566 T18-5%
M12 -0,24379 0,016926 8,332999 25,4093 -0,2922 0,035987 0,08877 T18-8%
M13 0,164157 0,010591 -1,22048 0,017938 3,76578 0,491369 0,110455 T21-10%-30%
M14 0,037473 0,013915 -1,90428 0,036927 5,667693 4,554072 0,092805 T21-10%-70%
M15 -0,05039 0,011486 0,536781 0,017359 5,897363 3,910694 0,110035 T21-10%-70%
M16 -0,28883 0,01242 -0,86821 0,018234 6,167815 5,406755 0,097155 T21-10%-70%
M17 0,581767 0,19567 1,077291 0,427888 3,582341 4,827084 0,03478 T21-3,5%
M18 0,93815 0,145201 0,654071 0,129238 3,958377 8,227322 0,04853 T21-5%
M19 1,201005 0,051788 -1,03581 0,032569 6,795784 21,00502 0,06855 T21-8%
N1 0,703062 0,022374 5,418144 0,435182 0,081371 0,02066 0,110337 47,XN +18[3]/46,XN[20]
N2 -0,97092 0,012246 0,355485 0,005614 7,170205 0,903486 0,167834 47,XN +21[30]/46,XN[18]

Примечания:

T.chr13: показатель T хромосомы 13;

L.chr13: показатель L хромосомы 13;

T.chr18: показатель T хромосомы 18;

L.chr18: показатель L хромосомы 18;

T.chr21: показатель T хромосомы 21;

L.chr21: показатель L хромосомы 21;

fra.chry: смешанная фракция ДНК, определенная для хромосомы Y;

T21-10%-30%: фрагменты ДНК, полученные из клеточной линии с трисомией 21, смешанной с плазмой женщины в соответствии с фракцией 10% и отношением химер 30%.

Таблица C. Определение хромосомной анеуплоидии с помощью fra.size

No. образца fra.chr13 fra.chr18 fra.chr21 fra.size fra.chr13/
fra.size
fra.chr18/
fra.size
fra.chr21/
fra.size
Результат определения
M1 0,03531 -4,8E-06 -0,00742 0,0369 0,956911 -0,00013 -0,20097 T13-3,5%
M2 0,04731 -0,01207 0,007764 0,05519 0,857221 -0,21879 0,140682 T13-5%
M3 0,08136 -0,00477 -0,00129 0,08462 0,961475 -0,05643 -0,01519 T13-8%
M4 0,0796 -0,00738 -0,0013 0,07332 1,085652 -0,10072 -0,01767 T13-8%
M5 -0,01079 0,03401 -0,00442 0,1071 -0,10078 0,317554 -0,04123 T18-10%-30%
M6 -0,00192 0,069573 -0,00043 0,0928 -0,02073 0,749713 -0,00459 T18-10%-70%
M7 0,001756 0,058363 -0,00968 0,1058 0,016602 0,551638 -0,09145 T18-10%-70%
M8 -0,01081 0,082063 -0,00917 0,1233 -0,0877 0,665558 -0,07434 T18-10%-70%
M9 0,007816 0,0341 -0,00038 0,0432 0,180937 0,789352 -0,0087 T18-3,5%
M10 0,013116 0,0512 -0,00607 0,05688 0,230599 0,900141 -0,10664 T18-5%
M11 0,000956 0,0513 -0,01176 0,0438 0,021838 1,171233 -0,2684 T18-5%
M12 -0,00237 0,07693 -0,004 0,06726 -0,03529 1,14377 -0,05941 T18-8%
M13 0,001246 -0,01028 0,04323 0,0705 0,017681 -0,14588 0,613191 T21-10%-30%
M14 0,000266 -0,01586 0,06554 0,1056 0,002524 -0,15024 0,620644 T21-10%-70%
M15 -0,00041 0,004795 0,07461 0,1205 -0,00343 0,039794 0,61917 T21-10%-70%
M16 -0,00235 -0,00759 0,06985 0,1165 -0,0202 -0,06519 0,599571 T21-10%-70%
M17 0,005776 0,010345 0,0481 0,0409 0,141234 0,252938 1,176039 T21-3,5%
M18 0,007786 0,006345 0,0557 0,04543 0,171395 0,139669 1,226062 T21-5%
M19 0,009846 -0,00828 0,07449 0,07848 0,125465 -0,10557 0,949159 T21-8%
N1 0,007053 0,043212 0,000938 0,102547 0,068778 0,421387 0,009147 47,XN +18[3]/46,XN[20]
N2 -0,01105 0,002921 0,081665 0,198228 -0,05572 0,014736 0,411975 47,XN +21[30]/46,XN[18]

Примечания:

fra.chr13: представляет собой смешанную фракцию ДНК, определенную для хромосомы 13;

fra.chr18: представляет собой смешанную фракцию ДНК, определенную для хромосомы 18;

fra.chr21: представляет собой смешанную фракцию ДНК, определенную для хромосомы 21;

fra.size: представляет собой смешанную фракцию ДНК, определенную с помощью способа определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце по настоящему изобретению;

T21-10%-30%: фрагменты ДНК, полученные из клеточной линии с трисомией 21, смешанной с плазмой женщины в соответствии с фракцией 10% и отношением химер 30%.

Таблица D. Определение хромосомной анеуплоидии с помощью показателя T и показателя L (fra.size)

No.
образца
T.chr13 L.chr13 T.chr18 L.chr18 T.chr21 L.21 fra.size Результат определения
M1 4,345751 10,86269 -0,00053 0,06264 -0,60057 0,110064 0,0369 T13-3,5%
M2 5,436515 13,40864 -1,216 0,040421 0,52145 0,080194 0,05519 T13-5%
M3 10,46607 36,3034 -0,47762 0,013724 -0,09072 0,026097 0,08462 T13-8%
M4 9,126057 29,68988 -0,70384 0,019292 -0,08565 0,033903 0,07332 T13-8%
M5 -1,43378 0,015183 4,16099 0,216731 -0,39025 0,019427 0,1071 T18-10%-30%
M6 -0,20845 0,01467 7,977908 10,52499 -0,03313 0,030232 0,0928 T18-10%-70%
M7 0,210445 0,011014 7,151443 1,813942 -0,82976 0,026168 0,1058 T18-10%-70%
M8 -1,19968 0,015259 8,763087 4,176647 -0,7035 0,023665 0,1233 T18-10%-70%
M9 0,963351 0,136353 3,96625 6,810597 -0,03142 0,126392 0,0432 T18-3,5%
M10 1,8534 0,166895 6,429505 20,92116 -0,51602 0,062989 0,05688 T18-5%
M11 0,112697 0,051911 6,659763 13,06329 -1,01942 0,107019 0,0438 T18-5%
M12 -0,24379 0,028322 8,332999 19,64862 -0,2922 0,058661 0,06726 T18-8%
M13 0,164157 0,025146 -1,22048 0,037995 3,76578 2,372928 0,0705 T21-10%-30%
M14 0,037473 0,010899 -1,90428 0,030091 5,667693 2,443191 0,1056 T21-10%-70%
M15 -0,05039 0,009693 0,536781 0,014533 5,897363 2,522845 0,1205 T21-10%-70%
M16 -0,28883 0,008906 -0,86821 0,013317 6,167815 2,195736 0,1165 T21-10%-70%
N1 0,703062 0,030365 5,418144 0,576578 0,081371 0,02724 0,102547 47,XN +18[3]/46,XN[20]
N2 -0,97092 0,013866 0,355485 0,007248 7,170205 0,553012 0,198228 47,XN +21[30]/46,XN[18]

Примечания:

T.chr13: показатель T хромосомы 13;

L.chr13: показатель L хромосомы 13;

T.chr18: показатель T хромосомы 18;

L.chr18: показатель L хромосомы 18;

T.chr21: показатель T хромосомы 21;

L.chr21: показатель L хромосомы 21;

fra.size: смешанная фракция ДНК, определенная с помощью способа определения фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из предварительно определенного источника в биологическом образце по настоящему изобретению;

T21-10%-30%: фрагменты ДНК, полученные из клеточной линии с трисомией 21, смешанной с плазмой женщины в соответствии с фракцией 10% и отношением химер 30%.

В этом описании ссылка на «вариант осуществления», «некоторые варианты осуществления», «один вариант осуществления», «другой пример», «пример», «конкретный пример» или «некоторые примеры» обозначает, что конкретные свойство, структура, материал или характеристика, описанные в связи с вариантом осуществления или примером, включаются, по меньшей мере, в один вариант осуществления или пример по настоящему изобретению. Таким образом, появление таких выражений, как «в некоторых вариантах осуществления», «в одном варианте осуществления», «в варианте осуществления», «в другом примере», «в примере», «в конкретном примере» или «в некоторых примерах» в различных местах на протяжении этого описания необязательно относится к одному и тому же варианту осуществления или примеру по настоящему изобретению. Более того, конкретные свойства, структуры, материалы или характеристики могут сочетаться любым подходящим образом в одном или более вариантах осуществления или примерах.

Хотя объясняющие примеры представлены и описаны, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что представленные выше варианты осуществления не могут рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение, и изменения альтернативные варианты и модификации могут быть сделаны без отступления от сущности, принципов и объема настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения определен формулой изобретения и ее эквивалентами.


СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-1 из 1.
29.05.2018
№218.016.565c

Способ и устройство для детектирования хромосомных структурных аномалий

Предложены способ и устройство для детектирования хромосомных структурных аномалий. Представленный способ включает сегментирование хромосомного образца от целевого индивидуума, то есть множество пар прочтений, расположенных с двух концов исследуемых хромосомных фрагментов; выравнивание...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002654575
Дата охранного документа: 21.05.2018
Показаны записи 1-10 из 25.
10.05.2014
№216.012.c146

Способ и система для определения сигнала пакетного обращения

Настоящее изобретение относится к области мобильной связи. Технический результат изобретения заключается в улучшении правильного определения сигнала пакетного обращения (АВ).Способ определения сигнала пакетного обращения содержит шаги: приемный терминал осуществляет оценку упреждения по...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002515227
Дата охранного документа: 10.05.2014
10.12.2014
№216.013.0dc8

Устройство управляемого объекта, способ и система самооптимизации

Изобретение относится к области технологий сетей связи. Техническим результатом является обеспечение поддержки управления оперативными функциями самооптимизации. Раскрыты устройство управляемого объекта, способ и система самооптимизации. Способ содержит этап, на котором выполняют посредством...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002534945
Дата охранного документа: 10.12.2014
10.07.2015
№216.013.5fda

Ввод данных пользователем

Изобретение относится к мобильным телефонам. Техническим результатом является обработка конфигурации входного воздействия, обнаруженного в данный момент времени сенсорным дисплеем, для различения между конфигурацией входного воздействия кончиком пальца и протяженной конфигурацией входного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002556079
Дата охранного документа: 10.07.2015
20.09.2015
№216.013.7cf5

Способ и устройство для осуществления цифрового предыскажения основной полосы частот

Изобретение относится к технике связи и может быть использовано для осуществления цифрового предыскажения основной полосы частот канала передачи. Устройство для осуществления цифрового предыскажения основной полосы частот включает в себя канал передачи, включающий в себя цифроаналоговый...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002563586
Дата охранного документа: 20.09.2015
20.10.2015
№216.013.847c

Способ управления памятью вычислительной системы, блок управления памятью и вычислительная система

Изобретение относится к вычислительной технике. Технический результат заключается в переводе памяти, блокируемой пользовательским процессом, в автономный режим. Способ управления памятью вычислительной системы, в котором принимают запрос на выделение, отправляемый пользовательским процессом,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002565519
Дата охранного документа: 20.10.2015
10.11.2015
№216.013.8d2e

Способ получения алкиленоксида эпоксидированием олефина

Изобретение относится к способу получения алкиленоксида эпоксидированием олефина. Предложенный способ содержит стадии: (1) в условиях первого эпоксидирования олефина в присутствии первого твердого катализатора первый смешанный поток, содержащий растворитель, олефин и НО, подвергают...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002567749
Дата охранного документа: 10.11.2015
20.12.2015
№216.013.9c01

Способ, устройство и система для переноса ресурса

Изобретение относится к области процессорной обработки. Техническим результатом является надежный перенос ресурсов при сохранении высокоскоростной полосы пропускания между узлами и улучшении производительности системы. Способ переноса ресурса содержит этапы, на которых, когда осуществляется...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002571562
Дата охранного документа: 20.12.2015
10.03.2016
№216.014.c05d

Способ эпоксидирования олефина

Настоящее изобретение относится к способу эпоксидирования олефина, который включает эпоксидирование олефина пероксидом водорода в присутствии катализатора, представляющего собой молекулярное сито на основе силиката титана, и основной анионообменной смолы в условиях эпоксидирования олефина. При...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576620
Дата охранного документа: 10.03.2016
20.03.2016
№216.014.cbf4

Способ рафинирования сырого пропиленоксида и способ получения пропиленоксида

Настоящее изобретение относится к способу рафинирования сырого пропиленоксида и способу получения пропиленоксида, включающему способ рафинирования. В соответствии со способом рафинирования: сырой пропиленоксид вводят в первую колонну азеотропной дистилляции и подвергают азеотропной дистилляции,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002577850
Дата охранного документа: 20.03.2016
27.02.2016
№216.014.cf8e

Катализатор и способ его получения и способ эпоксидирования олефина

Настоящее изобретение относится к катализатору и способу его получения, а также способу эпоксидирования олефина с использованием катализатора. Катализатор содержит связующее вещество и силикат титана, причем связующее вещество является аморфным диоксидом кремния, указанный силикат титана имеет...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002575936
Дата охранного документа: 27.02.2016
+ добавить свой РИД