Результат интеллектуальной деятельности: Многофункциональная микрокамера и способ экспериментального отбора овоцидных химических соединений для обеззараживания (дезинвазии) поверхностей и объектов, контаминированных яйцами гельминтов

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, паразитологии, а именно к средствам и способам экспериментального отбора овоцидных химических соединений для обеззараживания (дезинвазии) поверхностей и объектов, контаминированных яйцами гельминтов возбудителей паразитарных болезней.

Профилактика гельминтозов - одна из основных задач санитарной гельминтологии. Ее важная составляющая - охрана окружающей среды от загрязнения инвазионным материалом. Из всех элементов окружающей среды почва, наряду с водоемами, наиболее часто подвергается обсеменению яйцами гельминтов. С загрязненной почвы они могут попадать на руки, зелень, овощи. Существует большая опасность передачи инвазионного материала через предметы обихода в детских и других общественных учреждениях. Велика вероятность заражения через окружающие предметы сотрудников лабораторий, в которых проводится исследование инвазированного материала. В связи с этим весьма важной и актуальной задачей является разработка новых эффективных антигельминтных овоцидов, а также их экспериментальный отбор из уже известных дезинфектантов.

Наиболее часто для определения овоцидной активности различных химических препаратов используют яйца нематод подотряда аскаридат (Askaris suum, Toxocara canis, Toxasaris leonina). Их высокая устойчивость к внешним воздействиям позволяет выявить наиболее эффективные дезинвазионные дезсредства. Менее активные препараты целесообразно испытывать на яйцах более чувствительных видов гельминтов, таких как Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana. Кроме того, Н. nana - представитель типа плоских червей (Plathelminthes), тогда как остальные виды относятся к типу круглых червей (Nemathelminthes). Испытание активности дезинфектанта на нескольких видах тест-объектов, имеющих разное систематическое положение, позволяет полнее описать спектр его действия.

Для поддержания благоприятной санитарной обстановки и профилактики распространения гельминтозов среди населения и домашних животных важно и актуально изучить в лабораторных условиях овоцидную активность различных новых химических соединений и дезинфектантов для обеспечения профилактической медицины и ветеринарии высокоэффективными овоцидами и технологиями дезинвазии поверхностей и объектов окружающей среды, контаминированных яйцами, личинками и онкосферами гельминтов.

Известен способ эксперимнтального отбора овоцидных химических соединений для обеззараживания поверхностей и объектов, контаминированных яйцами гельминтов, в основе которого стоит определение жизнеспособности яиц гельминтов после воздействия препарата с помощью оптической микроскопии по внешнему виду, подвижности и другим морфологическим признакам Романенко Н.А. Санитарная гельминтология. -М.: Медицина, 1982. - С. 53-62.

Недостатком известного способа является низкая достоверность результатов оценки эффективности средства из-за отсутствия четких объективных морфологических параметров и критериев определения живых и мертвых яиц гельминтов в оптическом микроскопе. Часто аномальные, уродливые яйца могут нормально развиваться, а погибшие яйца часто выглядят как жизнеспособные и т.д..

Известен также способ определения жизнеспособности зрелых (содержащих внутри сформированную личинку) яиц аскарид, власоглавов, остриц до и после воздействия препаратами путем нагревания предметного стекла с яйцами до 37-40°С, на термостатированном столике, который приводит к активному движению личинок [Методические указания МУК 4.2.2661-10. Методы санитарно-паразитологических исследований].

Недостатком известного способа является низкая достоверность результатов оценки овоцидной эффективности средства из-за присутствия в образцах большого числа яиц в переходном состоянии от состояния покоя до состояния постоянного активного движения.

Известен также способ определения жизнеспособности яиц гельминтов методом вторичной люминесценции. Способ осуществляют следующим образом, суспензию культуры яйц гельминтов, наносят на обезжиренное предметное стекло и препаровальной иглой равномерно распределяют яйца. Затем воду осторожно отбирают фильтровальной бумагой и окрашивают 2-5 каплями водного раствора акридинового оранжевого в разведении от 1:10000 до 1:50000 при экспозиции от 30 до 150 мин или другого флурохрома [Романенко Н.А., Падченко И.К.. Чебышев Н.В. Санитарная паразитология. - М.: Медицина, 2000. - С. 182-191]. Яйца отмывают от красителя водой, а затем накрывают покровным стеклом и просматривают под люминесцентным микроскопом

Жизнеспособность яиц определяют по свечению зародыша. Живой зародыш всегда излучает тусклый зеленый свет: от серо-зеленого до темно-зеленого, а погибший - светится «горящими» цветами: светло-зеленым, зеленым, желтым, оранжевым, красным. Скорлупа как живых так и погибших яиц бывает окрашена одинаково в зеленый.

Недостатками способа являются:

- низкая достоверность результатов оценки эффективности средства из-за наличия в образцах посторонних светящихся элементов;

- многочисленные стадии отмывки и центрифугирования проб яиц приводит к потери значительной части всплывших в суспензии исследуемого образца поврежденных, разрушенных и лизированных яиц, из-за большой разницы величины плотности содержимого интактных и разрушенных яиц, возникшей в результате воздействия овоцидами.

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому изобретению является способ испытания и отбора овоцидных химических соединений для обеззараживания объектов с твердым покрытием (помещений, пола, клеток и др.) (Симонов А.П. Методика испытания и отбора овоцидных химических соединений для обеззараживания объектов с твердым покрытием (помещений, пола, клеток и др.) // Бюллетень Всесоюзного ордена Трудов. Красного Знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина, 1977, вып. 19, с. 51-58). Способ осуществляют путем испытания яиц гельминтов в двух сериях. В первой - испытывают препарат на отмытых яйцах гельминтов. Яйца заливают тонким слоем дехлорированной воды и помещают в термостат при температуре 24°С для получения личинок различной зрелости. Степень развития последних контролируют периодически под микроскопом. Затем культуру личинок переносят в чашки Петри (по 600-800 в каждой) или в маленькие бюксы, удаляют излишки воды и затем заливают рабочими растворами (или эмульсиями) испытуемых веществ различных концентраций. После определенной экспозиции в растворе, яйца отмывают водой в чашках Петри не менее пяти раз или с помощью центрифугирования не менее двух раз. Затем культуру яиц помещают в термостат (24-26°С) для культивирования. Через 15-20 дней определяют жизнеспособность яиц в каждом варианте опыта методами обычной и вторичной люминесцентной микроскопии. Если в яйцах нет личинок, то их считают погибшими.

У яиц, взятых в опыт на стадии инвазионной личинки, определяют жизнеспособность оптической микроскопии по деформации зародыша и скорлупы, а методом флуоресценции по характеру свечения при обработке акридиновым оранжевым в разведении 1:10-500000, с экспозицией 120 мин. Для объективной оценки испытуемых веществ в каждом варианте опыта подсчитывают не менее 3200 яиц, в том числе живых и погибших, а затем высчитывают процент погибших. На основе выявленной жизнеспособности яиц определяют эффективность препарата.

Основными недостатками способа являются:

- высокая погрешность результатов оценки обеззараживающей (дезивазионной) эффективности исследуемых химических средств и дезинфектантов;

- трудоемкость способа, из-за многочисленных технически несовершенных стадий подготовки, отмывки и препарирования образцов яиц к термостатированию и исследованию в оптическом и люминесцентном микроскопах;

- отсутствие стадии нейтрализации остатков химических средств, дезинфектантов после воздействия ими на яйца гельминтов действие следов (молекул) химических реагентов на яйца не прерывается, что часто является источником возникновения различных артефактов и искажений на стадии визуализации и определения в микроскопе количества живых и мертвых яиц в образцах, что не позволяет объективно оценить овоцидный эффект химических средств и дезинфектантов;

- высокие потери поврежденных, разрушенных и лизированных яиц (всплывших яиц с более низкой плотностью в водной суспензии образца) на стадиях центрифугирования и многократных отмывок биоматериала от химического реагента, красителя в чашке Петри, или на предметном стекле, или в маленьких бюксиках путем сливания или отсасывания жидкости с поверхности осадка биообразца значительно искажают результаты определении числа живых и мертвых яиц после воздействия овоцидами;

- техническое несовершенство способа может являться источником нарушения требований биологической безопасности персоналом паразитологических лаборатории и д.р.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является техническое совершенствование способа, повышение эффективности испытаний и отбора овоцидных химических соединений, повышение достоверности результатов определения, снижение трудоемкости процесса реализации способа.

Технический результат достигается за счет того, что все стадии испытаний и отбора химических соединений для обеззараживания (дезинвазии) поверхностей и объектов с твердым покрытием проводят в многофункциональной микрокамере, которая представляет собой цельнолитое изделие конической формы с внешним диаметром D₁-8 мм в верхней части и общей высотой Н-7 мм., основание представляет собой расширение нижней части изделия с диаметром D₁-8 мм и высотой h-1 мм,. внутренняя рабочая поверхность микрокамеры в верхней части имеет диаметр d₁-7 мм, а в нижней части d₂-3,2 мм, толщина стенок S-0,5 мм для обеспечения необходимой светопроницаемости, а их наклон относительно основания составляет 75°, в области основания предусмотрена радиусная фаска R-2 мм, которая направлена на устранение оптического мениска, возникающего при работе с жидкостями, также в основании предусмотрена улавливающая мембрана (трековая мембрана) (2) диаметром d₃-4,2 мм, представляющая собой тонкую полимерную пленку с порами различного диаметра, от 0,4 до 2 мкм, к основанию микрокамеры крепится бесщелевым методом сплавления или методом прикрепления с использованием химических составов.

Способ экспериментального отбора овоцидных химических соединений для обеззараживания (дезинвазии) поверхностей и объектов, контаминированных яйцами гельминтов, включающий многократную отмывку яиц от среды, от исследуемого препарата, с последующей инкубацией в термостат при температуре 24°С и исследованием их с помощью люминесцентного микроскопа, осуществляют в многофункциональной микрокамере, описанной выше, в микрокамеру вносят суспензию яиц в объеме 0,1-0,2 мл и раствор исследуемого химического соединения, после воздействия на яйца химическое соединение удаляют 0,1-0,2 мл стерильной воды, а воду из микрокамеры удаляют путем помещения ее на стерильную сухую фильтровальную бумагу, затем в микрокамеру вносят 0,1-0,2 мл универсального нейтрализатора, трижды отмывают пробу яиц от нейтрализатора стерильной водой, яйца в микрокамере термостатируют при 24-28°С в течение 7-20 дней, пробу яиц обрабатывают флурохромом, отмывают от красителя и исследуют в обычном и люминесцентном микроскопе.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. В испытаниях многофункциональной микрокамеры и способа экспериментального отбора овоцидных химических средств для обеззараживания (дезинвазии) поверхностей и объектов, контаминированых яйцами гельминтов использовали дезинфицирующее средство «Главхлор Экстра», а в качестве биоагента использовали яйца свиной аскариды (Askaris suum).

Все стадии способа проводят в многофункциональной микрокамере: В три микрокамеры вносят по 0,1 мл суспензии отмытых яиц аскариды свиной в количестве примерно 450-500 штук; все микрокамеры помещают в чашку Петри с небольшим количеством дехлорированной воды; в первую микрокамеру (контроль) вносят 0,1 мл стерильной дистиллированной воды, во вторую микрокамеру вносят 0,1 мл 2,0% раствора дезинфицирующего средства «Главхлор Экстра» (по актимвному хлору) и выдерживают 240 мин, в третью микрокамеру вносят 0,1 мл 4,0% раствора средства «Главхлор Экстра» при времени воздействия 120 мин; по истечении времени воздействия средство из микрокамер удаляли путем внесения в микрокамеру 0,1 мл стерильной водопроводной воды, для более быстрого удаления воды микрокамеру ставят на полоску стерильной сухой фильтровальной бумаги; нейтрализацию остатков химического средства (дезинфектанта) в исследуемом образце проводят путем внесения в микрокамеру по 0,1 мл универсального нейтрализатора с выдержкой 1 мин; процедуру отмывки образца от нейтрализатора проводят трижды; для активации личинок в яйцах гельминтов в каждую микрокамеру вносят по 0,1 мл стерильной воды и термостатируют при температуре 24°С в течение 10 суток; ежедневно яйца гельминтов просматривают непосредственно в микрокамере с помощью оптического или люминесцентного микроскопа для выявления активно двигающихся личинок в яйцах.

После завершения термостатирования образцов в каждую микрокамеру вносят по 0,1 мл водного раствора акридинового оранжевого в разведении от 1:10000 и выдерживают 120 мин при комнатной температуре (19±2)°С. После обработки флурохромом биообразцы также отмывают в микрокамере стерильной дистиллированной водой. Просмотр в люминесцентном микроскопе проводят непосредственно в многофункциональной микрокамере.

Жизнеспособность яиц определяют по свечению зародыша. Живая личинка всегда излучает тусклый зеленый свет: от серо-зеленого до темно-зеленого, а погибшая - светится яркими цветами: светло-зеленым, зеленым, желтым, оранжевым, красным. Скорлупа как живых, так и погибших яиц бывает окрашена одинаково в зеленый.

Просмотр и подсчет живых и мертвых яиц гельминтов в образцах с помощью люминесцентного микроскопа показал, что в контрольной микрокамере число живых яиц составляло не более 92% от общего числа яиц в пробе. В микрокамере, где обработку яиц проводили 2,0% раствором дезинфицирующего средства «Главхлор Экстра» в течение 240 мин была установлена примерно 100% гибель яиц. При обработки яиц 4,0% раствором химического соединения в течение 120 мин число погибших яиц в микрокамере составляло не менее 99,0% от общего числа яиц в пробе.

Пример 2. В испытаниях многофункциональной микрокамеры и способа экспериментального отбора овоцидных химических средств для обеззараживания (дезинвазии) поверхностей и объектов, контаминированых яйцами гельминтов использовали дезинфицирующее средство «ТориОКСИ», а в качестве биоагента использовали яйца возбудителей энтеробиоза (Enterobius vermicularis).

Все стадии способа проводят в многофункциональной микрокамере: в пять микрокамер вносят по 0,2 мл суспензии отмытых яиц возбудителя энтеробиоза в количестве примерно 450-500 штук; все микрокамеры помещают в чашку Петри с небольшим количеством дехлорированной воды; в первую микрокамеру (контроль) вносят 0,2 мл стерильной дистиллированной воды, во вторую и третью микрокамеры вносят по 0,2 мл 10,0% раствора дезинфицирующего средства «ТориОКСИ» (по препарату) и выдерживают 240 мин, в четвертую и пятую микрокамеры вносят по 0,2 мл 12,0% раствора средства «ТориОКСИ» и выдерживают 120 мин; средство из микрокамер удаляют путем внесения в микрокамеры по 0,2 мл стерильной водопроводной воды с последующим удалением из них воды путем помещения микрокамер на стерильную сухую фильтровальную бумагу, процедуру отмывки образцов от средства проводят трижды; нейтрализацию остатков дезинфектанта в исследуемом образце проводят путем внесения в микрокамеру по 0,2 мл универсального нейтрализатора с выдержкой 3-5 мин; процедуру отмывки образца от нейтрализатора проводят трижды также путем внесения в микрокамеру по 0,2 мл стерильной воды с последующим удалением воды из микрокамер стерильным сухим бумажным фильтром; для активации живых личинок в яйцах гельминтов все микрокамеры помещают в чашку Петри с небольшим количеством стерильной воды, в каждую микрокамеру вносят по 0,2 мл стерильной воды и термостатируют при температуре 24°С в течение 7-14 суток; ежедневно яйца гельминтов просматривают помещая микрокамеру в оптический или люминесцентный микроскоп для выявления активнодвигающихся личинок в яйцах.

После завершения термостатирования образцов в каждую микрокамеру вносят по 0,2 мл водного раствора акридинового оранжевого в разведении от 1:10000 и выдерживают 120 мин при комнатной температуре (18±2)°С. После обработки яиц флурохромом проводят также трехкратную отмывку образцов в микрокамере стерильной дистиллированной водой. Воду из каждой микрокамеры удаляют также с помощью сухого бумажного фильтра.

Просмотр окрашенных образцов яиц флурохромом в люминесцентном микроскопе проводят непосредственно в многофункциональных микрокамерах.

Жизнеспособность яиц определяют по свечению зародыша. Живая личинка энтеробиоза излучает тусклый зеленый свет: от серо-зеленого до темно-зеленого, а погибшая - светится яркими цветами: светло-зеленым, зеленым, желтым, оранжевым, красным. Скорлупа как живых, так и погибших яиц бывает окрашена одинаково в зеленый.

Просмотр и подсчет живых и мертвых яиц гельминтов в образцах проводят с помощью люминесцентной микроскопии. Было установлено, что в контрольной микрокамере число живых яиц составляло не более 70% от общего числа яиц в пробе. В двух микрокамерах после обработки яиц 10,0% раствором дезинфицирующего средства в течение 240 мин было установлено примерно 97% гибели яиц. При обработке яиц 12,0% раствором дезинфектанта в течение 120 мин число погибших яиц в микрокамере составляло не менее 95,0% от общего числа яиц в пробе.

Таким образом, полученные результаты испытаний свидетельствуют о том, что предлагаемое новое техническое решение позволило повысить эффективность испытаний и отбора овоцидных химических соединений для обеззараживания поверхностей и объектов с твердым покрытием, увеличить уровень достоверности результатов определения овоцидной активности химических соединений, снизить трудоемкость процесса реализации способа путем уменьшения числа стадий и их продолжительности, уменьшить количество артефактов на стадии определения количества живых и мертвых яиц, повысить уровень биологической безопасности при реализации способа, за счет того, что все стадии способа экспериментального отбора овоцидных химических соединений, включающие многократную отмывку яиц от среды, воздействие на яйца гельминтов химическим средством, отмывку яиц от исследуемого препарата, нейтрализацию химического соединения, отмывку яиц от нейтрализатора, инкубацию яиц в термостате, обработку яиц раствором флюрохрома, а также исследование яиц в оптическом и люминесцентном микроскопе, осуществляются в одной светопрозрачной многофункциональной микрокамере.