Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 182 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты)

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для лабораторной диагностики туляремии, как в практическом здравоохранении, так и для научных исследований в области микробиологии, эпидемиологии и патогенеза туляремии.

Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция, этиологическим агентом которой является Francisella tularensis, грамотрицательная внутриклеточная бактерия, регулярно вызывающая эпидемические вспышки, как среди животных, так и людей.

Вид F. tularensis имеет четыре подвида: holarctica, mediasiatica, novicida и tularensis. Особую опасность представляет F. tularensis subsp. tularensis. Установлено, что вдыхание 10 бактерий способно вызвать заболевание у человека (McCrumb F.R. 1961. Aerosol infection of man with Pasteurella tularensis. Bacteriological Reviews 25:262-267). Из-за высокой инфекционности при аэрогенном пути заражения F. tularensis классифицируется как биоагент 1 уровня опасности (категория А).

Несмотря на то, что «золотым» стандартом» для диагностирования туляремии все еще является культивирование микроорганизма, обычно оно не проводится из-за невысокой чувствительности и требовательности к условиям работы. Для обнаружения и идентификации F. tularensis испробованы такие методы, как биосенсоры, культивирование, иммунохроматографический анализ, ПЦР, биочипы на жидкой или твердой основе, методы аналитической химии (газовая хроматография, масс-спектрометрия и т.д.). Среди этих методов для обнаружения F. tularensis доминирующим является ПЦР. При мониторинге природных очагов туляремии и лабораторном исследовании материала на наличие F. tularensis только с использованием ПЦР возможно выявление единичных бактерий возбудителя туляремии (высокочувствительный и высокоспецифичный nested-вариант) (Татарников С.А., Мазепа А.В., Балахонов С.В. Оптимизация Nested-варианта полимеразной цепной реакции для мониторинга природных очагов туляремии. Инфекция и иммунитет. 2013. Т. 3. №2. С. 175).

Существующие коммерческие тест-системы и экспериментальные образцы диагностических препаратов позволяют охарактеризовать штаммы на наличие генетических детерминант, специфичных для вида F. tularensis, различных подвидов (гены chi1f, RD1 и др.), штаммов разной вирулентности (pdpA, pdpD) и т.д. (Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. Под редакцией Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. - М.: ЗАО «Шико», 2013. - 560 с., Татарников С.А., Мазепа А.В., Дубровина В.И., Войткова В.В. Идентификация геномных областей pdpD и pdpA у туляремийного микроба разных подвидов. В книге «Биологическая безопасность в современном мире». 2009. С. 69-71).

Исследования молекулярно-генетической амплификационной технологии - loop-mediated isothermal amplification (LAMP) - показали высокую специфичность и амплификационную эффективность, которая достигается при изотермальных условиях реакции (Kaneko H., Kawana Т., Fukushima Е., Suzutani Т. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. J. Biochem. Biophys. Methods. 2007. 70(3):499-501; Soto E., Hawke J.P., Fernandez D., Morales J.A. Francisella sp., an emerging pathogen of tilapia, Oreochromis niloticus (L.), in Costa Rica. J Fish Dis. 2009; 32(8):713-22). В LAMP используется 4 праймера, которые гомологичны шести участкам гена-мишени. Реакция протекает при постоянной температуре с использованием фермента, который катализирует реакцию синтеза новых цепей со смещением старых. Амплификацию и детектирование гена можно осуществить за одну стадию путем инкубации смеси образцов, праймеров, ДНК-полимеразы с функцией вытеснения цепей и субстратов при постоянной температуре (около 65°С). Эффективность амплификации очень высока, в течение 15-60 минут ДНК амплифицируется 10⁹-10¹⁰ раз. Из-за высокой специфичности присутствие амплифицированного продукта однозначно указывает на присутствие гена-мишени.

Известно об использовании подобного метода для выявления присутствия Francisella piscicida, этиологического агента франциселлеза атлантической трески (Gadus morhua) (Caipang С.М., Kulkarni A., Brinchmann M.F., Korsnes K., Kiron V. Detection of Francisella piscicida in Atlantic cod (Gadus morhua L) by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction. Vet J 2010; 184(3): 357-61). Для детекции гена GroEL возбудителя был разработан набор праймеров (два внешних и два внутренних). Подбор условий LAMP показал оптимальную температуру реакции 63°С в течение 1 ч с использованием бактериальной геномной ДНК в качестве матрицы. Продукты реакции визуализировали в ультрафиолетовом свете и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Метод оказался высоко специфичен для обнаружения F. piscicida и в 100 раз более чувствителен, чем обычная ПЦР. Применение LAMP-анализа возможно не только для ДНК штаммов, но и для суспензий органов атлантической трески. Однако для патогенных для человека видов F. tularensis информации о разработанных праймерах и (или) диагностических LAMP-тестах в открытых источниках не обнаружено.

Известен фермент для проведения петлевой изотермической амплификации - Bst-полимераза, выделенная из Bacillus stearothermophilus (Nagamine K., Watanabe K., Ohtsuka K., Hase Т., Notomi Т., 2001. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a non-denatured template. Clin. Chem., 47: 1742-1743). Bst-полимераза активна при температуре до 66°С, но оптимальной для нее является температура 60°С. Успех изотермической амплификации зависит от активности ферментов по вытеснению цепи и от их способности проходить такие сложные области ДНК, как шпильки.

Однако, в научных публикациях есть сообщения о появлении ложно-положительных сигналов при работе с Bst-полимеразой.

Проведенный поиск по патентным базам и научно-техническим источникам информации показал отсутствие сведений об отечественных наборах, предназначенных для выявления F. tularensis методом петлевой изотермической амплификации. Поэтому, существует необходимость создания такого диагностикума для быстрой, чувствительной и специфичной детекции ДНК туляремийного микроба.

Раскрытие сущности изобретения.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для быстрого, специфичного и чувствительного способа выявлении бактерий вида F. tularensis в биологических образцах, основанного на петлевой изотермической амплификации фрагмента гена-мишени.

Технический результат достигается тем, что предложен набор оригинальных праймеров SEQ ID NO: 2 (прямой внешний праймер fopFt182-F3 F. tularensis);

SEQ ID NO: 3 (обратный внешний праймер fopFt182-B3 F. tularensis);

SEQ ID NO: 4 (прямой внутренний праймер fopFt182-FIP F. tularensis);

SEQ ID NO: 5 (обратный внутренний праймер fopFt182-BIP F. tularensis) для способа детекции туляремийного микроба, при котором используется фермент SD-полимераза (Ignatov K.В., Barsova E.V., Fradkov A.F., Blagodatskich K.A., Kramarova T.V., Kramarov V.M. A strong strand displacement activity of thermostable DNA polymerase markedly improves the results of DNA amplification. BioTechniques. 2014; 57:81-7) в реакции петлевой изотермической амплификации в следующих условиях: предварительный прогрев смеси 92°С - 2 мин, амплификация 60°С - 60 мин, детекция продукта амплификации осуществляется при помощи электрофореза в агарозном геле по характерной электрофореграмме (вариант 1) или окрашивания продуктов реакции амплификации с помощью интеркалирующего красителя SYBR Green I (вариант 2).

Технический результат также достигается благодаря использованию в качестве целевой мишени гена ген fopA, кодирующего внешний белок мембраны, который является уникальным белком F. tularensis.

Обоснование выбора олигонуклеотидных праймеров и ДНК-мишени.

Белки наружной мембраны часто являются стратегически важными для облегчения инвазии клетки-хозяина, выживания внутри клетки, а также факторами вирулентности и уклонения от иммунного ответа клетки-хозяина. Кроме того, они обладают протективными свойствами. Выбранный ген fopA кодирует внешний белок мембраны, который является уникальным белком F. tularensis. Последовательность SEQ ID NO: 1 (ген-мишень fopA) для подбора праймеров с целью детекции ДНК возбудителя туляремии методом петлевой изотермической амплификации была получена из базы GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США).

В качестве положительного контроля в экспериментах использовали штамм F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микроорганизма в концентрациях от 1×10⁶ м.к./мл до 1×10¹ м.к./мл. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителей туляремии Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».

Чувствительность реакции амплификации с праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами (табл. 1, фиг. 1-4) и примерами (1-3).

Таблица 1. Характеристика подобранных олигонуклеотидных праймеров для детекции возбудителя туляремии.

Фиг. 1. Последовательность SEQ ID NO: 1 - нуклеотидная последовательность гена fopA из генома штамма Francisella tularensis subsp. tularensis SCHU S4. Серыми прямоугольниками выделены участки отжига праймеров и комплементарные им последовательности.

Фиг. 2. Определение специфичности LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 для детекции F. tularensis с помощью SD-полимеразы.

Обозначения: 1 - ДНК F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ; 2 - ДНК F. tularensis subsp.holarctica 503; 3 - ДНК F. tularensis subsp. tularensis Schu S4; 4 - ДНК F. tularensis subsp. mediasiatica 120; 5 - ДНК F. tularensis subsp. mediasiatica A678; 6 - F. tularensis subsp. mediasiatica A198; 7 - ДНК В. anthracis СТИ-1; 8 - ДНК Y. pestis subsp. pestis bv. antiqua И3449; 9 - ДНК Y. pseudotuberculosis C79; 10 - ДНК V. cholerae Eltor M878; 11 - ДНК Escherichia coli JM83; 12 - ДНК В. suis 1330; 13 - ДНК В. abortus 19, 14 - ДНК В. melitensis 16-М, 15 - ДНК L. pneumophila subsp. pneumophila, серогруппа 1, АТСС 33152; 16 - ДНК L. pneumophila subsp. pneumophila, серогруппа 6, АТСС 33215; 17 - отрицательный контроль LAMP (вода); 18 - маркер молекулярного веса (100-1000 п.н.).

Фиг. 3 Результаты определения чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 с помощью SD-полимеразы. Использована ДНК из вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ.

Обозначения: 1 - маркер молекулярного веса (100-1000 п.н.); 2 - ДНК из 1×10⁶ м.к.; 3 - ДНК из 1×10⁵ м.к.; 4 - ДНК из 1×10⁴ м.к.; 5 - ДНК из 1×10³ м.к.; 6 - ДНК из 1×10² м.к.; 7 - ДНК из 1×10¹ м.к.; 8 - отрицательный контроль ПЦР (вода).

Фиг. 4. Результаты определения чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 с помощью SD-полимеразы и окрашивания продуктов реакции SYBR Green I. Использована ДНК из вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ.

Обозначения: 1 - ДНК из 1×10⁶ м.к.; 2 - ДНК из 1×10⁵ м.к.; 3 - ДНК из 1×10⁴ м.к.; 4 - ДНК из 1×10³ м.к.; 5 - ДНК из 1×10² м.к.; 6 - ДНК из 1×10¹ м.к.; 7 - отрицательный контроль ПЦР (вода).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для детекции ДНК возбудителей туляремии методом петлевой изотермической амплификации.

На основе анализа in silico нуклеотидных последовательностей возбудителя туляремии, присутствующих в базе данных Genbank, для конструирования прямого и обратного внешних праймеров F3 и В3, прямого и обратного внутренних праймеров FIP и BIP был выбран участок генома F. tularensis размером 1882 п.н. (GenBank: AJ749949.2), кодирующий белок внешней мембраны F. tularensis. К участку гена SEQ ID NO: 1 (фиг. 1) подобраны праймеры SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5. Расчетная длина предполагаемого ампликона, фланкируемого праймерами SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, составила 150 п.н. (табл. 1). На Фиг. 1 показаны участки отжига праймеров и комплементарные им последовательности, которые выделены прямоугольниками серого цвета.

При выборе олигонуклеотидных праймеров использовали программу для расчета праймеров он-лайн Primer Explorer 5 (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html). При подборе праймеров руководствовались требованиями к олигонуклеотидам, используемым в LAMP. Анализ формирования вторичных структур (димеров, шпилек) выбранными праймерами проводили с помощью компьютерной программы mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form). Структуры всех олигонуклеотидов сравнивались с помощью информационного ресурса NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с последовательностями ДНК, размещенными в базе данных GenBank. При проведении этого анализа олигонуклеотиды с существенной гомологией с ДНК каких-либо других организмов исключали. Для определения специфичности праймеров моделировали ПЦР in silico в отношении секвенированных геномов микроорганизмов с помощью In silico PCR amplification (http://insilico.ehu.es/PCR/). Показана теоретическая пригодность праймеров для успешной инициации реакции амплификации и гибридизации.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для детекции возбудителя туляремии методом петлевой изотермической амплификации.

Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1х SD-буфер (РусЭнзим, Россия), 40 ед. SD-полимеразы (РусЭнзим, Россия), 3,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ каждого дНТФ, 4 праймера: 0,2 мкМ SEQ ID NO: 2 (fopFt182F3), 0,2 мкМ SEQ ID NO: 3 (fopFt182B3), 0,8 мкМ SEQ ID NO: 4 (fopFt182BIP), 0,8 мкМ SEQ ID NO: 5 (fopFt182FIP), 5 мкл матрицы. Реакцию проводили при температуре 60°С в течение 60 мин с предварительным прогревом при температуре 92°С в течение 2 мин на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология). Детекцию продуктов LAMP проводили с помощью электрофореза в 1,2% агарозном геле в ТАЕ-буфере. (Вариант 1.) Или детекцию продуктов LAMP проводили с помощью окрашивания амплификатов интеркалирующим красителем SYBR Green I. Покраска образцов проводилась непосредственно после проведения реакции путем добавления красителя в реакцию до конечной концентрации 10х. (Вариант 2). В обоих вариантах детекции визуализацию осуществляли на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 312 нм.

Результат амплификации каждого штамма F. tularensis считался положительным в случае появления полос в виде лестницы (вариант 1) или по появлению ярко-зеленого окрашивания после добавления SYBR Green I к амплификатам (вариант 2). Фиг. 2 отображает электрофореграмму, полученную при амплификации ДНК штаммов возбудителя туляремии с набором праймеров, подобранных к последовательности SEQ ID NO: 1.

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров к последовательности SEQ ID NO: 1 для идентификации ДНК возбудителя туляремии.

Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток F. tularensis. Штаммы франциселл выращивали на чашках Петри с «FT-агаром» с добавлением полимиксина В (100 мкг/мл) в течение 48 ч при температуре (37+1)°С. Готовили бактериальные взвеси клеток в 2 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-59-85 П), что соответствует 5×10⁹ м.к./мл для туляремийного микроба. Затем разводили в 0,9% стерильном растворе натрия хлорида таким образом, чтобы концентрация возбудителей туляремии составляла от 1×10⁶ до 1×10¹ м.к./мл. Выделение ДНК из чистых культур туляремии и гетерологичных микроорганизмов проводили путем нуклеосорбции и лизиса клеток гуанидинтиоцианатом с помощью набора «ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.

Учитывая, что возбудитель туляремии относится к агентам I группы патогенности, пробоподготовку и обеззараживание материала для проведения ПЦР осуществляли согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» и МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией».

Специфичность разработанных праймеров оценена на коллекции из 18 штаммов, из которых 6 штаммов Francisella tularensis и 12 штаммов гетерологичных микроорганизмов (4 штамма L. pneumophila и по 1 штамму Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis, Bacillus anthracis, V. cholerae, Escherichia coli, B. suis, B. abortus, B. melitensis). Оценка специфичности показала отсутствие продуктов амплификации с ДНК гетерологичных штаммов.

Чувствительность праймеров оценивали с помощью проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ. Анализ результатов показал, что чувствительность разработанных праймеров составила 1×10³ м.к в пробе (фиг. 3, фиг. 4).

Таким образом, разработанные праймеры могут быть использованы для обнаружения ДНК возбудителя туляремии и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя туляремии в пробах чистых культур. В результате проведенной оценки установлено, что выбранные праймеры для детекции возбудителей туляремии методом петлевой изотермической реакции обладают 100% специфичностью и чувствительностью - 1×10³ м.к. в пробе.