Способ повышения антибактериальной активности фурацилина in vitro

Изобретение относится к области получения микрокапсул фурацилина с целью перевода их в форму, обладающую повышенной антибактериальной активностью и способную образовывать устойчивые водные дисперсии. Усовершенствованный способ обеспечивает упрощение и ускорение процесса получения микрокапсул с заданным набором свойств.

Известен способ получения композиции для доставки лекарственных средств (патент RU 2589823, 2016) которая содержит полупроницаемое покрытие, частицы лекарственного средства, и агент, придающий растворимость этому лекарственному средству. Частицы лекарственного средства должны иметь эффективный средний размер частиц приблизительно 2 мкм и поверхностный стабилизатор, адсорбированный на поверхности частиц лекарственного средства. Недостатком является сложный состав продукта и техническая сложность выполнения способа.

Известен способ получения микрокапсулированной формы терапевтического белка супероксиддисмутазы для перорального применения (патент RU 2583923, 2016), который заключается во введении супероксиддисмутазы в пористые кальций карбонатные (СаСО₃) ядра, предварительно полученные методом соосаждения растворов Na₂CO₃ и CaCl₂×2H₂O и дальнейшем формировании альгинатных микрокапсул, содержащих эти ядра. Недостатком является техническая сложность выполнения способа.

Известен способ получения супрамолекулярного комплекса с никлозамидом (RU 2588368, 2016), в котором никлозамид с поливинилпирролидоном в соотношении 1:5 по весу подвергается совместной механохимической обработке в валковой шаровой мельнице с добавлением 700 г металлических шаров в течение 2 часов при вращении барабана со скоростью 90 об/мин до получения частиц супрамолекулярного комплекса размером до 10 мкм. Изобретение направлено на повышение водорастворимости, биодоступности и антигельминтной эффективности никлозамида при снижении его дозы более чем в 10 раз. Недостатком является невозможность получения микрокапсулы указанным способом и высокая стоимость оборудования.

Известен способ получения микрокапсул (патент RU 2316390, 2008), в котором для формирования оболочки использовалась метилцеллюлоза с содержанием метоксильных групп от 27,5 до 32%. Недостатком является необходимость использования метилцеллюлозы со строго определенным содержанием метоксильных групп, а также точное соблюдение температурного режима.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения микрокапсул лекарственных препаратов (патент RU 2582274, 2016) путем диспергирования капсулируемого вещества в растворе полимера, в качестве которого использованы альгинат натрия и гуаровая камедь, и осаждения полимера на поверхности частиц дисперсии путем добавления осадителя, в качестве которого использовался ацетон или этанол.

Технической задачей изобретения является разработка способа повышения антибактериальной активности фурацилина путем его микрокапсулирования в водорастворимые полимеры.

Технический результат достигается тем, что способ повышения антимикробной активности фурацилина in vitro осуществляют путем диспергирования капсулируемого вещества в растворе полимера и осаждения полимера на поверхности частиц дисперсии, в качестве капсулируемого вещества используют фурацилин, в качестве раствора полимера - 1,0% масс. раствор альгината натрия в воде или 0,5% масс. раствор гуаровой камеди в воде или 3,0% масс. раствор поливинилпирролидона в воде или 3,0% масс. раствор поливинилового спирта в воде или 1,0% масс. раствор гидроксипропилметилцеллюлозы в воде, а в качестве диспергатора - неионный солюбилизатор и эмульгатор Cremophor® EL, взятый в количестве 2,0% масс. от массы капсулируемого вещества, представляющий собой полиоксиэтилированное касторовое масло, осаждение осуществляют при температуре 3-5°С насыщенным раствором хлорида натрия или ацетоном или этанолом в объеме, превышающем объем раствора полимера в 1,3 раза в случае использования поливинилового спирта и поливинилпирролидона; 1,2 раза в случае раствора альгината натрия; 0,6 раз в случае использования раствора гуаровой камеди.

Выбор полимеров обусловлен широким использованием альгината натрия и гуаровой камеди, например в медицине (в качестве антацида), пищевой промышленности (загустители) и в косметологии. Применение альгината натрия основано на его способности образовывать гели, желеобразные вещества, а так же он широко применяется как оболочка для микрокапсулирования. Гуаровая камедь (или гуаран) помимо использования в пищевой промышленности в качестве стабилизатора, загустителя и структуратора, обладает биологическим действием как физиологическое слабительное, нормализующее кишечную проницаемость и кишечную микрофлору, как детоксифицирующее и снижающее уровень холестерина средство, а также как средство, тормозящее развитие атеросклероза и ожирения.

ПВС применяется в качестве плазмозаменителя при переливании крови. Очищенный от примесей низкомолекулярный поливиниловый спирт используют для изготовления препарата «йодинол», в растворах для глазных капель и контактных линз в качестве лубриканта. Некоторые марки низкомолекулярного поливинилового спирта используют в пищевой промышленности (пищевая добавка Е1203) как глазирующий агент и компонент, обеспечивающий связывание воды. При микрокапсулировании ПВС применяется как в качестве ПАВ, так и в качестве полимера оболочки.

ПВП также очень широко применяется в медицине. В зависимости от молекулярного веса поливинилпирролидон может быть использован для связывания токсических веществ, сравнительно быстро выводящихся из организма (молекулярный вес 10000-15000), как кровезаменитель (молекулярный вес 30000-40000). Для длительного связывания в организме некоторых химических веществ в целях пролонгации действия новокаина, инсулина, некоторых антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, тетрациклины), салицилатов, барбитуратов, ряда гормонов и некоторых других лекарств. Для этих целей используется ПВП с высоким молекулярным весом (50000-60000). Так, совместное использование с этим полимером новокаина позволяет продлить его обезболивающее действие от нескольких часов до трех - четырех или даже до девяти дней.

Фурацилин (нитрофурал) относится к антибактериальным средствам, действующим на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы - стафилококки, стрептококки, дизентерийную и кишечную палочки, сальмонеллу, возбудителей газовой гангрены. Все нитрофурановые лекарственные средства очень мало или не растворимы в воде (0,02%), чувствительны к свету. Поэтому, инкапсулирование фурацилина в водорастворимые полимеры позволит не только повысить его биодоступность и способность растворяться в воде, но и предотвратить нежелательное влияние факторов окружающей среды.

Cremophor® EL, представляет собой полиоксиэтилированное касторовое масло и является неионным солюбилизатором и эмульгатором. Этот продукт солюбилизирует или эмульгирует растворимые в жирах витамины A, D, Е и K в водных растворах для перорального и наружного введения. В водноспиртовых растворах Cremophor® EL очень легко переводит в растворимую форму эфирные масла. С использованием Cremophor® EL могут быть приготовлены также водные растворы гидрофобных лекарственных препаратов (например, препаратов миконазол, гексетидин, клотримазол, бензокаин). Применение при микрокапсулировании в качестве ПАВ препарата Cremophor® EL позволит стабилизировать образующуюся дисперсию, предотвратить слипание микрокапсул на стадии их получения и облегчить процесс выделения микрокапсул. Cremophor® EL обеспечивает повышение растворимости микрокапсулированного фурацилина по сравнению с другими используемыми ранее ПАВ.

В качестве осадителя полимеров использовался насыщенный раствор NaCl, который удаляется на стадии фильтрования, а его следовые количества никак не влияют на качество образовавшегося продукта. Применение раствора NaCl, кроме того, значительно удешевляет процесс микрокапсулирования. Используемый в качестве альтернативного осадителея ацетон легко удаляется из микрокапсулированного продукта уже на стадии фильтрования и далее в процессе высушивания, так как обладает достаточно низкой температурой кипения.

Работа при температурах 3-5°С обеспечивает максимально полное осаждение формирующейся дисперсии микрокапсул. Использование небольшого избытка осадителя (насыщенного раствора хлорида натрия, или ацетона, или этанола) позволяет полимеру полностью перейти из водного раствора в твердую фазу и закрепиться на поверхности капсулируемого вещества.

Способ осуществляется следующим образом.

К 0,5-1,0% масс. водному раствору полимера (в случае использования гуаровой камеди или альгината натрия) или 3,0% масс.(в случае использования ПВП или ПВС) при непрерывном перемешивании добавляют раствор фурацилина в диметилформамиде (ДМФА) или диметилсульфоксиде (ДМСО). Количество полимера и вещества варьируется в соответствии с поставленной задачей. Диспергирование системы осуществляют перемешиванием на магнитной мешалке. Процесс ведут в присутствии поверхностно-активного вещества, взятого в количестве 2,0% масс.от массы капсулируемого вещества. Таким образом, методом переосаждения получают тонкую дисперсию капсулируемого вещества в водном растворе полимера. Не останавливая диспергирования и постоянно охлаждая реактор, в реакционную смесь по каплям приливают осадитель - насыщенный раствор хлорида натрия или ацетон. По окончании осаждения полимера, сформировавшиеся капсулы отфильтровывают на фильтре Шотта (ВФ-1-40 пор. 16), промывают спиртом или ацетоном, сушат на воздухе или в сушильном шкафу.

Количественный анализ микрокапсул осуществлялся методом градуировочного графика на спектрометре УФ/видимой области спектра UV-1800 (фирмы «Shimadzu») в интервале длин волн 500-200 нм в кювете с длинной светопоглощающего слоя 1 см, в интервале оптической плотности 0,0÷3,5.

Параллельно количественный анализ микрокапсулированных продуктов проводили методом ВЭЖХ с масс- и УФ-детекторами на хроматографе Waters MSD SQD-ESI (офВЭЖХ; детекторы: спектрофотометрический, 220 нм, масс-спектрометрический, ESI, 95-700 Da, source t - 140°, desolvataion t - 400°, cone 40V, capillare 3kV; колонка Acquity ВЕН C18 2.1mm × 50mm*1.7um; подвижная фаза: вода (0,1% муравьиная кислота) - ацетонитрил (0,1% муравьиная кислота); режим элюирования - градиентный: 0,4 мл/мин).

Структура выделенных продуктов подтверждалась методом инфракрасной спектроскопии с использованием ИК-Фурье спектрометра типа IR-200, оснащенного приставкой нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО). ИК-спектр капсулируемого вещества снимали в таблетке KBr (Фиг. 1). ИК НПВО использовали для регистрации спектров поверхности полученных микрокапсул (фиг. 2-6).

Анализ полученных данных показал, что конфигурация и расположение основных полос поглощения в спектрах, приведенных на фиг.2-6 совпадают с аналогичными параметрами библиотечных спектров альгината натрия (фиг. 2), гуаровой камеди (фиг. 3), ПВС (фиг. 4), ПВП (фиг. 5). При этом в спектрах поверхности микрокапсул отсутствуют полосы поглощения, характерные для исходных веществ, например в областях 1705, 1580 см^-1 для фурацилина (фиг. 1). Указанный факт свидетельствует о том, что вещество преимущественно сосредоточено внутри капсулы и отсутствует в поверхностном слое.

Размер полученных капсул подтверждался методом электронной микроскопии при помощи сканирующего электронного микроскопа «QUANTA FEG 650» (фиг. 6).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение микрокапсул фурацилина в оболочке из альгината натрия. В реактор, снабженный мешалкой, вносят 50 мл 1%-ного раствора альгината натрия и 1 мл 1,0%-ного раствора поверхностно-активного вещества (Cremophor® EL). Включают перемешивание. Не останавливая перемешивание, в реактор медленно вносят 0,5 г фурацилина растворенного в 2-3 мл диметилформамида или диметилсульфоксида и раствор аммиака до рН=8-9. К полученной суспензии при непрерывном перемешивании по каплям приливают 65 мл насыщенного раствора NaCl в качестве осадителя полимера. Полученную суспензию микрокапсул отфильтровывают на фильтре Шотта (кл. пор 16), промываю т ацетоном, сушат на воздухе или в сушильном шкафу. Выход - 86%.

Структура выделенных продуктов подтверждалась методом инфракрасной спектроскопии с использованием ИК-Фурье спектрометра типа IR-200, оснащенного приставкой нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) (фиг. 1-2).

Пример 2. Получение микрокапсул фурацилина в оболочке из гуаровой камеди.

В реактор, снабженный мешалкой, вносят 100 мл 0,5%-ного раствора гуаровой камеди и 1 мл 1%-ного раствора поверхностно-активного вещества (Cremophor® EL). Включают перемешивание. Не останавливая перемешивание, в реактор медленно вносят 0,5 г фурацилина растворенного в 2-3 мл диметилформамида или диметилсульфоксида и раствор аммиака до рН=8-9. К полученной суспензии при непрерывном перемешивании по каплям приливают 60 мл насыщенного раствора NaCl в качестве осадителя полимера. Полученную суспензию микрокапсул отфильтровывают на фильтре Шотта (кл. пор16), промывают ацетоном, сушат на воздухе или в сушильном шкафу. Выход - 81,5%.

Пример 3. Получение микрокапсул фурацилина в оболочке из поливинилового спирта. В реактор, снабженный мешалкой, вносят 50 мл 3%-ного раствора поливинилового спирта в воде и 1 мл 1,0%-ного раствора поверхностно-активного вещества (Cremophor® EL). Включают перемешивание. Не останавливая перемешивание, в реактор медленно вносят 0,5 г фурацилина растворенного в 2-3 мл диметилформамида или диметилсульфоксида и раствор аммиака до рН=8-9. К полученной суспензии при непрерывном перемешивании по каплям приливают 65 мл ацетона в качестве осадителя полимера. Полученную суспензию микрокапсул отфильтровывают на фильтре Шотта (кл. пор 16), промывают ацетоном, сушат на воздухе или в сушильном шкафу. Выход - 78,5%.

Пример 4. Получение микрокапсул фурацилина в оболочке из поливинилпирролидона. В качестве полимера оболочки используют поливинилпирролидон. Способ осуществляют как в примере 4.

Выход - 81%.

Пример 5. Методика определения антибактериальной активности микрокапсул фурацилина in vitro

Стеклянные чашки Петри, установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью, заливали расплавленной агаровой средой, предварительно засеянной тест-штаммами микроорганизмов. Взвесь тест-микробов для посева на чашки Петри готовили по стандарту мутности на 10 ЕД. В качестве посевного материала использовали суточные культуры. Взвесь каждого вида микроорганизма засевали на чашку Петри. Микробная нагрузка составляла 1000000 микробных клеток в 1 мл. При определении антибактериальной активности исследуемых веществ готовили их растворы концентрацией 2,0%. помещали в центр цилиндра (0,1 мл). Затем чашки инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 18-20 ч. В качестве сравнительного образца использовали стандартный раствор риванола в тех же концентрациях. Диаметр зон угнетения роста тест-микробов измеряли при помощи микролинейки с точностью до 1 мм.

В качестве капсулируемого вещества используют фурацилин, в качестве раствора полимера - 1,0% масс. раствор альгината натрия в воде или 0,5% масс. раствор гуаровой камеди в воде или 3,0% масс. раствор поливинилпирролидона в воде или 3,0% масс. раствор поливинилового спирта в воде или 1,0% масс. раствор гидроксипропилметилцеллюлозы в воде, а в качестве диспергатора - неионный солюбилизатор и эмульгатор Cremophor® EL, взятый в количестве 2,0% масс. от массы капсулируемого вещества, представляющий собой полиоксиэтилированное касторовое масло, осаждение осуществляют при температуре 3-5°С насыщенным раствором хлорида натрия или ацетоном в соотношении 0,6-1,3 по отношению к объему раствора полимера.

Таким образом, все водные дисперсии микрокапсулированного фурацилина показывают значительно более высокую антибактериальную активность in vitro по сравнению с водным раствором исходного фурацилина. Следует отметить, что антибактериальная активность водной дисперсии инкапсулированного в ПВП и ПВС фурацилина в пересчете на капсулированное вещество несколько ниже активности раствора исходного вещества в ДМСО. Исключение составляет активность по отношению к Candida albicans. В этом случае наблюдается значительное (до 2 раз) увеличение активности водной дисперсии приготовленного препарата.

При этом, следует учитывать, что суспензия микрокапсул приготовлена в воде, а раствор фурацилина в ДМСО, который также проявляет некоторую антибактериальную активность. Кроме того, ДМСО в связи с его влиянием на липидный обмен мембран способен быстро преодолевать кожный барьер и другие биологические мембраны не повреждая их. То есть ДМСО выступает проводником фурацилина через клеточные стенки микроорганизмов тем самым, повышая его биологическую доступность. Поэтому раствор фурацилина в ДМСО имеет наиболее высокую антибактериальную активность по сравнению с другими растворами, представленными в табл. Намного более эффективным в плане увеличения антибактериальной активности препарата оказалось микрокапсулирование фурацилина в природные полимеры - гуаровую камедь и альгинат натрия. Полученные на основе инкапсулированного в указанные полимеры фурацилина водные дисперсии с более низким, чем в растворах ДМСО, содержанием фурацилина, не уступают им по своей активности.

Таким образом, путем микрокапсулирования нам удалось создать композиции для получения высококонцентрированных водных псевдорастворов фурацилина, которые обладают более выраженным антибактериальным действием по сравнению с применяемым в медицинской практике его водным раствором, что позволяет значительно расширить область применения фурацилина в качестве антисептика для местного применения.