Результат интеллектуальной деятельности: Способ оценки вирулентности in vitro штаммов туляремийного микроба подвидов: Francisella tularensis subsp tularensis, subsp. mediasiatica, subsp. holartica

Предполагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано в лабораторной диагностике туляремийного микроба для оценки вирулентности изучаемых штаммов.

В настоящее время к вирулентности и выяснению механизмов и факторов «агрессивности» микробов приковано внимание многих научных лабораторий мира. Универсальным подходом к решению этой проблемы является получение мутантов с «выключением» того или иного гена, что дает возможность установления его биологической функции. Современные биоинженерные технологии позволяют получать разнообразные варианты, имеющие даже точечные мутации в одном гене. При изучении свойств таких мутантов в случае работы с патогенными агентами, в первую очередь, представляет интерес оценка влияния мутации на вирулентность бактерий.

В этой связи приобретает особую актуальность при работе с измененными вариантами туляремийного микроба изучение влияния мутации на вирулентность микроба, которую обычно оценивают с помощью различных методов, а именно: заражение лабораторных животных, определение уровня резистентности к пеницелину или степени устойчивости бактерий к бактерицидному действию нормальной сыворотки человека(НЧС) (1, 2, 3, 4, 5, 6,).

Однако известные способы определения вирулентности трудоемки, длительны по времени и сопряжены со строгим соблюдением режима работы с ПБА I-II групп патогенности (7).

Известно, что основным специфическим антигеном Francisella tularensis и индуктором противотуляремийных антител является липополисахарид ЛПС (см. 8, 9, 10, 11).

Природные высоковирулентные штаммы синтезируют ЛПС в S-форме (12, 13). При этом в указанных работах установлено, что снижение вирулентности туляремийного микроба вследствие различных мутаций сопровождается изменениями в структуре ЛПС.

Известен способ определения вирулентности туляремийного микроба (1, 2, 3), заключающийся в том, что животных инфицируют подкожно различными дозами бактерий с последующим учетом количества погибших к числу зараженных для расчета показателей LD₅₀ (доза микробов, вызывающая гибель 50% животных) или DCL (полная летальная доза, вызывающая гибель всех животных)

Для типичных природных вирулентных штаммов DCL составляет 1 м.кл. и, в зависимости от дозы заражения, сроки гибели животных составляют от 4-х до 8 суток. В случае штаммов с ослабленной вирулентностью этот период может растягиваться до 15 и более суток. Содержание животных и манипуляции с ними выполняют в виварии, с соблюдением всех требований GAS (14).

Однако метод достаточно трудоемок, а учет результатов проводят в течение длительного времени. Более того, для подтверждения причины гибели животных необходимым является вскрытие павших животных с выделением чистой культуры возбудителя, что также увеличивает сроки получения результатов.

Кроме того, метод достаточно дорогостоящий (содержание лабораторных животных) и связан с соблюдением биоэтических норм.

Известен способ обнаружения устойчивости Francisella tularensis к бактерицидному действию нормальной сыворотке человека (НЧС) как критерий оценки вирулентности бактерий (5), заключающийся в том, что производят посев бактериальной суспензии в НЧС до конечной концентрации 10⁶ м.кл./мл, инкубируют посевы при 37°С в течение 24 часов с последующим высевом на плотную питательную среду, затем посевы дополнительно инкубируют в течение 24 часов при 37°С, результаты учитывают по наличию или отсутствию роста на среде, а именно: вирулентные штаммы вырастают на питательной среде в виде сливного газона, тогда как в случае авирулентных штаммов рост культур на среде отсутствует.

Недостатком способа является то, что метод предусматривает работу с живыми клетками возбудителя с соблюдением правил режима работы с ПБА I-II групп, необходимость наличия свежей сыворотки человека, при этом получение результата возможно только через 48-72 час.

Наиболее близким к предложенному способу по технической сущности является «ИХ-тест F. tularensis», производителем которого является ФБУН ГНЦ (г. Оболенск), который предназначен для иммунохромотографического экспресс-выявления и идентификации возбудителя туляремии, основанного на обнаружении в пробе специфического туляремийного антигена-ЛПС, что визуализуется на стрипе в виде дополнительной полосы (кроме контрольной).

Однако «ИХ-тест рассчитан на обнаружение типичных штаммов возбудителя туляремии с полноценным неизменным ЛПС и может быть использован при обнаружении микробов в полевом материале, например биотическом (грызуны, клещи, комары) и абиотическом (вода, солома, погадки птиц).

Кроме того на этапе выделения чистой культуры, F. tularensis, проводят ее идентификацию с помощью ИХ-теста. В случае визуализации на стрипе двух полос подтверждают присутствие F. Tularensis, а если одна полоса то ее отсутствие.

Что касается проведения оценки вирулентности штаммов туляремийного микроба на «ИХ-тесте», то этого не было проведено, что сужает технологические возможности теста.

Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка способа позволяющего расширить технологические возможности с помощью тест-системы в оценке вирулентности in vitro штаммов туляремийного микроба подвидов: Francisella tularensis subsp. tularensis, subsp. mediasiatica, subsp. holartica с высокой степенью достоверности.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе оценки вирулентности in vitro штаммов туляремийного микроба подвидов: Francisella tularensis subsp. tularensis, subsp. mediasiatica, subsp. holartica, вкючающием тестирование исследуемой культуры на присутствие бактериального ЛПС с помощью индикатора и субстрата, в качестве субстрата используют специфические антитела иммунохроматографического «ИХ-теста» к ЛПС исследуемой пробы, которую вносят в объеме 0,1 мл в лунку теста с предварительной подготовкой бактериальной взвеси по отраслевом стандарту мутности и с последующим ее кипячением при 100°С в течение 30 минут, учет результатов осуществляют через 15 минут визуально по наличию в стрипе полос, если обозначились две полосы (одна контрольная, а вторая опытная),то делают заключение, что в пробе присутствует вирулентный штамм одного из подвидов туляремии, а если наблюдаем одну полосу (контрольную), то штамм относят к авирулентным.

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения способа необходим «ИХ-тест» F. tularensis выпускаемый ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», г. Оболенск.

В исследовании были использованы пять высоковирулентных природных штаммов трех основных подвидов: Francisella tularensis subsp. tularensis (A-Cole cap+, AE-261cap+), subsp. mediasiatica (543cap+, 240cap+), subsp. holartica (503cap+) и семь авирулентных штаммов F. tularensis (AE-261cap^-, A-Cole cap^-, 543cap^-, 240cap^-, 503a, 1898(21/400), 1915)

Получение изогенных авирулентных мутантов из высоковирулентных родительских природных штаммов, их характеристика и структура ЛПС описаны ранее (8, 12, 13, 15, 16).

Все штаммы получены из музея живых культур ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.

Из суточной агаровой культуры вирулентных штаммов основных подвидов и их авирулентных мутантов готовят бактериальную супензию в физиологическом растворе по отраслевому стандарту мутности 10 ед.

Затем суспензию исследуемого штамма разводят путем 10-и кратного разведения в физиологическом растворе, содержащую 10⁸ м.кл/мл. Бактериальную взвесь кипятят при 100°С, в течение 30 минут. После этого по 0,1 мл взвеси вносят в лунки «ИХ-теста».

Учитывают результат через 10-15 минут визуально. В случае получения на стрипе двух полос, делают вывод о присутствии в пробе вирулентного штамма одного из подвидов туляремии, а если проявляется одна полоса -контрольная, то штамм оценивают как авирулентный.

Таким образом используя в качестве индикатора ЛПС, а в качестве субстрата специфические антитела иммунохроматографического «ИХ-теста» к ЛПС, проводят оценку вирулентности in vitro штаммов туляремийного микроба подвидов Francisella tularensis subsp. tularensis, subsp. mediasiatica, subsp. holartica.

Пример 1. Из суточной агаровой культуры вирулентных штаммов А-Cole и АЕ-261 F. tularensis подвид tularensis, обозначенных как сар+, и их авирулентных мутантов, обозначенных как cap-, готовим бактериальную суспензию в физиологическом растворе по отраслевому стандарту мутности 10 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-85-П (10 ME)).

Путем 10-кратного разведения приготовленной бактериальной суспензии в физиологическом растворе получают взвесь содержащую 10⁸ м.к./мл.

Бактериальные взвеси кипятим при 100°С в течение 30 мин и по 0,1 мл вносят в лунки «ИХ-теста». Через 10-15 мин учитывают результат: вирулентные штаммы дают четко визуализируемые две полосы, авирулентные - только одну контрольную полосу (см. таблицу 1 и фото 1).

Таким образом из фото 1 и таблицы 1 видно, что штаммы F. tularensis АЕ-261 сар+ и A-Cole сар+ являются вирулентными, тогда как их изогенные мутанты, обозначенные cap^-, имеют авирулентный фенотип.

Пример 2. Технологические условия проведения способа такие же как в примере 1, но с использованием штаммов другого подвида. Из суточной агаровой культуры вирулентных штаммов 543 и 240 F. tularensis подвид mediasiatica, обозначенных как сар+, и их авирулентных мутантов, обозначенных как cap-, готовят бактериальную суспензию в физиологическом растворе по отраслевому стандарту мутности 10 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-85-П (10 ME)).

Через 10-15 минут учитывают результат, см. таблицу 2 и фото 2.

Из таблицы 2 и фото2 делаем вывод, что штаммы 543 сар+ и 240 сар+ являются вирулентными, а 543 сар^- и 240 cap^- -авирулентными.

Пример 3. Последовательность проведения способа как описано в примере 1, но с использованием штаммов F. tularensis подвида holarctica. Исследовали вирулентный штамм 503, обозначенного как сар+, и авирулентные штаммы F. tularensis 503а, 1915, 1898 (21/400).

После 10-15 минут учитывали результатам, таблицу 3 и фото 3.

Следовательно из фото 3 и таблицы 3 делают вывод, что штамм F. tularensis подвида holarctica 503 сар⁺ является высоковирулентным и обнаружили этот факт с помощью «ИХ-теста» в течение 15 минут, так как стрип указал 2 полосы.

Остальные штаммы 503а, 1915 и 1898 являются авирулентными, стрип обозначил одну полосу, также в течение 15 минут.

При этом из таблиц 1-3 видно, что наряду с определением вирулентности с помощью « ИХ-теста» ее также определяли с помощью биологического метода (заражение животных) и оценки устойчивости штаммов к действию НЧС. Показатели совпали что подтверждает работоспособность «ИХ-теста» при оценке вирулентности туляремийного микроба.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет стандартных иммунохроматографических тестов, расширяя их технологические возможности на основании обнаружения в пробе специфического туляремийного антигена ЛПС, осуществлять, оценку вирулентности трех основных подвидов туляремийного микроба достоверно и быстро в течение 15 минут.

Кроме того предлагаемый способ может быть использован при анализе мутаций на вирулентность измененного штамма и скрининге его популяционной однородности.

Информационные источники:

1. Олсуфьев Н.Г. «Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии», М., 1975 г. - 200 с.

2. Эпидемиологический надзор за туляремией: Методические указания. МУ 3.1.2007-05. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2005. - 59 с.

3. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней / Практическое руководство под ред. академика РАМН Г.Г. Онищенко, академика РАМН В.В. Кутырева // М., «Шико». - 2013. - 560 с.

4. Павлович Н.В. Способ определения вирулентности туляремийного микроба / Н.В. Павлович, И.В. Рыжко, Б.Н. Мишанькин и др. // Авт. свид. №273760, 1988.

5. Павлович Н.В. Устойчивость Francisella tularensis к бактерицидному действию нормальной сыворотки как критерий оценки вирулентности бактерий / Н.В. Павлович, В.М. Сорокин, Н.С. Благородова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1996. - №1. - С. 7-9.

6. Sorokin, V.M. Francisella tularensis resistance to bactericidal action of normal human serum / V.M. Sorokin, N.V. Pavlovich, L.A. Prozorova // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1996. - №13. - P. 249-252.

7. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): Санитарно-эпидемиологические правила. СП 1.3.3118-13. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2013. - 150 с.

8. Павлович Н.В. Биологические свойства и факторы патогенности Francisella tularensis: Автореф. дис. … д-ра. мед. наук / Павлович Наталья Владимировна. - Саратов, 1993. - 37 с.

9. Сорокин В.М. Сравнительная иммунохимическая и биологическая характеристика капсульного вещества и липополисахарида Francisella tularensis / В.М. Сорокин, Н.В. Павлович, М.В. Цимбалистова и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1996. - №6. - С. 62-63.

10. G. Immunogenesity and toxicity of lipopolysaccharide from Francisella tularensis LVS / G. A. T. Johansson et al. // FEMS Microbiol. Immunol. - 1992. - Vol. 105. - P. 201-210.

11. Waag, D.M. Immunogenecity of a new lot of Francisella tularensis live vaccine strain in human volonteers / D.M. Waag, G. M.J. England, J.C. Williams // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1996. - Vol. 13. - P. 205-209.

12. Оноприенко H.H. Сравнительная характеристика липополисахаридов бактерий рода Francisella: Автореф. дисс. … канд. биол. наук / Оноприенко Наталья Николаевна. - Саратов, 2001. - 22 с.

13. Аронова Н.В. Липополисахариды бактерий рода Francisella как иммунодоминантные антигены и их фазовые вариации в условиях in vivo: Автореф. дисс. … канд. биол. наук. / Аронова Надежда Валентиновна. - Саратов, 2005. - 22 с.

14. Guide for the care and use of laboratory animals. National Research Council.. 8^th ed. Washington, DC: National Acadevy Press, 2011.

15. Павлович Н.В. Получение бескапсульных вариантов Francisella tularensis / Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин, Г.И. Данилевская и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1993. - №2. - С. 7-10.

16. Павлович Н.В. Характеристика биологических свойств бескапсульных вариантов Francisella tularensis / Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин, Н.Я. Шиманюк и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1993. - №3. - С. 21-27.