ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ МИКРОСФЕР ГОЗЕРЕЛИНА С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, и конкретнее, к композициям микросфер гозерелина с длительным пролонгированным высвобождением, способам их получения и их применению.

Уровень техники

Гонадотропин-высвобождающий гормон (GnRH), также известный как лютеинизирующего гормона высвобождающий гормон (LHRH), представляет собой гормон, тесно связанный с репродуктивными функциями. Когда экзогенный LHRH или его аналог вводят с физиологической частотой импульсации (один раз в 90 мин) в течение короткого промежутка времени в небольшой дозе, он оказывает некоторое промотирующее действие на гипофизарно-гонадную систему, и поэтому его клинически используют для лечения таких симптомов, как половая дисфункция, ановуляция, задержка полового созревания и т.д. Когда его вводят с нефизиологической частотой импульсации в течение длительного периода времени и в большой дозе, он может ингибировать секрецию гипофизом лютеинизирующего гормона (LH) и фолликулостимулирующего гормона (FSH), что приводит к снижению способности гонады к секреции гормонов и атрофии половых органов. Его также используют клинически для лечения некоторых гормонзависимых заболеваний, таких как рак предстательной железы, гистеромиома, рак молочной железы, аденомиоз, преждевременное половое созревание и т.д.

Аналоги LHRH регулируют секрецию LH и FSH через ингибирование обратной связи путем конкурентного связывания с большинством гипофизарных рецепторов LHRH, посредством чего ингибируется продуцирование овариальных эстрогенов и достигается эффект медицинской овариэктомии. Исследования показали, что жизнь больных раком предстательной железы можно продлить путем введения аналогов гормона LHRH (таких как гозерелин) после радиотерапии. Доступная информация показывает, что аналоги гормона LHRH, по меньшей мере, способны достигать такого же лечебного действия, как хирургическая кастрация или химиотерапия CMF, и используются как послеоперационное вспомогательное лечение для предклимактерических пациенток с раком молочной железы; и достигать такого же лечебного действия, как химиотерапия CMF у пациентов, положительных на эстрогенные рецепторы, с метастазом в подмышечные лимфоузлы, с меньшим побочным действием и более приемлемы для пациентов. В последние годы гозерелин используют для регулирования клинических признаков и симптомов эндометриоза и аденомиоза, для предупреждения рецидива эндометриоза после операции, с получением во всех случаях хороших результатов. Кроме того, гозерелин также используют для утоныпения эндометрия и лечения фибром матки и других симптомов. Некоторые клинические продукты аналогов LHRH доступны коммерчески. Например, препарат гозерелина под торговым наименованием «золадекс» одобрен во Франции в 1987 и одобрен FDA 29 декабря 1989. Его лекарственная форма представляет собой имплантат с ежемесячной дозой инъекции 3,6 мг/ампула. Взрослым инъецируется подкожно 3,6 мг каждые 28 дней в переднюю брюшную стенку. Однако «в случае подкожной инъекции золадекса в переднюю брюшную стенку предварительно нагружают тампон в одноразовом шприце, и игла шприца по размеру эквивалента размеру пункционной иглы 16 длиной 30 мм, поэтому, по сравнению с подкожной инъекцией обычных лекарственных средств, уровень боли, вызываемой инъекцией золадекса, выше, и кровотечение, вызываемое инъекцией золадекса, происходит чаще». - Journal of Modern Clinical Medical, July, 2008, Volume 6(7).

В соответствии с характеристиками введения гозерелина по клиническим показаниям, пациентам часто требуется длительное введение. Поэтому, для того, чтобы улучшить восприятие пациентов, разработаны длительно действующие препараты гозерелина с пролонгированным высвобождением. По сравнению с препаратами-имплантатами препараты, инъецирующие пациентам микросферы, значительно уменьшают боль и кровотечение у пациента. Некоторым коммерчески доступным микросферам аналогов LHRH, таким как микросферы лейпролида, придана такая картина высвобождения лекарственного средства. Однако исследования показали, что когда получают микросферы из гозерелина, который не подвергнут предварительной обработке, эффективность захвата лекарственного средства низкая, и потери в процессе изготовления высокие, что приводит к возрастанию стоимости производства. Фармакокинетические исследования полученных микросфер на животных показали, что биодоступность гозерелина низкая, что делает лекарственное средство неспособным действовать с его возможным полным эффектом.

Раскрытие изобретения

В результате глубоких исследований авторы изобретения обнаружили, что предварительная обработка гозерелина добавлением к нему полоксамера или полиэтиленгликоля (ПЭГ) с последующим получением микросфер из предварительно обработанного гозерелина повышает эффективность захвата и улучшает биодоступность лекарственного средства, что промотирует проявление полного действия лекарственного средства.

Настоящее раскрытие относится к фармацевтической композиции микросфер с пролонгированным высвобождением гозерелина. Микросферы гозерелина включают гозерелин или его соль, сополимеры лактида и гликолида (PLGA) и полоксамер или полиэтиленгликоль.

В фармацевтической композиции микросфер с пролонгированным высвобождением гозерелина по настоящему изобретению массовое содержание гозерелина или его соли может составлять 1-10%, предпочтительно, 1-8%, предпочтительнее, 1-5%. Массовое содержание сополимеров лактида и гликолида может составлять 80-98%, предпочтительно, 86-98%, предпочтительнее, 91-98%. Массовое содержание полоксамера или полиэтиленгликоля составляет 1-10%, предпочтительно, 1-6%, предпочтительнее, 1-4%.

Сополимер лактида и гликолида также называют (со)поли(лактидгликолидом), сокращенно PLGA. Молярное отношение лактида к гликолиду в указанном PLGA может составлять от 90:10 до 10:90, предпочтительно, 75:25 - 25:75, предпочтительнее, 60:40 - 40:60, наиболее предпочтительно, 50:50.

Характеристическая вязкость поли(лактидгликолида) (PLGA) может составлять 0,10-0,40 дл/г, предпочтительно, может находиться в интервале 0,10-0,35 дл/г, предпочтительнее, в интервале 0,10-0,30 дл/г. Способ измерения характеристической вязкости PLGA может быть следующим: получают примерно 0,5% (мас./об.) раствор PLGA в хлороформе, и определяют характеристическую вязкость PLGA при 30°C с использованием стеклянного капиллярного вискозиметра Кэннон-Фенске.

PLGA, описанный в настоящем раскрытии, может иметь молекулярную массу 4000-45000 дальтон, предпочтительно, 4000-35000 дальтон, предпочтительнее, 4000-30000 дальтон. Термин «молекулярная масса», используемый в данном описании, относится к «среднемассовой молекулярной массе».

Для удобства описания молярное отношение лактида к гликолиду, характеристическая вязкость и молекулярная масса PLGA далее приводятся в скобках после каждого PLGA. Например, «PLGA (50/50, 0,14, 7200)» представляет поли(лактидгликолид) с молекулярным отношением лактида к гликолиду 50/50, характеристической вязкостью 0,14 дл/г и молекулярной массой 7200 дальтон.

Полоксамеры, описанные в данном описании, представляют собой блоксополимеры полиэтиленгликоля и пропиленгликоля. Сополимеры состоят из различных соединений с различным гидрофильно-липофильным балансом и образованы из соответствующего количества полиоксипропилена и соответствующего количества полиоксиэтилена. Предпочтительными полоксамерами являются полоксамер 188 или полоксамер 407, более предпочтителен полоксамер 188.

Полиэтиленгликоль, описанный в настоящем раскрытии, также известный как полимер α-водород-ω-гидрокси(окси-1,2-этандиила) или полиоксиэтилен (PEO-LS), является общим термином для полигликолей. Полиэтиленгликоль может представлять собой ПЭГ 2000, ПЭГ 4000 или ПЭГ 6000, предпочтительнее, ПЭГ 6000.

Нагрузочное количество лекарственного средства, описанное в настоящем раскрытии, является фактическим нагрузочным количеством лекарственного средства, которое вычисляют следующим образом:

при этом полимерные эксципиенты включают полимеры, раскрытые в настоящем раскрытии, например, комбинацию PLGA и полоксамеров или комбинацию PLGA и полиэтиленгликоля.

Эффективность захвата, описанную в настоящем раскрытии, вычисляют следующим образом:

при этом «измеренное нагрузочное количество лекарственного средства в микросферах» в формуле (II) представляет собой «нагрузочное количество лекарственного средства», вычисленное согласно формуле (I),

при этом «теоретическое нагрузочное количество лекарственного средства в микросферах» вычисляют согласно формуле (I), основываясь на количестве лекарственного средства и количестве полимерных эксципиентов, измеренных по отдельности перед тем, как их объединяют для получения микросфер.

Соль гозерелина в микросферах с пролонгированным высвобождением по настоящему раскрытию может представлять собой водорастворимую соль, такую как ацетаты, и т.д.

Микросферы с пролонгированным высвобождением гозерелина по настоящему раскрытию получают способом выпаривания растворителя из эмульсии твердое вещество-в масле-в воде (s/o/w). Способ представляет собой следующее: ацетат гозерелина предварительно обрабатывают путем смешивания с полоксамером или полиэтиленгликолем с образованием смеси измельченных твердых веществ; PLGA растворяют в органическом растворителе с образованием масляной фазы; смесь измельченных твердых веществ добавляют к масляную фазу и затем подвергают эмульгированию при сдвиговом усилии, и получают первичную эмульсию твердое вещество-в-масле (s/o). Затем первичную эмульсию добавляют в водный раствор, содержащий эмульгатор, эмульгируют до однородного состояния, и получают двойную эмульсию S/O/W, затем органический растворитель из двойной эмульсии S/O/W удаляют, остаток промывают и фильтруют, и получают микросферы.

Органический растворитель может представлять собой этилацетат, хлороформ или дихлорметан, предпочтительно, дихлорметан.

Эмульгаторы могут представлять собой гидрофильные эмульгаторы, например, твины, октилфеноловый эфир полиэтиленгликоля (тритон), Brij, поливинилпирролидон или поливиниловый спирт, предпочтительно, поливиниловый спирт (ПВС).

Концентрация эмульгатора в водном растворе может составлять 0,01%-5%, предпочтительно, 0,02-2%, предпочтительнее, 0,5%-1,0%.

Настоящее раскрытие относится к применению микросфер гозерелина при получении лекарственных средств для лечения рака предстательной железы, преждевременного полового развития, аденомиоза, женского бесплодия и гистеромиомы.

Микросферы по настоящему изобретению могут быть получены в форме стерильного порошка, при этом стерильный порошок может включать композицию микросфер гозерелина и маннита, и ее можно получить следующим образом: смачивают композицию микросфер гозерелина водой для инъекции и переносят в поддон для сушки вымораживанием, добавляют маннит и с ним соответствующее количество воды для иъекции, помещают поддон для сушки вымораживанием в сублимационную сушилку для сушки вымораживанием, и подвергают высушенный вымораживанием продукт просеиванию и смешиванию, асептически заполняют некую емкость и закупоривают, и таким образом получают стерильный порошок. Перед введением пациенту стерильный порошок можно суспендировать в фармацевтически приемлемом дисперсионном растворителе, при этом дисперсионный растворитель может включать вместе с водой для инъекции суспендирующее вещество, регулятор рН, средство, регулирующее изоосмотичность, поверхностно-активное вещество или их комбинацию; суспендирующее вещество можно выбрать из группы, состоящей из натрийкарбоксиметилцеллюлозы, поливинилового спирта, поливинилпирролидиона, альгината натрия, глицерина и их комбинации; средство, регулирующее изоосмотичность, можно выбрать из группы, состоящей из хлорида натрия, глюкозы, маннита, сорбита и их комбинации; и поверхностно-активное вещество может представлять собой неионогенное поверхностно-активное вещество, такое как из ряда полисорбатов (например, полисорбат 80, полисорбат 60 и т.д.). Микросферы с пролонгированным высвобождением гозерелина по настоящему раскрытию можно использовать для внутримышечной или подкожной инъекции.

Микросферы с пролонгированным высвобождением гозерелина, описанные в настоящем раскрытии, имеют эффективность захвата свыше 90%, когда гозерелин предварительно обработан полоксамером или ПЭГ, и имеют относительно высокую биодоступность in vivo после введения, что способствует полному проявлению действия лекарственного средства.

Интервал размера частиц, используемый в настоящем раскрытии, определяют согласно руководству Guidelines for Microcapsules, Microspheres and Liposome Preparations, Appendix ХГХЕ of Chinese Pharmacopoeia (2010 Edition), следующим образом:

где D90, D50 и D10 относятся к размеру частиц, соответственно соответствующих 90%, 50% и 10% на интегральной кривой распределения. Чем меньше интервал, тем уже распределение, и таким образом частицы более однородны по размеру.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 представляет собой кривые высвобождения in vivo у крыс лекарственного средства микросфер гозерелина, которые содержат различные количества полоксамера/ПЭГ.

Фиг. 2 представляет собой кривые высвобождения in vivo у крыс лекарственного средства микросфер гозерелина, которые содержат различные количества полоксамера или ПЭГ.

Фиг. 3 представляет собой кривые высвобождения in vivo у крыс лекарственного средства микросфер гозерелина без регулирования содержания уксусной кислоты до и после 6-месячного испытания на устойчивость.

Фиг. 4 представляет собой график профилей высвобождения in vivo у крыс лекарственного средства микросфер гозерелина с регулированием содержания уксусной кислоты до и после 6-месячного испытания на устойчивость.

Осуществление изобретения

Настоящее раскрытие будет дополнительно поясняться приведенными далее примерами и примерами испытаний, которые никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1

Соответствующее количество ацетата гозерелина и полоксамера 188 взвешивают и смешивают в шаровой мельнице при частоте 15 Гц в течение 5 мин, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают для последующего применения точно 430 мг смеси гозерелина и полоксамера 188 (отмеренное количество гозерелина 215 мг). Взвешивают 1,721 г PLGA (75/25, 0,35, 42000) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 9,01% и эффективность захвата 90,1%.

Пример 2

Устанавливают температуру плавления в экструдере с диском для плавления 80°C. Соответствующее количество ацетата гозерелина и полоксамера 407 просеивают и смешивают. Смесь загружают в полость экструдера. Скорость перемешивания устанавливают на n=60 и время перемешивания на 3 мин. Затем рукоятку клапана освобождают для экструзии расплавленного материала, которому затем позволяют естественно становиться холодным. Материал крошат в шаровой мельнице в течение 2 мин. Взвешивают для последующего применения точно 316 мг смеси гозерелина и полоксамера 188 (отмеренное количество гозерелина 158 мг). Взвешивают 1,672 г PLGA (25/75, 0,24, 25000) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 7,21% и эффективность захвата 90,7%.

Пример 3

Соответствующее количество ацетата гозерелина и полоксамера 188 взвешивают и растворяют в воде с образованием прозрачного раствора, и затем раствор сушат распылением, и таким образом получают смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают точно 47 мг высушенной распылением смеси гозерелина и полоксамера 188 (отмеренное количество гозерелина 23 мг) и помещают в пробирку. Взвешивают 1,951 г PLGA (65/35, 0,29, 32000) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 1,02% и эффективность захвата 90,1%.

Пример 4

Взвешивают 92 мг ацетата гозерелина (содержащего 80 мг гозерелина по определению) и 21 мг полоксамера 188 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,908 г PLGA (50/50, 0,14, 7200) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,62% и эффективность захвата 91,4%.

Пример 5

Взвешивают 83 мг ацетата гозерелина (содержащего 72 мг гозерелина по определению) и 41 мг полоксамера 188 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,876 г PLGA (50/50, 0,14, 7200) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,56% и эффективность захвата 98,6%.

Пример 6

Взвешивают 91 мг ацетата гозерелина (содержащего 79 мг гозерелина по определению) и 101 мг полоксамера 188 и растворяют в 20 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,811 г PLGA (50/50, 0,14, 7200) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,61% и эффективность захвата 91,3%.

Пример 7

Взвешивают 92 мг ацетата гозерелина (содержащего 80 мг гозерелина по определению) и 201 мг полоксамера 188 и растворяют в 20 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,723 г PLGA (50/50, 0,14, 7200) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,58% и эффективность захвата 90,2%.

Пример 8

Взвешивают 62 мг ацетата гозерелина (содержащего 54 мг гозерелина по определению) и 41 мг полоксамера 188 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают PLGA (50/50, 0,14, 7200) и PLGA (0/50, 0,20, 18000) в массовом отношении 1:1, и в целом 1,964 г PLGA растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 2,54% и эффективность захвата 97,3%.

Пример 9

Взвешивают 26 мг ацетата гозерелина (содержащего 23 мг гозерелина по определению) и 58 мг полоксамера 188 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают PLGA (50/50, 0,14, 7200) и PLGA (0/50, 0,20, 18000) в массовом отношении 1:3, и в целом 1,801 г PLGA растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 1,15% и эффективность захвата 95,8%.

Пример 10

Взвешивают 129 мг ацетата гозерелина (содержащего 112 мг гозерелина по определению) и 82 мг полоксамера 188 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают PLGA (50/50, 0,14, 7200) и PLGA (50, 0,20, 18000) в массовом отношении 3:1, и в целом 1,861 г PLGA растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 5,31% и эффективность захвата 98,0%.

Пример 11

Взвешивают 91 мг ацетата гозерелина (содержащего 79 мг гозерелина по определению) и 6 мг полоксамера 188 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,924 г PLGA (50/50, 0,14, 7200) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 2,98% и эффективность захвата 76,1%.

Пример 12

Взвешивают 93 мг ацетата гозерелина (содержащего 81 мг гозерелина по определению) и 41 мг ПЭГ6000 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,931 г PLGA (50/50, 0,14, 7200) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,64% и эффективность захвата 92,9%.

Пример 13

Взвешивают 90 мг ацетата гозерелина (содержащего 78 мг гозерелина по определению) и 42 мг ПЭГ4000 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,925 г PLGA (85/15, 0,36, 44000) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы. В масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и затем подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,43% и эффективность захвата 90,1%.

Пример 14

Взвешивают 94 мг ацетата гозерелина (содержащего 82 мг гозерелина по определению) и 42 мг ПЭГ2000 и растворяют в 20 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,923 г PLGA (10/90, 0,27, 29000) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,59% и эффективность захвата 90,4%.

Пример для сравнения 1

Взвешивают 93 мг ацетата гозерелина (содержащего 81 мг гозерелина по определению) и растворяют в 4 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,908 г PLGA (50/50, 0,14,7200) и растворяют в 10 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 0,5% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 2,12% и эффективность захвата 52,4%.

Пример испытаний 1. Испытания на эффективность захвата образцов из примеров и примеров для сравнения

Метод испытания. Взвешивают 25 мг эталонного гозерелина и растворяют в дистиллированной воде с образованием раствора гозерелина концентрации 0,02 мг/мл, который используют как эталонный раствор. В 10-мл мерной колбе растворяют 20 мг микросфер гозерелина в соответствующем количестве чистой уксусной кислоты и разбавляют дистиллированной водой до достижения объема для получения испытываемого раствора. Затем образец подвергают высокоскоростному центрифугироавнию, и супернатант непосредственно подают на высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

Хроматографическая колонка: колонка с C₁₈ (25 см × 4,6 мм, 5 мкм);

температура колонки 40°C±0,5°C.

Подвижная фаза: 0,5% раствор фосфорной кислоты в ацетонитриле - 0,5% раствор фосфорной кислоты (25:75) (об.: об.).

Скорость потока 1,0 мл/мин;

длина волны детекции 220 нм;

объем образца 10 мкл.

В колонку для жидкостной хроматографии впрыскивают 10 мкл испытываемого раствора и 10 мкл эталонного раствора. Затем измеряют время удерживания хроматографического пика и площади хроматографических пиков и регистрируют для вычисления количества гозерелина в микросферах методом внешнего стандарта, и эффективность захвата можно вычислить по вышеуказанной формуле. Эффективность захвата испытываемых образцов и эталонного образца показана в таблице 1.

Таблица 1 показывает, что эффективность захвата микросфер может достигать 90% и более, если микросферы гозерелина получают из гозерелина, предварительно обработанного полоксамером/ПЭГ, и массовое содержание полоксамера/ПЭГ в микросферах гозерелина превышает 1%. Эффективность захвата микросфер, несодержащих полоксамер/ПЭГ, составляет примерно 50%.

Пример испытаний 2. Испытание на высвобождение in vivo из микросфер гозерелина, включающих различное содержание полоксамера/ПЭГ, и без полоксамера/ПЭГ

Испытываемые материалы

Испытываемые лекарственные средства: микросферы гозерелина, полученные согласно примерам 11, 4, 5, 6 и 7, которые содержат 0,3% (мас./мас.), 1% (мас./мас.), 2% (мас./мас.), 5% (мас./мас.), 10% (мас./мас.) полоксамера 188, соответственно, микросферы гозерелина, полученные согласно примеру 12, которые содержат 2% ПЭГ6000. PLGA, используемый в образцах, представляет собой PLGA (50/50, 0,14, 7200).

Контрольная группа: микросферы гозерелина, несодержащие полоксамер/ПЭГ, и с нагрузочным количеством лекарственного средства примерно 2,42%, полученные согласно примеру для сравнения 1.

Подопытные животные

Крысы SD (Shandong Luye Pharmaceutical Co., Ltd. Animal Room).

Контрольно-измерительные приборы:

масс-спектрометр QTRAP5500, снабженный источником ионизации распылением ионов (Applied Biosystem, Inc);

система высокоэффективной жидкостной хроматографии Agilent 1290, включающая насос двойного впрыска, автоматический пробоотборник и термостат для колонки;

настольная центрифуга Anke TGL-16G Feige (ShangHai Anting Scientific Instrument Factory); и концентратор с продувкой под давлением Turbo Vap LV (Biotage, Inc).

Метод испытания:

a) подопытные животные: самцы крыс SD с массой тела 190±10 г, 4 на группу;

b) путь введения и доза: внутримышечная инъекция в дозе 0,9 мг на крысу и объемом 0,5 мл на крысу;

c) время отбора образцов крови: образцы крови собирают до (час 0) и после введения в час 1, час 6, день 1, день 4, день 7, день 9, день 11, день 13, день 15, день 17, день 19, день 23 и день 28, соответственно;

d) характеризация биологических образцов: определяют концентрацию свободного лекарственного средства гозерелина в плазме крови методом ЖХ-МС/МС;

e) обработка данных: программа DAS 2.0.

Результаты показаны в таблице 2 и на фиг. 1.

Результаты показывают, что микросферы гозерелина высвобождают лекарственные средства сразу после введения, и что AUC микросфер гозерелина, содержащих полоксамер/ПЭГ, значительно больше AUC микросфер, не содержащих полоксамер/ПЭГ. Таким образом, видно, что присутствие полоксамера/ПЭГ в микросферах гозерелина повышает биодоступность in vivo. Далее, видно, что биодоступность микросфер связана с содержанием полоксамера/ПЭГ в микросферах. Когда содержание полоксамера/ПЭГ в микросферах гозерелина превышает 1%, биодоступность микросфер возрастает более чем на 20% по сравнению с микросферами гозерелина, не содержащими полоксамер/ПЭГ.

Пример 15

Взвешивают 92 мг ацетата гозерелина (содержащего 80 мг гозерелина по определению) и 6 мг полоксамера 188 и растворяют в 4 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,902 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 8 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 1,0% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 2,76% и эффективность захвата 74,6%.

Пример 16

Взвешивают 92 мг ацетата гозерелина (содержащего 80 мг гозерелина по определению) и 20 мг полоксамера 188 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,888 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 8 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 1,0% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,49% и эффективность захвата 90,1%.

Пример 17

Взвешивают 92 мг ацетата гозерелина (содержащего 80 мг гозерелина по определению) и 39 мг полоксамера 188 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,870 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 8 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 1,0% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,67% и эффективность захвата 95,7%.

Пример 18

Взвешивают 92 мг ацетата гозерелина (содержащего 80 мг гозерелина по определению) и 70 мг полоксамера 188 и растворяют в 4 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,838 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 8 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 1,0% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при (1800) об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,74% и эффективность захвата 99,3%.

Пример 19

Взвешивают 92 мг ацетата гозерелина (содержащего 80 мг гозерелина по определению) и 121 мг полоксамера 188 и растворяют в 4 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,786 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 8 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 1,0% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,38% и эффективность захвата 91,2%.

Пример 20

Взвешивают 92 мг ацетата гозерелина (содержащего 80 мг гозерелина по определению) и 201 мг полоксамера 188 и растворяют в 10 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,693 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 8 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 1,0% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,51% и эффективность захвата 90,1%.

Пример 21

Взвешивают 92 мг ацетата гозерелина (содержащего 80 мг гозерелина по определению) и 70 мг ПЭГ6000 и растворяют в 4 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,838 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 8 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 1,0% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,57% и эффективность захвата 90,7%.

Пример для сравнения 2

Взвешивают 92 мг ацетата гозерелина (содержащего 80 мг гозерелина по определению) и растворяют в 4 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ. Взвешивают 1,908 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 8 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 1000 мл 1,0% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 2,86% и эффективность захвата 57,1%.

Пример испытаний 3. Испытание на высвобождение in vivo из микросфер гозерелина, включающих различное содержание полоксамера/ПЭГ и без полоксамера/ПЭГ

Испытываемые материалы

Испытываемые лекарственные средства: микросферы гозерелина, полученные согласно примерам 15, 16, 17, 18, 19 и 20, которые содержат 0,3% (мас./мас.), 1% (мас./мас.), 2% (мас./мас.), 3,5% (мас./мас.), 6,0% (мас./мас.) и 10% (мас./мас.) полоксамера 188, соответственно. Микросферы гозерелина, полученные согласно примеру 21, которые содержат 3,5% ПЭГ6000. Полимеры, используемые в образцах, все представляют собой PLGA (50/50, 0,20,16000).

Контрольная группа: микросферы гозерелина, не содержащие полоксамер/ПЭГ, и с нагрузочным количеством лекарственного средства примерно 2,74%, полученные согласно примеру для сравнения 2.

Подопытные животные

Крысы SD (Shandong Luye Pharmaceutical Co., Ltd. Animal Room).

Контрольно-измерительные приборы:

масс-спектрометр QTRAP5500, снабженный источником ионизации распылением ионов (Applied Biosystem, Inc);

система высокоэффективной жидкостной хроматографии Agilent 1290, включающая насос двойного впрыска, автоматический пробоотборник и термостат для колонки;

настольная центрифуга Anke TGL-16G Feige (ShangHai Anting Scientific Instrument Factory); и

концентратор с продувкой под давлением Turbo Vap LV (Biotage, Inc).

Метод испытания:

a) подопытные животные: самцы крыс SD с массой тела 190±10 г, 4 на группу;

b) путь введения и доза: внутримышечная инъекция в дозе 0,9 мг на крысу и объемом 0,5 мл на крысу;

c) время отбора образцов крови: образцы крови собирают до (час 0) и после введения в час 1, час 6, день 1, день 4, день 7, день 9, день 11, день 13, день 15, день 17, день 19, день 23 и день 28, соответственно;

d) характеризация биологических образцов: определяют концентрацию свободного лекарственного средства гозерелина в плазме крови методом ЖХ-МС/МС;

e) обработка данных: программа DAS 2.0.

Результаты показаны в таблице 3 и на фиг. 2.

Результаты показывают, что микросферы гозерелина высвобождают лекарственные средства сразу после введения, и что AUC микросфер гозерелина, содержащих полоксамер/ПЭГ, значительно больше AUC микросфер, не содержащих полоксамер/ПЭГ. Таким образом, видно, что присутствие полоксамера/ПЭГ в микросферах гозерелина повышает биодоступность in vivo. Далее, видно, что биодоступность микросфер связана с содержанием полоксамера/ПЭГ в микросферах. Когда содержание полоксамера/ПЭГ в микросферах гозерелина превышает 1%, биодоступность микросфер возрастает более чем на 20% по сравнению с микросферами гозерелина, не содержащими полоксамер/ПЭГ.

Пример 22

Взвешивают 9,2 г ацетата гозерелина (содержащего 8 г гозерелина по определению) и 7,0 г полоксамера 188 и растворяют в 400 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ (измеряют содержание уксусной кислоты в промежуточном материале, т.е. высушенном вымораживанием порошке ацетата гозерелина и полоксамера; метод испытания приводится в примере испытаний 4). Взвешивают 183,8 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 800 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 100 л 1,0% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,73% и эффективность захвата 97,4%.

Пример 23

Взвешивают 9,2 г ацетата гозерелина (содержащего 8 г гозерелина по определению) и 7,0 г полоксамера 188 и растворяют в 400 мл воды с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ (измеряют содержание уксусной кислоты в промежуточном материале, т.е. высушенном вымораживанием порошке ацетата гозерелина и полоксамера; метод испытания приводится в примере испытаний 4; удлиняют время сушки вымораживанием и повышают температуру до тех пор, пока детектируемое содержание уксусной кислоты составит не более 0,5%). Взвешивают 183,8 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 800 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 100 л 1,0% раствора ПВС при 6°C с гомогенизацией при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,71% и эффективность захвата 99,6%.

Пример 24

Взвешивают 9,2 г ацетата гозерелина (содержащего 8 г гозерелина по определению) и 7,0 г полоксамера 188 и растворяют в 400 мл воды с 0,1% аммиака с образованием прозрачного раствора, затем раствор сушат вымораживанием, и получают таким образом смесь измельченных твердых веществ (измеряют содержание уксусной кислоты в промежуточном материале, т.е. высушенном вымораживанием порошке ацетата гозерелина и полоксамера; метод испытания приводится в примере испытаний 4). Взвешивают 183,8 г PLGA (50/50, 0,20, 16000) и растворяют в 800 мл дихлорметана для образования масляной фазы; затем в масляную фазу добавляют предварительно обработанное лекарственное средство смесь измельченных твердых веществ и подвергают эмульгированию в эмульгаторе с высоким сдвигом (6500 об/мин, 3 мин), и получают таким образом первичную s/o эмульсию. Первичную эмульсию добавляют в 100 л 1,0% раствора ПВС при 6°C через инжектор при гомогенизации при 1800 об/мин, и затем эмульсию гомогенно эмульгируют в течение 2 мин, и получают двойную эмульсию S/O/W. Двойную эмульсию перемешивают для испарения и удаления органического растворителя; остаток промывают и сушат вымораживанием, и получают порошок микросфер. Микросферы имеют нагрузочное количество лекарственного средства 3,73% и эффективность захвата 99,4%.

Пример испытаний 4. Влияние различного содержания уксусной кислоты в микросферах гозерелина на степень высвобождения in vivo

Метод испытания: определение с помощью газовой хроматографии [Appendix VE, метод 3, фармакопея Китая (вторая часть, издание 2000 г)].

Условия хроматографии и система, пригодная для испытания

Колонка представляет собой 10-метровую капиллярную колонку с внутренним диаметром 0,32 мм и с внутренним покрытием из кварцевого стекла FFAP-CB 0,33 мкм. Устанавливают следующие условия хроматографии:

температура инжекции 220°C;

температура детектора 250°C;

отношение деления потока 100:1.

Устанавливают следующую программу температуры колонки:

(1) начало при температуре 50°C с сохранением ее в течение 0,10 минут;

(2) повышение температуры со скоростью 30°C/мин;

(3) конечная температура 230°C с сохранением ее в течение 5 минут.

Объем впрыска 1 мкл.

Число теоретических тарелок вычисляется согласно пику ацетата и не должно составлять менее 5000. Разрешение пика уксусной кислоты и пика внутреннего стандарта должно соответствовать техническим условиям.

Определение поправочного коэффициента

Точно взвешивают 1,0 мл н-гексадекана и растворяют в 30 мл диметилформамида в 50-мл мерной колбе, разбавляют до заданного объема и тщательно встряхивают и используют в качестве внутреннего стандарта. Точно взвешивают 625 мг эталона уксусной кислоты и растворяют в диметилформамиде в 100-мл мерной колбе, разбавляют до заданного объема и тщательно встряхивают перед использованием. Переносят 10 мл вышеуказанного раствора в 100-мл мерную колбу. Добавляют 5 мл внутреннего стандарта. Все растворяют в диметилформамиде, разбавляют до заданного объема и тщательно встряхивают. Подают 1 мкл раствора на газовую хроматографию и повторяют впрыскивание 3-5 раз. Поправочный коэффициент вычисляют согласно средней площади пика.

Получение испытываемого образца и измерение. Примерно 50 мг микросфер гозерелина, полученных согласно примеру 22, 23 и 24, взвешивают и переносят в 2-мл мерную колбу, в которую добавляют 1 мл диметилформамида для растворения образца. Добавляют точно 100 мкл раствора внутреннего стандарта, и затем приводят объем диметилформамидом до конечного объема в колбе и тщательно встряхивают. Подают 1 мкл раствора на газовую хроматографию. Результат вычисляют методом внутреннего стандарта.

Результаты показаны в таблице 4.

Микросферы гозерелина из примеров 22, 23 и 24 исследуют на устойчивость, проводя испытание на высвобождение in vivo между образцами сразу же после получения и образцами после хранения в течение 6 месяцев при температуре 25°C и влажности 75%. Метод испытания приводится в примере испытания 2, а результаты показаны в таблице 5 и на фиг. 3 и 4.

Результаты показывают, что регулирование содержания уксусной кислоты во время получения микросфер ацетата гозерелина не влияет на нагрузочное количество лекарственного средства и эффективность захвата. Однако количество высвобождаемого in vivo лекарственного средства изменяется в ходе исследования на устойчивость (после хранения в течение 6 месяцев при температуре 25°C и влажности 75%). Количество высвобождаемого in vivo лекарственного средства не изменяется, когда содержание уксусной кислоты в микросферах гозерелина составляет менее 0,01%, в то время как количество высвобождаемого in vivo микросферами гозерелина лекарственного средства снижается более, чем на 20%, когда содержание уксусной кислоты в микросферах гозерелина не регулируется.

Пример испытаний 5. Измерение размеров частиц измельченного твердого вещества в масляной фазе и размеров частиц полученных микросфер

Испытываемые лекарственные средства: микросферы гозерелина, полученные согласно примерам 15, 16, 17, 18, 19 и 20, которые содержат 0,3% (мас./мас.), 1,0% (мас./мас.), 2,0% (мас./мас.), 3,5% (мас./мас.), 6,0% (мас./мас.) и 10% (мас./мас.) полоксамера 188, соответственно; микросферы гозерелина, полученные согласно примеру 21, которые содержат 2,0% (мас/мас.) ПЭГ6000. Используемые в образцах PLGA имеют 50/50, 0,20, 16000.

Контрольная группа: микросферы гозерелина, не содержащие полоксамер/ПЭГ, с нагрузочным количеством лекарственного средства примерно 2,74%, полученные согласно примеру для сравнения 2.

Метод испытания. Согласно соответствующим правилам в отношении измерения размера частиц и распределения частиц по размерам [метод третий в Appendix XIX Е фармакопеи Китая (вторая часть, издание 2010 г)], в качестве диспергатора используют 0,1% раствор твина 20. Примерно 120 мл раствора твина 20 переносят в устройство для диспергирования образца анализатора размеров частиц, и регулятор скорости вращения устанавливают так, чтобы перемешивание осуществлялось при 2100 об/мин. Сначала измеряют фон диспергатора. Затем к диспергатору добавляют 0,1 мл первичной эмульсии и 50 мг высушенного вымораживанием порошка микросфер. После равномерного диспергирования образцов измеряют размеры частиц параллельно три раза и берут средние величины.

Результаты показаны в таблице 6.

Результаты показывают, что при получении микросфер регулирование размеров частиц первичной эмульсии оказывает значительное влияние на размеры частиц микросфер. Когда размеры частиц первичной эмульсии регулируют, интервал размеров микросфер гозерелина может быть в десять раз меньше, чем в случае, когда размеры частиц первичной эмульсии не регулируют. Следовательно, путем регулирования размеров частиц первичной эмульсии можно получить продукт микросферы более однородных размеров.

Промышленная применимость

Микросферы гозерелина с пролонгированным высвобождением, описанные в настоящем раскрытии, имеют эффективность захвата свыше 90% и имеют относительно высокую биодоступность in vivo после введения, что способствует проявлению полного действия лекарственного средства и имеет промышленную применимость.