СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ НООТРОПНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЕМ НА ОРГАНИЗМ

Изобретение относится к области медицины, а именно к препаратам пептидного происхождения, обладающих ноотропным действием.

В настоящее время под препаратами, обладающими ноотропным действием, понимают вещества, оказывающие специфическое влияние на высшие интегративные функции мозга, улучшающие память, облегчающие процесс обучения, стимулирующие интеллектуальную деятельность, повышающие устойчивость мозга к повреждающим факторам, улучшающие когнитивные (познавательные) функции как у здоровых людей, так и, в особенности, нарушенные при различных заболеваниях [Андреев Б.В. Ноотропные средства // Мир Медицины. - №8. - 1998. - С. 25-28]. Ноотропные препараты являются весьма динамично развивающейся группой лекарственных средств как в России, так и за рубежом. Это, в частности, связано с тем, что продолжительность жизни в развитых странах постоянно увеличивается, причем наиболее быстро растет часть общей популяции, которая состоит из людей старше 65 лет, для которых характерно повышение частоты заболеваний, ассоциирующихся с возрастом, таких как деменция и других. Интерес к этой группе препаратов объясняется, в частности, тем, что в отличие от психостимуляторов мобилизующего типа, ноотропы не вызывают психомоторного возбуждения, истощения функциональных возможностей организма, привыкания и пристрастия.

Согласно современным представлениям к ноотропным препаратам относятся пирацетам, его гомологи и аналоги (анирацетам, оксирацетам, прамирсцетам, нефирацетам и др.); производные диметиламиноэтанола: деанола ацеглюмат, меклофеноксат, центрофеноксин; препараты нейроаминокислот: гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), производные гамма-аминомасляной кислоты (фенибут, никотиноил-гамма-аминомасляная кислота (пикамилон), гопантеновая кислота (пантогам), глицин, глутаминовая кислота; производные пиридоксина: пиритинол (пиридитол, энербол, энцефабол); холиномиметик центрального действия: холина альфосцерат; препараты Ginkgo biloba: билобил, мемоплант, ревайтл гинкго, танакан и др. [Воронина Т.А., Середенин С.Б. Ноотропные препараты, достижения и новые проблемы // Экспериментальная и клиническая фармакология. - №4. - 1998. - С. 3-9; РЛС - Энциклопедия лекарств / Гл. ред. Крылов Ю.Ф. / М.: "РЛС-2001".- 2000. - 1504 с.; Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. - М.: АстраФармСервис, 2000. - 1408 с.]

Широко известен препарат церебролизин, представляющий собой безбелковый гидролизат мозга, состоящий из аминокислот, низкомолекулярных пептидов и микроэлементов, сырьем для получения которых служит головной мозг свиней [Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие по фармакотерапии для врачей. В 2 ч. - Вильнюс, 1993, - ч. 2, - с. 84-88]. Нейропротективное и трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот молекулярной массы не выше 10000 дальтон, из которых доминирующими и определяющими свойства препарата являются аланин, лейцин и лизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Недостатком известного препарата является значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, крайне низкий регенеративный, в том числе и репаративный, потенциал для нервной ткани. Использование препарата не позволяет достигнуть существенного восстановления анатомической структуры и функциональной активности нейронов головного и спинного мозга после их повреждения [Кривицкая Г.Н., Гельфанд В.Б., Попова Э.Н. Деструктивные и репаративные процессы при очаговых поражениях головного мозга. - М.: Медицина, 1980. - 214 с; Несмеянова Т.Н. Стимуляция восстановительных процессов при травме спинного мозга. - М.: Наука, 1971. - 255 с; Крыжановский Т.Н., Карабань И.Н., Магаева С.В. и др. Компенсаторные и восстановительные процессы при паркинсонизме. - Киев: АМН Украины, 1995. - 186 с.].

Ноотропным действием обладают также ряд препаратов с широким спектром эффектов [Воронина Т.А., Середенин С.Б. Ноотропные препараты, достижения и новые проблемы // Экспериментальная и клиническая фармакология. - №4. - 1998. - С. 3-9]: препараты, усиливающие мозговое кровообращение, микроциркуляцию и метаболизм: винпоцетин, винкамин, винконат, ницерголин, циннаризин, флунаризин, нимодипин, ксантиновые производные пентоксифиллина, карнитин, фосфатидилсерин, натрия оксибат; витамины и их производные: пиридоксин, пантотеновая кислота, фолиевая кислота, витамин Е; промежуточные продукты метаболизма клетки: оротовая и янтарная кислоты; энергодающие субстраты: рибоксин, АТФ, РНК, глюкозо-1- и глюкозо-6-фосфат. Вышеперечисленные препараты обладают положительным влиянием на память (ноотропным действием) и у них отсутствуют ярко выраженные эффекты традиционных психотропных и кардиотропных препаратов. Для них также свойственна низкая токсичность и отсутствие выраженных побочных эффектов даже в субтоксических дозах (за исключением некоторых холинергических препаратов).

В настоящее время большой интерес вызывают ноотропные препараты на основе пептидов, такие как кортексин, церебролизин, дельтаран, селанк, ноопепт [РЛС - Энциклопедия лекарств / Гл. ред. Крылов Ю.Ф. / М.: "РЛС - 2001". - 2000. - 1504 с.; Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. - М.: АстраФармСервис, 2000. - 1408 с.]. В частности, показано [RU 2394836, 2010], что пептид общей формулы: Ac-X-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂, где X-Met-L-Met или DL-Met перспективен для создания лекарственных препаратов с нейротропной активностью.

Известны цистинсодержащие пептиды, являющиеся фрагментами С-концевой последовательности вазопрессина, стимулирующие обучаемость лабораторных животных в дозах, в 100-1000 раз превышающих дозы вазопрессина в аналогичных тестах, но лишенные его гормональных эффектов [Burbach J.P.H., Leboille J.L.M. // J. Biol. Chem. - 1983. - V. 258, N 3. - P. 1487-1489; Valter M.P., De Wied D., Van Ree J.M. // Neuropeptides. - 1997. - V. 31, N 5. - Р. 489-494]. Показано [Голубович В.П., Мартинович В.П., Усенко А.Б и др. //. Химико-фармацевтический журнал, 1888. №6. - С. 675-679; Мартинович В.П., Слободчикова Л.К., Голубович В.П., Ахрем А.А., Титов С.А., Воскресенская О.Г. // Химико-фармацевтический журнал - 1989. №9. - С. 1054-1057], что тетрапептид Cys-Pro-Arg-Gly-NH₂ является активным стимулятором памяти и обучаемости, эффективные дозы которого сопоставимы с дозами вазопрессина.

Недостатками данных препаратов является недостаточно высокая активность при воздействии на высшие интегративные функции мозга

Известен циклический пролил-глицин, используемый в качестве нейропротективного агента для лечения поражений нервной системы, включая инсульты, травмы мозга, болезнь Альгеймера, болезнь Паркинсона и иные поражения нервной системы человека [US 2007/0244039, 2007]. Недостатком препарата является его недостаточно высокая ноотропная активность, в частности, относительно невысокое стимулирующее воздействие на процессы обучения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является цикло(пролил-аланин) -DKR-9, один из пептидов, описанный в патенте [RU 2517209, 2013], используемый в дозе 0,01-1 мг/кг.

Недостатком препарата является его лабильность при воздействии температуры и биологических жидкостей, что затрудняет его применение в виде перорального препарата.

Задачей, решаемой авторами являлось создание более стабильного лекарственного средства на основе цикло(пролил-аланина) в качестве активного начала, позволяющего создать на его основе препарат для перорального применения.

Технический результат достигался использованием в качестве лекарственного средства цикло(пролил-аланина), предварительно иммобилизованного на D-манните при концентрации пептида 4-10 масс % от веса сорбента. Полученный комплекс может использоваться самостоятельно или в сочетании со вспомогательными веществами. При этом на его основе могут формироваться гранулы или таблетки.

Использование D-маннита в качестве сорбента, как показали проведенные эксперименты обеспечивает стабилизацию пептида. Кроме того он обеспечивает при формировании таблетки создание более рыхлой структуры, что резко уменьшает сыпучесть таблетируемой смеси.

Проведенные исследования показали, что при использовании заявляемого комплекса коэффициент биодоступности цикло(пролил-аланина) при внутрижелудочном введении составляет 0.88±0.05, т.е. в кровоток попадает около 90% препарата, введенного перорально.

В качестве вспомогательных веществ, как правило, использовали разрыхлитель - сшитый поливинилпиролидон Коллидон CL и в качестве смазывающего вещества - стеарат магния.

Наряду с ними в качестве вспомогательных веществ могут использоваться:

- разбавители (используют для обеспечения необходимой массы таблетки, если в состав входит малое количество действующего вещества): глюкоза, крахмал, кальция гидрофосфат, кальция карбонат, лактозы моногидрат, магния карбонат, сорбит, микрокристаллическая целлюлоза, маннит и др.

- разрыхлители для обеспечения гранулы или таблетки: поперечно сшитый повидон, алгиновая кислота и ее натриевая и калиевая соли, крахмал, метилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза (кармеллоза натрия), кроскармеллоза, кросповидон, мальтоза, микрокристаллическая целлюлоза; твердые органические кислоты в сочетании с карбонатами или гидрокарбонатами;

- смачивающие - поверхностно-активные вещества;

- связующие вещества для обеспечения прочности гранул и таблеток: крахмальный клейстер, желатин, сахарозу, натрия алгинат, гели алгиновой кислоты, природные камеди, макрогол, производные целлюлозы, повидон, повидон-винилацетат (коповидон) и др.;

- вещества, оказывающие смазывающее действие и улучшающие текучесть таблетируемых смесей: крахмал, тальк, аэросил (кремния диоксид коллоидный), каолин, обезжиренный молочный порошок, макрогол, полисорбат, стеариновая кислота и ее кальциевая и магниевая соли, полисорбат-80, натрия лаурилсульфат и др.

Выбор конкретного состава вспомогательных веществ зависит от используемой технологии приготовления гранулята и самих таблеток. В частности, для приготовления желудочно-распадаемых таблеток целесообразно использовать смесь двух гранулятов - основного, содержащего активное начало, и вспомогательного. При этом вспомогательный гранулят обрабатывали с помощью конвективной сушки, и основной гранулят - с помощью более щадящей сублимационной сушки. Полученные грануляты смешивают, опудривают скользящими вспомогательными веществами и подвергают прессованию в драже или таблетки.

Существо заявляемого изобретения иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. 100 г порошка D-маннита обрабатывают 20 мл раствора, содержащим 10% D-маннита, и 5 г цикло(пролил-аланина), затем замораживают при температуре -40°С в течение 10 часов, подвергают сублимационной сушке в течение 30 часов и измельчают. Получаемая композиция 1 содержит 4,8% цикло(пролил-аланина).

Пример 2. 100 г порошка D-маннита обрабатывают 20 мл раствора, содержащим 10% D-маннита, 5% Коллидона 30 и 11 г цикло(пролил-аланина), затем замораживают при температуре -40°С в течение 10 часов, подвергают сублимационной сушке в течение 30 часов и измельчают. Получаемая композиция 2 содержит 10% цикло(пролил-аланина).

Пример 3. 100 г порошка D-маннита обрабатывают 20 мл раствора, содержащим 10% крахмала, 5% Коллидона CL и 4,5 г цикло(пролил-аланина), затем замораживают при температуре -40°С в течение 10 часов, подвергают сублимационной сушке в течение 30 часов и измельчают. Получаемая композиция 3 содержит 4% цикло(пролил-аланина).

Пример 4. Влияние состава композиции на фармакинетику исследовали следующим образом. В работе использовали белых беспородных крыс, самцов весом 180-200 г (питомник лабораторных животных «Рапполово»). Животные получали стандартный гранулированный корм и воду adlibitum. Непосредственно перед экспериментом у животных убирали корм и питьевую воду, возвращая доступ к ней после забора крови через 2 часа после введения исследуемого препарата. Кормили животных в день эксперимента после забора крови через 4 часа после введения препарата.

Растворы для введения готовили непосредственно перед экспериментами. Композиции на основе цикло (пролил-аланин) разводили стерильным фосфатно-солевым буферным раствором до концентрации цикло (пролил-аланина) 50 мг/мл. Доза на животное составляла 100 или 200 мкл/кг, что соответствует 5 и 10 мг/кг. Раствор препарата вводили внутрижелудочно по 40 или 80 мкл/животное. После введения препарата через определенные временные интервалы животных умерщвляли дислокацией шейных позвонков и забирали кровь. На каждую временную точку брали по 4 животных. Забор крови проводили до введения, через 5, 30 минут, через 1, 3, 5 и 12 часов. После забора крови отделяли сыворотку и замораживали при минус 70°С до определения уровня цикло(пролил-аланина). Анализ уровней пептида проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, используя в качестве стандарта тот же препарат, который вводили животным в опыте.

Цикло(пролил-аланин) при пероральном введении во всех трех композициях в дозах 5 и 10 мг/кг показал линейную зависимость концентрации от составила 1.96±0.27.

Биодоступность при пероральном введении является высокой и составляет 0.97±0.12 (композиция 1) 0.86±0.08 (композиция 2) и 0.72±0.06 (композиция 3).

Пик концентрации приходится на интервал от 1-го до 3-го часа после введения. Средняя продолжительность всасывания составляет порядка 1.0-1.5 часов.

Время полувыведения / полуэлиминации из кровотока - показатель t_1/2 - составляет 3.0-3.5 часов.

Стационарный объем распределения V_ss составляет порядка 1500 мл/кг, т.е. его распределение из крови весьма умеренное.

В связи с лучшими результатами, полученными на композиции 1 дальнейшие исследования проводились с ее использованием.

Пример 5. Влияние композиции цикло(пролил-аланина) на физическую работоспособность в тесте плавания с дополнительной нагрузкой изучалось на белых беспородных крысах самцах (питомник «Рапполово») массой 200-220 грамм, возраст 9-10 недель. Животных содержали в условиях обычного вивария при смешанном освещении, они получали гранулированный корм и питьевую воду adlibitum. В каждой группе было не менее 10 животных.

Композицию 1 вводили крысам внутрижелудочно в дозе 5 мг/кг цикло(пролил-аланина) в день в течение 7 дней, контрольные животные по аналогичной схеме получали физиологический раствор. Продолжительность плавания определяли до начала введения препарата и на 7 сутки эксперимента. Результаты эксперимента представлены в Таблице 1. Показано, что животные, получавшие препарат перорально в дозе 0,5 мг/кг продемонстрировали достоверно большую продолжительность плавания как по сравнению со своими исходными показателями (прибавка составила 57%), так и по сравнению с контрольной группой животных (на 37% больше), получавшей физиологический раствор.

* - достоверные различия с контролем, при р<0,05

- достоверные различия с исходными значениями, на уровне р<0,05

Пример 6. Влияние композиции 1 цикло(пролил-аланина) на когнитивные функции крыс с ишемическим поражением головного мозга

Эксперимент по изучению воздействия цикло(пролил-аланина)на когнитивные функции животных с ишемическим поражением головного мозга был проведен с использованием метода выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) на фоне билатеральной окклюзии общих сонных артерий у крыс. У всех животных формировали УРПИ и в тот же день у животных контрольной и опытной группы проводили операцию по перевязке сонных артерий под общим наркозом. Цикло(пролил-аланин)вводили перорально после оперативного вмешательства и далее ежедневно в течение 5 дней в дозе 1 мг/кг. Животным контрольной группы по той же схеме вводили физиологический раствор. В исследование также была добавлена ложнооперированная группа, у которой после выработки УРПИ под общим наркозом проводили препаровку сонных артерий, но сосуды не перевязывали. Сохранность УРПИ определяли через 24 часа, 48 часов и 5 суток после операции. Результаты данного эксперимента представлены в Таблице 3.

В группе ложно оперированных животных 100% крыс сохранили выработанный рефлекс на все сроки эксперимента. Т.е. общий наркоз и оперативное вмешательство без лигирования сонных артерий не влияют сохранность памятного следа экспериментальных животных.

Анализ сохранности УРПИ у животных, подвергнутых билатеральной окклюзии сонных артерий и в дальнейшем получавших физиологический раствор, показал, что через 24 часа после операции 40% животных утрачивают приобретенный рефлекс, а через 2 дня и 5 суток после операции потеря УРПИ наблюдается у 60% животных.

Анализ сохранности УРПИ у животных, подвергнутых; билатеральной окклюзии сонных артерий и получавших цикло(пролил-аланин)ежедневно внутрижелудочно, показал, что через 24 часа после операции УРПИ утрачивают только 10% животных, а через 2 дня и 5 суток после операции потеря УРПИ наблюдается лишь у 20% животных. Таким образом, показано, что ежедневное внутрижелудочное введение цикло(пролил-аланина)приводит к выраженной тенденции по сохранению памятного следа, выражающейся в повышении сохранности УРПИ на фоне окклюзии сонных артерий.

Пример 7. Для получения таблеток цикло(пролил-аланина) с содержанием активного компонента 1% (2 мг/таблетка) на первом этапе увлажняют 100 г порошка D-маннита 20 мл раствором, содержащим 10% D-маннита и 5% Коллидона 30. Порошок подвергают конвективной сушке при 50°С в течение суток, затем осуществляют грубое измельчение вспомогательного гранулята. На втором этапе обрабатывают 100 г порошка D-маннита 20 мл раствором, содержащим 10% D-маннита, 2% Коллидона 30 и 5 г цикло(пролил-аланина), после чего замораживают до -40°С в течение 10 часов, подвергают сублимационной сушке в течение 30 часов и измельчают.

Грануляты смешивают в кубическом смесителе в течение 10 мин при соотношении: вспомогательный гранулят - 74%; основной гранулят - 20% с добавлением коллидона CL - 5% и стеарата магния - 1% от общей массы.

Таблетирование проводилось таблеточным прессом Korsh с пуансонами диаметром 8 мм. Прессуемая часть таблетки имеет форму малой сферы. Общая масса таблеток - 0.2 грамма.

Пример 8. Изучалось влияние состава композиции таблетки на скорость растворения таблетки. Было установлено, что при использовании в таблетке D-маннита время растворения таблетки составило 14 минут, при использовании поливинил-пиролидона (15000) - 23 мин; при использовании поливинилового спирта - 26 мин. То есть распадаемость менее 15 минут имеют только таблетки, в которых в качестве склеивающего вещества во вспомогательном грануляте был использован D-маннит.

Однако, распадаемость таблеток с D-маннитом находилась на пределе требований Фармакопеи (14 минут), в состав таблеток был введен разрыхлитель Коллидон CL, который является сшитым поливинилпиролидоном. При этом время растворения таблетки сократилось до 11 мин. При этом сыпучесть таблетируемой смеси остается практически неизменной.

Пример 9. Влияние таблеток цикло(пролил-аланина) на когнитивные функции крыс

Оценка влияния препарата на когнитивные функции крыс в методике условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) проведена как у интактных животных, так и на фоне билатеральной окклюзии общих сонных артерий, которая приводит к ишемии головного мозга. У интактных животных формировали УРПИ, измельченную таблетку по примеру 6 вводили внутрижедужочно в дозах 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг и 1 мг/кг цикло(пролил-аланина) через 5 часов после выработки УРПИ и далее на протяжении 9 дней (всего 10 введений). В качестве препарата сравнения по той же схеме внутрижелудочно вводили препарат Ноопепт в дозе 5 мг/кг в день. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор. Сохранность УРПИ определяли через 11 дней после выработки, на следующий день после последнего введения изучаемых препаратов.

Результаты данного эксперимента представлены в Таблице 3.

Анализ общего числа животных сохранивших выработанный УРПИ показал, что в опытной группе, получавшей цикло(пролил-аланин) в дозе 0,1 мг/кг, рефлекс сохранился у 80% животных, у животных, получавших Цикло(пролил-аланин) в дозах 0,5 и 1 мг/кг, рефлекс сохранилсяу 90% животных. У животных, получавших препарат сравнения Ноопепт, сохранность УРПИ отмечена у 70% животных. Животные контрольной группы, получавшие физиологический раствор, сохраняли УРПИ в 40% случаев. Таким образом, продемонстрирована выраженная тенденция к увеличению сохранности УРПИ под действием цикло(пролил-аланина), вводимого перорально, причем эффект препарата превосходил эффект Ноопепта и продемонстрировал тенденцию к дозовой зависимости.

В ходе проведенных экспериментов установлено, что при пероральном курсовом введении композиция, содержащей цикло(пролил-аланин) демонстрирует:

- выраженную актопротекторную активность, значительно увеличивая физическую выносливость крыс в тесте плавания с нагрузкой;

- увеличение сохранности памятного следа у здоровых интактных крыс в тесте сохранности УРПИ;

- увеличение сохранности памятного следа у крыс с ишемическим поражением головного мозга в тесте сохранности УРПИ.

При этом коэффициент биодоступность цикло(пролил-аланина) при внутрижелудочном введении достигает 0.88±0.05, т.е. в кровоток попадает около 90% препарата, введенного peros.