Результат интеллектуальной деятельности: БИОПЛАСТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ

Изобретение относится к медицине, а именно к комбустиологии, пластической хирургии, косметологии и может найти применение в качестве биопластического материала для замещения дефектов покровных тканей и стимуляции регенерации.

В последнее время на основе полученных новых данных изучения механизмов регенерации тканей и органов с целью восстановления утраченных функций интенсивно развиваются тканевая инженерия и регенеративная медицина. Целью данного направления является создание органов и тканей de novo, которое достигается благодаря трансплантации клеток на матрицах-носителях.

Матрица-носитель или матрикс - это синтетический или биологический комплекс, обеспечивающий механическую прочность конструкции, ее пространственную 3-D ориентацию. Основными критериями биологически совместимой матрицы для создания тканеинженерной конструкции должны быть: отсутствие цитотоксичности, поддержание адгезии, фиксации, пролиферации и дифференцировки помещенных на ее поверхность клеток, отсутствие воспалительной реакции на материал и иммунного ответа, достаточная механическая прочность в соответствии с назначением, биорезорбируемость обычными метаболическими путями.

Известен Apligraf (Grafskin) - это пластический биоматериал (Tajima К. Regeneration through nerve allografts in cynomologus monkey (Macaca fascicularis).//J. Bone Joint Surgery. - 1991. - P.172.), созданный компанией Organogenesis (США), по структуре аналогичен с OrCel - matrix, но в отличие от него дополнительно содержит матричные белки и цитокины.

Однако вышеуказанный материал малодоступен: требует особые условия применения и отличается высокой ценой даже для европейского уровня платежеспособности.

Кроме того, наличие в материале коллагена приводит к сенсибилизации иммунокомпетентных клеток организма (формирование аллергической настроенности), что снижает его клиническую эффективность. Коллагеновая матрица не метаболизируется в ране (не рассасывается по мере заживления), что в свою очередь требует перевязок. При обширных ожогах каждая перевязка - это мощный стрессовый фактор, вызывающий болевой синдром и требующий применение аналгетиков.

Прототипом изобретения является биопластический материал (патент РФ №2367476, опубликовано 20.09.2009), включающий основу в виде матрицы, причем в качестве материала матрицы используют нативную форму гиалуроновой кислоты, имеющей волокнистое строение, в виде 0,1%-ного раствора, приготовленного при комнатной температуре, из из полученной гелеобразной массы получают микросферы диаметром 100 мкм, которые полимеризуются, и формируют эластичную пластину. Биопластический материал содержит противомикробные вещества.

По данным гистологических и гистохимических исследований отмечена уникальная фиброархитектоника биоматериала, максимально приближенная к строению межклеточного вещества нативных тканей. Наличие гиалуронового аморфного матрикса обеспечивает ему высокую прочность и оптимальную эффективность для замещения и регенерации подлежащих тканей.

Однако вышеуказанный материал имеет клинические ограничения по применению: материал неэффективен при глубоких дефектах покровных тканей, когда уровень повреждения ниже базальной мембраны. Данное обстоятельство обусловлено предельной толщиной материала (до 0,5 см), обеспечивающего неполное заполнение раны.

Также недостатком биопластического материала является то, что при изучении биосовместимости этого материала в культуре клеток in vitro отмечена низкая пролиферативная (размножение клеток) активность.

Техническим результатом предлагаемого биопластического материала является повышение эффективности заживления глубоких ран и биосовместимости.

Задача решается тем, что в биопластическом материале, включающем основу в виде матрицы, в качестве материала которой используют нативную форму гиалуроновой кислоты, каркас тканеинженерной конструкции получают послойной лиофилизацией материала матрицы до формирования объема толщиной от 0,5 до 10 см, причем волокна нативной формы гиалуроновой кислоты ориентированы в губчатом порядке, ячейки которых обогащены тромбоцитарным лизатом с количеством тромбоцитов 1×10 ⁹ тромб./мл.

На фиг.1 изображен поперечный срез биопластического материала на фиг.2 - культура клеток биопластического материала, увеличенная в 50 раз, на фиг.3 - культура клеток биопластического материала, увеличенная в 100 раз.

В качестве матрицы нами использовалась лиофилизированная форма гиалуроновой кислоты. Технология послойной лиофилизации биополимера гиалуроновой кислоты позволяет формировать объемный биоматериал заданной толщины в диапазоне от 0,5 до 10 см. Каждый слой имеет микроячеистое строение, которое наподобие «губки», соединяясь друг с другом, формирует каркасное построение множества микролабиринтов. Подобная биоинженерная модель создает эффективную систему градиента осмоса внеклеточной жидкости, обеспечивающую оптимальную трофическую среду для клеток. Кроме того, микроячейки обеспечивают надежную клеточную фиксацию и пространственное распределение клеточных элементов в области раневого дефекта ткани, что позволяет лучше восстанавливать поврежденные ткани организма. На микрофотографии биопластического материала поперечного среза отмечается наличие ячеек в послойном расположении, что определяет его доступность для ферментов, выделяемых в условиях раневого процесса и последующего репаративного гистогенеза. Данное обстоятельство определяет высокую биосовместимость биопластического материала.

Технология лиофильной сушки осуществлялась на классических установках для лиофильного высушивания серии GZL (LMPIE). Лиофильные сушки GZL выполнены в строгом соответствии со стандартами GMP. Основные компоненты установки и все контактирующие с продуктом части (рабочая сублимационная камера, полки, конденсатор, отсекающий клапан) изготовлены из высококачественной стали (марка AISI 316L), с чистотой поверхности Ra<0,5 мкм. Температура конденсора до 5800°С. Диапазон температуры на полках от +550°С до 5420°С. Расположение конденсора горизонтальное или вертикальное. Диапазон возможных рабочих температур конденсора: 5800°С (при лиофильной сушке), +1210°С (при стерилизации паром при наличии системы стерилизации SIP). Встроенное смотровое окошко с подсветкой. Кривизна поверхности полок составляет не более ±0,1 мм/м. Верхняя полка предназначена для равномерного температурного распределения в камере. Расстояние между полками 100 мм (кроме модели GZL50,5). Водное охлаждение (замкнутый контур). Система укупорки флаконов под инертным газом. Вакуумное давление в камере: без загрузки: #1 Па, рабочий вакуум: 10530 Па, вакуум контролируется оператором. Скорость уменьшения температуры на полке: от 1,5 до 20°С, процесс полностью контролируется оператором. Точность поддержания температуры на полках: ±, 01°С.

Пример получения бипластического материала.

Исходный гидрогель гиалуроновой кислоты (0,5-2% раствор гиалуроновой кислоты) разливают по 5 мл во флаконы объемом 100 мл. Замораживание проводят при - 40°С в течение 8 ч. После чего осуществляют вакуумное обезвоживание при температуре полки -40°С. Скорость нагревания на этапе досушивания составляет 4-6°С/ч. Конечная температура материала 25°С. Общее время вакуумного обезвоживания составляет 15 ч. Полученное вещество размещают на горизонтальной поверхности и пропитывают тромбоцитарным лизатом (Platelet Rich Plasma) в соотношении 5 г вещества - 1 мл (1×109 тромб./мл). В стерильных условиях выдерживают до формирования однородного объемного материала.

В оригинальный состав разработанного бипластического материала введен обогащенный тромбоцитарный лизат с количеством тромбоцитов (1×10 ⁹ тромб./мл). Данная концентрация тромбоцитов является максимально возможной, поскольку дальнейшее увеличение приводит к перенасыщению и кристаллизации с потерей биологических свойств. Технология послойной лиофилизации гиалуроновой кислоты с получением объемного биоматериала обеспечивает равномерное распределение концентрации тромбоцитарного лизата с сохранением его биологической активности.

Тромбоцитарный лизат - это смесь биологических медиаторов (Platelet-Derived Growth Factor, Transforming Growth Factor, Vascular Endothelial Growth Factor, Interlikin -4), которые играют ведущую роль в стимуляции и регуляции процессов заживления ран в организме и первыми запускают каскад пролиферации клеток. Наличие этих веществ в разработанном бипластическом материале придают материалу способность создавать условия для роста и деления клеток.

Культивирование проводили в течение 26 суток, с использованием стандартных питательных сред: аМЕМ (Sigma), 2 mM аланил-глютамина (Invitrogen) и 10% отборной телячьей сыворотки (Gibco). Питательная среда менялась каждые 4 суток или по изменению индикаторов рН среды.

Морфология и морфометрия

Видеодокументирование проводили ежедневно в каждой группе и серии экспериментов. Оценку площади клеток проводили на аппаратно-програмном комплексе Axio Observer A1. фирмы Carl Zeiss, на программном обеспечении AxioVision. Кластерный анализ культуры осуществляли на программном комплексе ImageJ и Image Pro Plus, деление клеток на группы проводили исходя из плотности пикселей на объект.

Подсчет клеток и вычисление пролиферативной активности.

Подсчет клеток осуществляли в 1, 3 и 4 группе всех серий экспериментов, на аппаратном комплексе Vi-Cell XR, фирмы Becman Coulter перед посевом и по окончании культивирования. Расчет пролиферативной активности проводился по следующим формулам:

где NH - количество клеток при посеве культуры;

NH1 - количество наращенных клеток;

На основании вышеуказанной формулы мы получили данные о количестве удвоений культуры за период культивирования. Применив следующую формулу, мы определили скорость удвоения культуры (удвоений/час) в течение рассчитанного количества удвоений.

где Ct - продолжительность культивирования, час.;

Dt - количество удвоений культуры.

Иммунофенотипирование проводили на проточном цитофлюориметре FACS Canto, фирмы Becton Dickinson, непосредственно перед посевом и после снятия клеток на 19 и 26 день культивирования. Исследовали следующие антигены: CD90,44,45,HLA-ABC, HLA-DR, 73,34, 105,14.

Оценка миграционной способности проводилась по видеозаписи роста клеток в первую неделю культивирования. Запись проводили в течение 4-х часов у всех групп клеток, на аппаратно-программном комплексе Axio Observer A1. фирмы Carl Zeiss. Выделение движущихся объектов (клеток), расчеты траекторий и дистанций перемещения с построением графиков проводились с использованием программного обеспечения ImagePro Plus.

За время культивирования наблюдается активное увеличение плотности колоний за счет увеличения адгезивных клеток небольших размеров до 100% на периферии. В непосредственной близости от материала небольшие участки разряжения.

Морфологическая картина хорошая, клетки малых размеров, с четкими и ровными краями, плотными межклеточными контактами, цитоплазма равномерная, без включений, ядра четкие с одним и более ядрышками.

Общая плотность колоний на 26 сутки составляла 100%, за исключением участков расположения материалов (10-15% пластика). На 26 день, клетки сняли раствором трипсин-версена, посчитали и проанализировали на проточном цитометре. Количество клеток с одной культуральной посуды (20.3 см ² ) составило 1,500000 млн. клеток. Количество удвоений 5,73 удвоений культуры, скорость удвоения 0,01 удв./час (0,220 удв./день).

Выводы по микроскопии

На основании микроскопии данных за токсичность материала нет. Клетки хорошо растут в присутствии материала. При совместном культивировании с лиоматриксом наблюдается оптимальная скорость роста, что очевидно связано с наличием тромбоцитарного лизата. Также было выявлено изменение морфологической картины - на первых этапах культивирования клетки имели более четкую структуру, однородную цитоплазму, ровные края и отростки, размеры клеток были несколько меньше клеток в контроле. На последних этапах культивирования различия в морфологической картине не визуализировались.

Для оценки клеточной активности был введен интегральный коэффициент (соотношение клеток, находящихся на стадии митоза к общему числу клеток). В результате проведенного исследования было установлено, что факторы роста в структуре биоматериала достоверно увеличивали митотическую активность. Результаты указаны в таблице.

Новизной разработанного биопластического материала является то, что впервые использовано сочетание лиофилизированной формы гиалуроновой кислоты и биологических медиаторов. Данное сочетание обеспечивает высокую биосовместимость и репаративный потенциал биопластического материала.

Именно такая биоинженерная организация создает комфортные трофические условия для мигрирующих в очаг поражения клеточных элементов. Кроме того, данный биопластический материал должен содержать уникальные факторы таксиса (миграции) и роста клеток.