Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВНУТРИТКАНЕВЫХ ПОРИСТЫХ ИМПЛАНТАТОВ

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения и обработки биосовместимых пористых внутритканевых имплантатов с особыми свойствами для улучшения прорастания (остеоинтеграции или фиброинтеграции) костной и соединительной ткани, и может быть использовано в ортопедии стоматологии и косметологии.

Известен материал, обладающий указанными свойствами (Севрюгин И. В., Калиновский В. В., Карякин Ю. М. Структура костного имплантата и способ ее изготовления (патент РФ № 2342103, МКИ A61F 2/28, A61L 27/04, B21F 21/00).

Недостатком известного материала является то, что он обладает цитотоксическим действием, технологический процесс его получения не обеспечивает возможности применения материала в клинической практике.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является вышеуказанный материал (Севрюгин И.В., Калиновский В., В., Карякин Ю.М. Структура костного имплантата и способ ее изготовления (патент РФ № 2342103, МКИ A61F 2/28, A61L 27/04, B21F 21/00).

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение эффективности способа изготовления внутрикостных имплантатов путем их отмывки органическими растворителями и кислотосодержащими реагентами при обработке ультразвуком и эффективной эвакуации всех загрязнений, образующихся в процессе изготовления материала в соответствии с известной технологией, которые обладают цитотоксическими свойствами.

Поставленный технический результат достигается тем, что в способе изготовления внутритканевых пористых имплантатов, содержащих спрессованный нетканый материал требуемой формы, в процессе производства имплантата вводится дополнительный этап - имплантат после механической обработки перед стерилизацией подвергают промывке для удаления загрязнений, являющихся побочными продуктами производства, обладающими цитотоксическим действием и образующимися в процессе изготовления имплантата.

Способ осуществляют следующим образом.

Имплантат, полученный по известной технологии, помещают в сосуд с органическим растворителем и подвергают воздействию ультразвуком в течение 2 минут. Затем имплантат помещают в сосуд с раствором соляной кислоты и подвергают воздействию ультразвуком в течение 5 минут. После этого имплантат подвергают стерилизации.

Полученный имплантат был подвергнут исследованию на культурах клеток с использованием комплекса современных морфологических методов.

Материалом исследования служили образцы титановой проволоки, путем специальной обработки скрученной так, что она образует структуру с высокой степенью пористости (в данном случае 50%). В лабораторию культуры клеток материал поступал в виде дисков диаметром 5 мм или пластин размером 5×5 мм; толщина образцов составляла 0,5 мм.

При световой микроскопии поверхность дисков всех экспериментальных серий выглядела шероховатой, на некоторых участках были выраженные выступы и впадины неправильной формы. Хорошо были видны нитки титановой проволоки, из которой был скручен диск.

Исследования проведено на первичных культурах дермальных фибробластов человека 4-10 пассажа. Культуру дермальных фибробластов получали из кожно-мышечной ткани абортусов сроком 8-10 недель методом первичных эксплантатов.

Клетки культивировали в стандартных условиях в термостате при температуре 37°С в среде Игла МЕМ+199 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки в пластиковых культуральных флаконах площадью 25 см². Тестирование производили в культуральных чашках Петри диаметром 3 см.

Опыты осуществлялись методом прямого контакта. Фибробласты пересевали из культурального флакона на чашки Петри и культивировали в течение 24 часов; в течение этого времени формировался равномерный монослой клеток, на который помещали образец исследуемого материала. При посеве доза во всех случаях составляла 20 тысяч клеток/ см². Контролем служили чашки Петри с полной ростовой средой и образцами исследуемого материала, в которые не высевали фибробласты, и чашки Петри с культурой фиброб-ластов, которые пассировали и наблюдали одновременно с экспериментальными, но не подвергали никакому воздействию. Все работы проводили в ламинарном боксе.

Клетки в присутствии исследуемого материала культивировали 5 суток.

Нативную культуру изучали, морфометрировали и фотографировали с помощью инвертированного микроскопа при увеличении 400 и 150 (окуляры - 10 и 15, объектив- 10).

Ежедневно проводили визуальные наблюдения и морфометрию нативной культуры. Визуально оценивали целостность монослоя, наличие слущенных клеток в культуральной жидкости, форму и размеры клеток, оценивали цитотоксический эффект. При помощи окулярной сетки Автандилова считали плотность монослоя, а по ее приросту рассчитывали скорость удвоения культуры.

В результате исследования были получены следующие результаты.

Диск, изготовленный с соответствии с известной технологией, помещали на равномерный монослой фибробластов (25 тыс. клеток/см²).

В первые двое суток наблюдался умеренный цитотоксический эффект в непосредственной близости от образца. Это выражалось в разрежении монослоя вблизи образца, нарушении направления роста фибробластов, появлении большого количества спущенных клеток в ростовой среде. В то же время клетки, в основном, сохраняли характерные для них форму и размеры. В отдаленной от образца зоне сохраняли обычную форму, размеры клеток и ядер, цитоплазма их была гомогенной, ядра светлые пузырьковидные с 1-2 ядрышками, и лишь незначительная часть из них имела округлый вид.

К четвертым суткам эксперимента, картина в экспериментальных чашках Петри изменилась незначительно: лишь усилилось разрежение монослоя на всей поверхности чашки.

К концу эксперимента наблюдается некоторая разреженность монослоя на всей поверхности культуральной чашки с исследуемым материалом.

Пористый диск из очищенного титана, полученного по технологии заявителей размером 0,5 мм, толщиной 0,5 мм, помещали на равномерный монослой фибробластов плотностью 24 тыс. клеток/см².

После помещения исследуемого материала на монослой клеток в непосредственной близости от образца наблюдается изменение характера роста фибробластов: клетки начинают расти в направлении образцов, но в отдаленной зоне таких изменений нет.

Такое состояние сохраняется до конца эксперимента (четвертых суток), по всей чашке монослой сохранен, отмечается усиление пролиферации фибробластов, что демонстрируется увеличением плотности монослоя.

Характерно, что при исследовании под инвертированным микроскопом нам удалось наблюдать фибробласты, имевшие характерные для здоровых клеток форму, размеры, количество отростков и ядерно-цитоплазменные отношения на поверхности витков титановой проволоки, что свидетельствует о хорошей адгезии клеток к исследуемому материалу.

Пористый диск из чистого титана (контрольная серия) размером 0,5 мм, толщиной 0,5 мм помещали на равномерный монослой фибробластов плотностью 25 тыс. клеток/ см².

Через сутки наблюдалось увеличение плотности монослоя по всей поверхности культуральной чашки.

В течение последующих суток отмечалось увеличение плотности монослоя равномерно на всей поверхности чашки, что свидетельствует о стимуляции пролиферативной потенции клеток.

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что имплантат, полученный по известной технологии, обладает цито-токсическим эффектом, а имплантат, полученный по технологии заявителей, подобным свойством не обладает.