×
06.07.2019
219.017.a73f

Результат интеллектуальной деятельности: Генетическая конструкция pA21/Fab, для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями.

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической конструкции pA21/Fab. Изобретение решает задачу получения рекомбинантного одноцепочечного антитела человека, стереоселктивно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями. 3 ил., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к технологии получения рекомбинантных антител человека (рчАт) и может быть использовано в медицине в терапии отравлений фосфорорганическими токсинами, для терапии отравлений наркотическими веществами типа кокаин.

В настоящее время антитела имеют широкое применение в медицине и биотехнологии благодаря их способности специфически узнавать и связывать антигены. Возможность искусственно создавать антитела к самым различным соединениям, не имеющим природного аналога, является одной из причин, по которой данная область науки приковывает к себе большое внимание. Однако только на связывании функции антител не ограничиваются. В конце двадцатого столетия была обнаружена способность антител к биокатализу, позволяющая им не только связывать, но и разрушать антиген. На сегодняшний день получено значительное число каталитических антител (абзимов), катализирующих разнообразные химические реакции, для которых не известно природных ферментов. В связи с этим, использование каталитических антител для нейтрализации синтетических ядов открывает широкие перспективы в борьбе с химическими отравлениями, в частности с фосфорорганическими токсинами.

Ранее в результате скрининга полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием п-нитрофенил-8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октанфенилфосфоната (фосфонат X) была отобрана панель рекомбинантных одноцепочечных антител, способных к ковалентному взаимодействию с фосфорорганическими соединениями. Наибольшей активностью из отобранных антител обладали А5 и А17, для которых было установлено, что ковалентной модификации подвергаются остатки L-Tyr33 и L-Tyr37 соответственно. Отличие в положении ключевого аминокислотного остатка в реакционном центре свидетельствует о возможной реализации разных механизмов взаимодействия абзимов с субстратом. Для антитела А17 было показано, что оно способно гидролизовать пестицид параоксон, взаимодействие с фосфорорганическими субстратами осуществляется по механизму индуцированного соответствия, а изотип константного домена легкой цепи (каппа/лямбда) оказывает влияние на структурную организацию. На основе накопленного широкого спектра структурных и функциональных данных антитело А17 было использовано в качестве модели длянаправленного улучшения его каталитических свойств: методом квантовой механики и молекулярной механики (КМ/ММ) успешно предсказаны и экспериментально охарактеризованы мутанты с улучшенной специфичностью к параоксону.

Большинство фосфорорганических соединений, обладающих токсическим действием, являются хиральными молекулами. Таким образом, создание биологических антидотов стереспецифично взаимодействующих с такими ФОТ целесообразно.

Данное изобретение описывает генетическую конструкцию, предназначенную для получения одноцепочечного антитела слитного с константным доменом антитела человека.

Известен способ получения одноцепочечных антител в клетках линии P. pastoris в составе слитного белка с константным доменом иммуноглобулина мыши (Wang DD, Su MM, Sun Y, Huang SL, Wang J, Yan WQ. Protein Expr Purif. 2012 Nov; 86(l):75-81). В данной работе использовалась одноцистронная система векторов. Авторам удалось получить выход продукта 60 мг/л при использовании 80 литрового ферментера. Недостатком этой системы является получение антитела в виде одноцепочечного фрагмента, так как существуют данные о различии в уровнях специфической активности между Fab-фрагментами и одноцепочечными антителами в пользу первых (Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В. и др. // Молекуляр. биология. 2011. Т. 45, №1, С. 86-95).

Известна система получения Fab-фрагмента антитела в составе моноцистронного вектора содержащего сайт гидролиза протеазой KEX2 (Burtet RT1, Santos-Silva MA, Buss GA, Moraes LM, Maranhao AQ, Brigido MM. J Biochem. 2007 Dec; 142(6):665-9). В результате авторам удалось получить функционально активный Fab-фрагмент, однако уровень экспрессии не превышал 10 мг/л культуральной среды.

Описана система получения Fab-фрагмента антитела, состоящая из двух моноцистронных векторов, кодирующих легкие и тяжелые цепи антител, соответственно (Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В. и др. // Молекуляр. биология. 2011. Т. 45, №1, С. 86-95). Система позволяла получать до 15 мг/л активного Fab-фрагмента, однако впоследствии была обнаружена невысокая стабильность получаемых препаратов белка, предположительно по причине совыделения и расщепления Fab-фрагментов протеиназами хозяйской клетки.

Для всех представленных антител не описана их стереоспецифичность действия.

Таким образом, не описаны аналоги предлагаемой системы для экспрессии одноцепочечного антитела, стереоспецифично взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями.

Изобретение решает задачу получения рекомбинантного одноцепочечного антитела человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями.

Поставленная задача решается за счет создания генетической конструкции pA21/Fab, кодирующей ген рекомбинантного антитела, и состоящей из плазмиды pFUSE, которая содержит:

высокоэффективный синтетический промотор hEF/HTLV,

нуклеотидную последовательность гена вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи антитела

нуклеотидную последовательность, кодирующую линкер (Ser-Gly3)3,

нуклеотидную последовательность гена константного фрагмента иммуноглобулина человека Fc, содержащую в своем составе СН2 и CH3 константные домены тяжелой цепи IgG1 (Fc2-3) и находящуюся в единой рамке считывания с геном вариабельных доменов антитела.

Техническим результатом использования генетической конструкции pA21/Fab является получение одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом антитела человека и стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями.

Изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами:

Рис. 1. Схема генетической конструкции pA21/Fab.

Рис. 2. Электрофоретический анализ экспрессии рекомбинантного антитела, полученного после трансфекции клеток линии НЕК-293.

Рис. 3. Анализ стереопецифичности взаимодействия рекомбинантного антитела.

Изобретение иллюстрируют следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Создание генетической конструкции pA21/Fab.

Последовательность гена рекомбинантного антитела получают из генетической конструкции scFv_pHEN2 Reshetnyak et al., JACS 2007 с использованием ПЦР с перекрывающихся праймеров и набора олигонуклеотидов atctcgaggatagcaaagtcacaatcatatgcat, gtcccctatgggcacaccatccacggt, cacaccatccacggtaactttggtccgac, aagcggccgctcagagacccacacaactttctttct и последующим клонированием в вектор pFUSE с использованием эндонуклеаз рестрикции NotI и XhoI, с получением генетической конструкции pA21/Fab (Рис. 1).

ПРИМЕР 2

Трансфекция и аналитическая экспрессия генетической конструкции pA21/Fab.

Полученную генетическую конструкцию pA21/Fab линеаризуют и используют для серии трансфекций клеток линии НЕК-293. Селекцию проводят с использованием антибиотика зеоцина в концентрации 100 мкг/мл. Для отбора клонов штамма-продуцента клетки выращивают в среде Advanced DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. При достижении конфлюентности более 90%, проводят замену среды на безбелковую среду ProCHO-4, ProCHO-5 или аналогичные. Через 72 часа среду центрифугируют и анализируют электрофоретически (Рис. 2).

Было установлено, что уровень экспрессии рекомбинантного антитела человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями, составил около 20 мкг/мл.

ПРИМЕР 3

Анализ стереопецифичности взаимодействия рекомбинантного антитела.

Среду после экспрессии инкубируют с 10 мМ раствором субстрата: (R)-изомера или (S)-изомера арил-фосфоната, конъюгированного с биотином.

Электрофоретическое разделение белков в ПААГ в денатурирующих условиях проводят по стандартной методике. Пробы, контрольный образец и образец рекомбинантного антитела, наносят в буфере: 4% ДСН, 0.25 М Трис-HCl рН6.8, 4 мМ ЭДТА-Na рН 8.0, 10% глицерина, 0.25 мг/мл бромфенолового синего. Электрофорез в концентрирующем геле проводят при силе тока 8-10 мА на 1 пластину геля, а вразделяющем геле при 15-20 мА. По окончании электрофоретического разделения белков в денатурирующем ПААГ пластину с гелем используют для переноса на нитроцеллюлозную бумагу. Перенос проводят в течение 40 минут. После чего мембрану последовательно инкубируют в растворе фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% бычьего сывороточного альбумина и стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Визуализацию результатов иммуноблоттинга осуществляют с использованием прибора Bio-Rad Imager. Результаты, подтверждающие стереоселективность взаимодействия рекомбинантного антитела с арил-фосфонатом, представлены на рисунке 3.Приложение 1

Нуклеотидная последовательность рекомбинантной плазмидная ДНК pA21/Fab.

Генетическая конструкция pA21/Fab для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом антитела человека и стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями, состоящая из плазмиды pFUSE, которая содержит высокоэффективный синтетический промотор hEF/HTLV, нуклеотидную последовательность гена вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи антитела, соединенных нуклеотидной последовательностью, кодирующей линкер (Ser-Gly3)3, нуклеотидную последовательность гена константного фрагмента иммуноглобулина человека Fc (СН2 и CH3 константные домены тяжелой цепи IgG1), где Fc-фрагмент находится в единой рамке считывания с генами вариабельных доменов антитела.
Генетическая конструкция pA21/Fab, для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 51-60 из 111.
29.12.2017
№217.015.f805

Репортерная система на основе лентивирусных репортерных конструкций для изучения белок-белковых взаимодействий

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, конкретно к векторной конструкции. Описанная репортерная система на основе лентивирусных репортерных конструкций позволяет с высокой точностью зарегистрировать взаимодействия исследуемых белков в клетке животного, растения, гриба и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639539
Дата охранного документа: 21.12.2017
29.12.2017
№217.015.fdcf

Способ определения маркеров наличия опухолевых в-лимфобластов

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения маркеров наличия опухолевых В-лимфобластов для установления первичной структуры мажорных генов тяжелой цепи иммуноглобулинов. Отсутствие мажорных продуктов амплификации локуса BCR указывает на отсутствие опухолевых...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002638800
Дата охранного документа: 15.12.2017
19.01.2018
№218.016.00df

2-амино-5,6-дифтор-1-(бета-d-рибофуранозил)-бензимидазол, способ получения и противовирусная активность его в отношении вируса герпеса простого 1-го типа

Изобретение относится к пригодному для лечения герпеса 2-амино-5,6-дифтор-1-(бета-D-рибофуранозил)-бензимидазолу формулы (I) и способу его получения, который может быть использован в фармацевтической промышленности: Предложенный способ включает конденсацию орто-фенилендиамина с бромцианом с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002629670
Дата охранного документа: 31.08.2017
19.01.2018
№218.016.04cd

Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы

Изобретение относится к области биохимии и генетики растений. Предлагается способ молекулярно-генетической идентификации растений ивы на основе микросателлитных (SSR) маркеров, который включает в себя выделение ДНК из исследуемых образцов, проведение ПЦР, электрофоретическое разделение...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002630662
Дата охранного документа: 11.09.2017
19.01.2018
№218.016.0942

Способ получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина р1

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1. Изобретение обеспечивает получение и тестирование безмаркерных растений каланхоэ с повышенными антибиотическими свойствами за...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002631929
Дата охранного документа: 28.09.2017
19.01.2018
№218.016.0a50

Способ получения антимикробного пептида цекропина р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается разработки получения антимикробного пептида цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого. Способ получения антимикробного пептида цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого, включающий...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002632116
Дата охранного документа: 02.10.2017
20.01.2018
№218.016.12e7

Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона н1.3

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к способу получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3. Настоящий способ предусматривает культивирование штамма-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002634408
Дата охранного документа: 26.10.2017
04.04.2018
№218.016.3310

Аптамеры, специфичные к внеклеточному гликозилированному домену человеческого рецептора cd47

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен аптамер, специфичный к внеклеточному гликозилированному домену человеческого рецептора CD47, способный блокировать его взаимодействие с природным лигандом SIRP-alpha. Данное изобретение может найти применение в терапии. 4 ил.
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002645457
Дата охранного документа: 21.02.2018
04.04.2018
№218.016.344a

Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов березы

Изобретение относится к областям молекулярной биологии и генетики растений, в частности к способу молекулярно-генетической идентификации растений березы на основе микросателлитных (SSR) локусов. Способ включает выделение ДНК из исследуемых образцов, проведение ПЦР, электрофоретическое...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002646112
Дата охранного документа: 01.03.2018
04.04.2018
№218.016.3475

Экспрессионный плазмидный лентивирусный вектор для гетерологической экспрессии рекомбинантного человеческого белка cd44

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен экспрессионный плазмидный лентивирусный вектор для гетерологичной экспрессии рекомбинантного человеческого белка CD44 в клетках млекопитающих. Предложенный вектор содержит последовательность внеклеточного домена рецептора CD44,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002646111
Дата охранного документа: 01.03.2018
Показаны записи 21-27 из 27.
04.06.2020
№220.018.23e6

Биосенсор на основе клеток staphylococcus aureus, стабильно продуцирующих зеленый флуоресцентный белок, для проведения ультравысокопроизводительного скрининга

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм-продуцент на основе штамма Staphylococcus aureus NCTC 8325, трансформированного экспрессионной векторной плазмидой pALC1420, содержащей нуклеотидные последовательности конститутивного промотера sar1, гена зеленого флуоресцентного белка GFP,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002722627
Дата охранного документа: 02.06.2020
09.06.2020
№220.018.258d

Штамм метилотрофных дрожжей pichia pastoris yst-ppic9pgapzalpha-short_htfng, продуцирующий рекомбинантный человеческий трансферрин, содержащий аминокислотные замены n413d и n611d

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению модифицированного рекомбинантного трансферрина человека, содержащего аминокислотные замены N413D и N611D (ТФР). Изобретение может быть использовано для получения бессывороточных питательных сред для культивирования клеток...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002723084
Дата охранного документа: 08.06.2020
17.06.2020
№220.018.272c

Модифицированные днк-аптамеры, связывающие внеклеточный домен egfr

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения новых ДНК-аптамеров к EGFR (epidermal growth factor receptor, рецептор эпидермального фактора роста), узнающих внеклеточный домен белка и содержащих химически модифицированный нуклеотид. В изобретении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002723398
Дата охранного документа: 11.06.2020
27.06.2020
№220.018.2b85

Способ конъюгации константного фрагмента тяжелой цепи антитела человека и пептоидного аналога аутоантигена mog35-55 для терапии рассеянного склероза

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу конъюгации рекомбинантного константного фрагмента тяжелой цепи иммуноглобулина человека (Fc) и пептоидного аналога аутоантигена MOG35-55 (AMogP3). Осуществляют химическую конъюгацию Fc с бифункциональным кросс-сшивающим линкером...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002724714
Дата охранного документа: 25.06.2020
21.07.2020
№220.018.3514

Способ выявления кднк коронавируса sars-cov-2 с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ выявления кДНК вируса SARS-CoV-2. Использование специфичных праймеров позволяет выявлять генетический материал вируса SARS-CoV-2 в исследуемых образцах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Одна пара праймеров подобрана к гену orf1ab. Их...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002727054
Дата охранного документа: 17.07.2020
08.08.2020
№220.018.3de0

Днк-аптамер gr200, узнающий внеклеточный домен egfr

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения нового ДНК-аптамера к EGFR (epidermal growth factor receptor, рецептор эпидермального фактора роста) и его мутантной форме EGFR vIII, связывающегося с внеклеточным доменом белков. В изобретении описан аптамерный...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002729382
Дата охранного документа: 06.08.2020
09.05.2023
№223.018.52de

Гибридный ген, состоящий из рецептора rbd поверхностного белка s коронавируса sars-cov-2, эпитопов s14p5 и s21p2, fc-фрагмента, для получения рекомбинантного антигена и его применения в составе вакцинной композиции против коронавирусной инфекции

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Описан гибридный ген, кодирующий рекомбинантный антиген, состоящий из рецептора RBD поверхностного белка S коронавируса SARS-CoV-2, эпитопов S14P5 и S21P2, Fc-фрагмента иммуноглобулина IgG1, представленный в виде аминокислотной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002795160
Дата охранного документа: 28.04.2023
+ добавить свой РИД