Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЦВЕТОВОГО ШАБЛОНА И СПОСОБ АНАЛИЗА КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИХ ТЕСТ-ПОЛОСОК С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

Способ относится к области медицины и аналитической техники, и применяется для изготовления цветового шаблона с калибровочными зонами, цвет которых определяется в соответствии с процедурой калибровки по одно- и многокомпонентными смесям реагентов. Цветовой шаблон может быть использован для анализа результатов колориметрических тест-полосок с помощью мобильного устройства с применением встроенной камеры и специализированного программного обеспечения (ПО), обрабатывающего изображение тест-полоски и цветового шаблона. Способ может быть применен для изготовления калибровочного цветового шаблона, который является вспомогательным элементом в процедуре проведения анализа биологических жидкостей (мочи, слюны) и пищевых продуктов с использованием коммерчески доступных сертифицированных тест-полосок на основе метода «сухой химии» без использования специализированных устройств, что представляет ценность для проведения скрининговых амбулаторных измерений при проведении медицинских анализов и для бытовых нужд (например, при определении качества воды, pH, сахара в напитках и проч.).

Использование тест-полосок для анализа жидких биоматериалов является наиболее применяемым методом в клинической лабораторной диагностике для получения полуколичественных результатов, при этом принцип действия тест-систем основан на колориметрии, то есть, на изменении цвета индикаторов при взаимодействии с молекулами определенного типа (метод «сухой химии»). Для анализа результатов при этом используются специализированные приборы, в которых измеряется спектр отражения в нескольких (обычно четырех) спектральных каналах (патентная заявка США USSN 20170023542 А1, патент США USP 9686540 В2).

Метод "сухой химии" заключается в анализе цветов областей с реагентами, специфичными по отношению к конкретным компонентам, которые могут присутствовать в образце жидкости. По степени и характеру окрашивания каждой из областей делается вывод о содержании данного компонента на основе сравнения с эталонной калибровочной палитрой (метод колориметрии, т.е. определения цвета). При визуальном сопоставлении вывод о том, какая концентрация вещества (из предложенного ряда) имеет место в данном образце, делается на основе субъективного сопоставления цветов человеческим глазом. При инструментальном анализе, который требует наличия специальных считывающих устройств (ридеров), определяются показатели отражения поверхности окрашенных ячеек на нескольких длинах волн. Данный метод является усложненным и дорогостоящим из-за необходимости иметь специальные приборы. При этом метод "сухой химии" используется как полуколичественный метод: это означает, что определяющую роль играет факт наличия или отсутствия определяемого компонента в исследуемом образце либо превышение нормы, установленной для данного компонента, поэтому использование точных дорогостоящих приборов не всегда является оправданным. Колориметрия реагентных областей тестовых полосок может быть осуществлена при помощи фотокамер, в том числе, с помощью встроенных камер мобильных телефонов. При этом фотокамеры различных устройств значительным образом различаются в своих спектральных характеристиках, и для компенсации этих различий требуется наличие на фотографии откалиброванного цветового шаблона, у которого цвета калибровочных зон соответствуют различным концентрациям веществ, определяемых с помощью реагентных областей тестовой полоски. Следует также отметить, что калибровочные палитры, предоставляемые производителем, не всегда позволяют проводить анализ со степенью точности, сравнимой с промышленными мочевыми станциями.

Задачей изобретения является создание способа изготовления калибровочного цветового шаблона, позволяющего осуществить способ колориметрического анализа тест-полосок и документировать его результаты с использованием мобильных устройств без необходимости применения дополнительного оборудования с точностью, не уступающей промышленным устройствам (ридерам, мочевым станциям).

Технический результат заключается в создании способа, позволяющего изготавливать калибровочные цветовые шаблоны, которые могут быть использованы в совокупности с мобильными устройствами для определения концентрации компонентов в растворе с использованием коммерчески доступных тест-полосок с чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью не хуже, чем при использовании коммерчески доступных устройств (ридеров). Способ может быть применен для полуколичественного определения концентрации реагентов, для которых имеются соответствующие аналитические области на тест-полосках. Способ может найти применение в биомедицинской диагностике, оперативном анализе мочи, воды, слюны и пищевых продуктов.

Цель способа - осуществление колориметрического анализа тест-полосок на основе изготовления цветового шаблона для определения концентраций (или диапазонов концентраций) реагентов с использованием тест-полосок, основанного на колориметрическом принципе измерения с помощью мобильных устройств (смартфонов и планшетов со встроенной фотокамерой и специализированным ПО).

Решение данной задачи достигается за счет использования цветовых шаблонов, откалиброванных с использованием одно- или многокомпонентных смесей и аппаратного определения истинного цвета, а также программного обеспечения, позволяющего считывать показания тест-полосок с учетом цветов калибровочных областей цветового шаблона на полученном изображении с использованием методов компьютерного зрения.

Заявляемый способ поясняется следующими рисунками, где

на рис. 1 приведено изображение ряда цветов для индикаторов глюкозы (GLU, верхний ряд, от 0 до 56 ммоль/л) и белка (PRO, нижний ряд, от 0 до 20 г/л). Верхняя из двух ячеек соответствует цвету на пенале производителя Dirui, нижняя - цвету после процедуры калибровки.

на рис. 2 приведено изображение диаграммы размаха отклонений результатов мобильного метода анализа от результатов, определенных с помощью мочевой станции Sysmex UX-2000, выраженные в градациях цветовых шкал.

на рис. 3 изображен пример цветового шаблона с калибровочными зонами с лежащей на нем тест-полоской.

Осуществление способа по методу "сухой химии" заключается в анализе цветов областей с реагентами, специфичными по отношению к конкретным компонентам, которые могут присутствовать в образце жидкости. По степени и характеру окрашивания каждой из областей делается вывод о содержании данного компонента на основе сравнения с эталонной калибровочной палитрой (метод колориметрии, т.е. определения цвета). Для анализа цветов используется цветовой шаблон, содержащий калибровочные зоны, цвета которых были получены в результате процедуры калибровки, описанной ниже. В качестве материала, из которого изготовлен шаблон, можно использовать бумагу различного типа (например, фотобумагу), пластик и другие материалы, на которые можно нанести типографическим методом изображение калибровочных зон с передачей цвета, позволяющей воспроизвести окраску полоски, полученную в калибровочных экспериментах. При калибровке цветов на шаблоне для выбранного реагентного состава тест-полоски окрашиваются в соответствии с указаниями производителя путем инкубации в одно- или многокомпонентных растворах измеряемых реагентов с заданными концентрациями, после чего цвет реагентных областей, соответствующих компоненте, по которой производится калибровка, определяется фотометрически (путем измерения спектра отражения в видимой области с использованием спектрометра или набора светофильтров) либо с помощью фотосъемки. В последнем случае при контролируемых условиях освещенности выполняется фотосъемка окрашенной тест-полоски аппаратом высокого качества, позволяющим производить съемку в форматах RAW или DNG (или других, позволяющих проводить обработку исходного изображения до наложения аппаратных и программных фильтров), при этом для коррекции изображения может быть использована сертифицированная цветовая палитра (например, RAL, Pantone, NSC, описанных в (McCamy, C.S., Marcus, Н., and Davidson, J.G., "A Color Rendition Chart," Journal of Applied Photographic Engineering 11(3) (Summer issue, 1976), 95-99) GretagMacbeth ColorChecker и других), т.е. человек, который производит калибровку таким образом, загружает фотоизображение в программу типа Photoshop CS6 и использовать инструменты типа "Пипетка" чтобы получить средние значения цвета.

Цветовой шаблон представляет собой специально изготовленную карточку, содержащую место для размещения используемой при анализе тест-полоски, а также непосредственно цветовые зоны. Отличием настоящего изобретения является способ получения цветовых зон, который заключается в следующем. Предварительно решают, какие именно вещества и какие именно их градации будут подлежать анализу. В зависимости от количества выбранных веществ на карточке располагают цветовые ряды, подразделенные на зоны. Каждый цветовой ряд соответствует определенному веществу, а каждая зона ряда соответствует определенной концентрации данного вещества. Готовят подлежащее анализу вещество, иными словами, целевой компонент, создают его водный раствор определенной выбранной концентрации, опускают в указанный водный раствор стандартную тест-полоску, содержащую реагентные области. Выдерживают и затем просушивают стандартную тест-полоску до ее окрашивания в течение времени, указанного ее производителем. Далее устанавливают цвет калибровочной зоны цветового шаблона. Для этого:

1. полученную тест-полоску с окрашенной реагентной областью размещают рядом со стандартной сертифицированной цветовой палитрой;

2. окрашенную реагентную область тестовой полоски вместе с наиболее близкой по цвету сертифицированной цветовой палитрой фотографируют при контролируемых условиях освещенности в форматах, позволяющих проводить обработку исходного изображения до наложения аппаратных и программных фильтров;

3. на полученном фотоизображении окрашенной реагентной области цифровым способом производят корректировку ее цвета согласно цвету сертифицированной цветовой палитры;

4. фиксируют полученный цвет реагентной области как соответствующий заданной концентрации выбранного целевого компонента в растворе;

5. зафиксированный цвет реагентной области, соответствующий заданной концентрации компонента в растворе, наносят на соответствующую калибровочную зону цветового шаблона, устанавливая таким образом цвет для данной конкретной концентрации анализируемого вещества.

Возможно для установки цвета калибровочной зоны использование спектрометра, при этом измеряют спектр отражения реагентной области с помощью приемо-передающего оптического волокна или любым другим аналогичным способом измерения спектра; полученный спектр отражения в видимом диапазоне длин волн 380-700 нм переводят в цветовые координаты RGB или CMYK для нанесения на калибровочную зону цветового шаблона путем свертки исходного спектра отражения с функциями цветового соответствия, заданные стандартами CIE XYZ (т.е. расчета соответствующего интеграла); далее переводят из цветового пространства XYZ в цветовое пространство RGB или CMYK.

Аналогичным образом на цветовом шаблоне получают цвета других калибровочных зон, соответствующих цвету окрашивания реагентной области полоски для других концентраций целевого компонента, до получения цветов всех необходимых градаций концентрации компонента в растворе.

Точно таким же способом производят определение цвета реагентной области тест-полоски при наличии влияния нецелевых компонентов на реагентную область. В этом случае готовят многокомпонентный раствор тестовой полоски, в котором присутствует целевая компонента и нецелевая компонента, влияние которой на реагентную область требуется определить. Как описано выше определяют цвет реагентной области одним из указанных выше способов и наносят его на выбранную для него зону шаблона.

Калибровка по многокомпонентным смесям необходима для коррекции на взаимное влияние детектируемых реагентов на окраску соответствующих цветовых областей, например, в случае билирубина и уробилиногена при анализе мочи.

Таким образом, с помощью указанного метода на калибровочные области цветового шаблона будут нанесены цвета, соответствующие цветам окрашивания реагентной области тестовой полоски при наличии определенного компонента в растворе с заданной концентрацией. Преимущество такого получения цветового шаблона заключается в том, что нанесенные цвета позволяют проводить количественное определение концентрации компонента в растворе с помощью камеры смартфона и специализированного ПО для считывания цветов с шаблона. Точность определения концентрации компонента в растворе с использованием получаемого цветового шаблона в среднем выше, чем в случае применения цветовой палитры, предоставленной производителем,

Реализация способа анализа результатов окрашенных тест-полосок состоит в фотографировании данной тест-полоски, размещенной на шаблоне, и дальнейшей обработке фото с помощью мобильного устройства смартфона или планшета со встроенной камерой и операционной системой Android или iOS. На полученном фото производят определение положения шаблона (с использованием стандарта распознавания меток QR-кода или иным образом), затем идентифицируют калибровочные цветовые зоны (с использованием координатной привязки или иным образом) и распознавание тест-полоски и реагентных областей на ней (с использованием алгоритма поиска контуров, например, описанных в работе (Suzuki, Satoshi. "Topological structural analysis of digitized binary images by border following." Computer vision, graphics, and image processing 30.1 (1985): 32-46), дополнительной предобработки в виде фильтрации (например, медианной, морфологических операций (операциинад бинаризованными изображениями, например, морфологического открытия, закрытия, эрозия и др.), преобразований координат, проверок качества распознавания (по площади, соотношению сторон, общей освещенности или иных)). Далее на пред обработанном изображении производят расчет усредненных по каждой реагентной области цветовых координат в заданном цветовом пространстве (RGB, HSV, HSL, CIE 1976 L*a*b*, XYZ или других), после чего методом ближайшего соседа или другим методом классификации, например, с использованием решающего дерева, определяют соответствующую цвету реагентной области цветовую зону на калибровочном шаблоне. Результатом является концентрация (или диапазон концентраций) реагента, соответствующая измеренному цвету реагентной области.

Способ измерения показаний тест-полоски с помощью цветового шаблона осуществляется следующим образом:

1. Тестовую полоску опускают на время, указанное производителем, в образец.

2. Тестовую полоску выдерживают на воздухе в течение времени, указанного в инструкции производителя. Время выдержки контролируют с помощью таймера, реализованного в ПО на мобильном устройстве.

3. Тестовую полоску размещают на предназначенном для нее месте цветового шаблона (Рис. 1).

4. С помощью камеры мобильного устройства, например, телефона, делают снимок тестовой полоски, лежащей на специально подготовленном шаблоне. Шаблон содержит ряды калибровочных зон, цвет которых соответствует различным степеням окрашивания реагентных областей на полоске в зависимости от концентраций исследуемых компонентов в образце.

5. Автоматически производят обработку полученного изображения с помощью ПО на мобильном устройстве: на фотографии распознают шаблон и тест-полоску, при необходимости производят фильтрацию изображения и дополнительные проверки качества распознавания. Далее определяют цвет каждой реагентной области на тестовой полоске и калибровочном шаблоне и устанавливают максимальное совпадение цвета реагентной области и цвета калибровочной зоны после чего на основании найденного совпадающего цвета калибровочной зоны делают вывод о концентрации или диапазоне концентраций проверяемого компонента.

6. Полученные данные по концентрациям реагентов и изображения шаблона и лежащей на нем тест-полоски сохраняются на мобильном устройстве и при необходимости могут быть проанализированы ретроспективно и в динамике, отправлены на другое устройство, а также могут быть проанализированы для выводов о превышении допустимых концентраций.

Пример использования

В данном примере описана калибровка цветового шаблона шкал для индикаторов белка (PRO) и глюкозы (GLU).

В данном примере продемонстрирован результат калибровки цветового шаблона для тест-полосок для анализа мочи (Dirui H10, Китай). Для калибровки были приготовлены серии образцов с различным содержанием исследуемых компонентов. В качестве модельного белка использовался бычий сывороточный альбумин (БСА), помещенный в фосфатный буфер (pH 7.4), содержание белка в образцах ряда соответствовало ряду концентраций в шкале для тестовых полосок Dirui H10: 0, 0.3, 1.0, 3.0, 20.0 (г/л). В ряду образцов глюкозы концентрации составляли 0, 5.6, 14, 28, 56 (ммоль/л). Диапазоны концентраций совпадают с диапазонами, для которых производителем тест-полосок DIRUI приводятся цветовые.

В каждый образец опускались поочередно четыре тестовых полоски, далее они выкладывались на белый лист бумаги, и по истечении 60 секунд (время, необходимое для равномерного окрашивания реагентной области тестовой полоски, указанное производителем) производилась фотосъемка фотоаппаратом Nikon D5100. Далее снимки всех образцов для обеих серий обрабатывались следующим образом: сначала применялась операция коррекции баланса белого с помощью инструмента Curves в программе Adobe Photoshop CS6, далее с помощью инструмента Eyedropper Tool выполнялось считывание среднего значения цвета в пространстве RGB каждой из интересующих ячеек, для чего диаметр инструмента был выбран примерно равным ширине одной ячейки. Т.к. на одном снимке присутствовали 4 тестовых полоски, в качестве итогового значения бралось среднее по четырем точкам. Сравнение цветов исходной палитры от производителя и полученных описанным выше методом цветов приведены на рис. 1.

После корректировки цветовых шкал шаблона для индикаторов GLU и PRO была проведена серия экспериментов, в которой производилось сравнение результатов мобильного анализа используемых тест-полосок (Dirui H10) с использованием скорректированной калибровочной шкалы и использованием шкалы производителя.

С помощью мобильного телефона Xiaomi Redmi Note 4 с ОС Android 7.1 с предустановленным ПО, в котором был реализован описанный способ, производился анализ 25 образцов мочи с использованием скорректированного цветового шаблона и с использованием шаблона без корректировки цветов. Набор образцов предварительно анализировался мочевой станцией Sysmex UX-2000 (использует специальные тестовые полоски того же производителя Meditape II 9U).

По итогам исследования результаты мобильного анализа с использованием скорректированного и нескорректированного шаблона сравнивались по отношению к эталонному методу (результатам анализа этих же образцов, полученных с помощью мочевой станции Sysmex UX-2000). На рис. 2 приведены диаграммы размаха отклонений результатов анализов, полученных с помощью мобильного метода, описанного выше, от результатов анализов, полученных с помощью мочевой станции (приведенных в единицах градации цветовой шкалы).

В таблице 1 приведены средние значения и СКО отклонений результатов мобильного метода анализа при использовании нескорректированного скорректированного цветового шаблона от результатов анализа, проведенного с помощью мочевой станции. По этим же данным были построены диаграммы размаха на рис. 2. Как видно, среднее значение отклонения результатов мобильного метода от результатов мочевой станции (принимаемых за эталон), а также погрешность отклонения снижается при использовании описанного способа калибровки цветового шаблона.

Пример цветового шаблона, полученного путем реализации заявляемого способа, приведен на рис. 3.