Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ ГАММА-ОКТАЛАКТОНА В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА СИСТЕМЫ "КВОРУМ СЕНСИНГА" LuxI/LuxR ТИПА У БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к микробиологии и фармацевтике и касается молекул растительного происхождения, а также их химически синтезированных аналогов, способных подавлять плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение («кворум сенсинг») у бактерий. Изобретение может найти применение при контроле биотехнологических процессов, производстве средств для предупреждения порчи сельскохозяйственной продукции, а также создании новых лекарственных препаратов, предназначенных для предупреждения и лечения бактериальных инфекций растений, животных и человека, возбудители которых используют систему «кворум сенсинга» для индукции своего патогенного потенциала.

Большинство способов борьбы с патогенной микрофлорой ориентированы на развитие прямого антимикробного эффекта, что потенциально может вести к поступлению продуктов разрушения микроорганизмов во внутреннюю среду и среду обитания человека и животных с формированием токсических, аллергических и иных нежелательных эффектов.

В качестве альтернативы природным и химически синтезируемым бактерицидам прямого действия в настоящее время все чаще рассматривается подход, заключающийся не в уничтожении, но в изменении физиологии микроорганизма в направлении подавления (снижения) его способности к паразитированию и повреждению биологических субстратов. В частности, сказанное относится к поиску и созданию ингибиторов «кворум сенсинга» (англ. - quorum sensing) у бактерий, оцениваемых как привлекательная альтернатива традиционным средствам борьбы с инфекциями, особенно, вызываемыми полирезистентными штаммами микроорганизмов [1].

Под термином «кворум сенсинг» у бактерий понимается их плотностно-зависимая коммуникация, опосредуемая малыми диффундирующими молекулами (автоиндукторами) и при достижении пороговой плотности популяции ведущая к функциональной и морфологической дифференцировке составляющих ее клеток [2].

При этом данный феномен коллективного поведения бактерий позволил принципиально по-новому оценить целый ряд примеров функциональной и морфологической дифференцировки прокариот, включая развитие биолюминесценции, синтез пигментов и антибиотиков, образование экзоферментов и факторов вирулентности, формирование биопленок, конъюгацию и спорообразование [3].

Первыми из описанных и, как позже оказалось, наиболее распространенным вариантом коллективного поведения оказался «кворум сенсинг» LuxI/LuxR типа, где синтезируемая под контролем гена luxl сигнальная молекула - ацилированный гомосерин лактон (АГЛ) диффундирует во внешнюю среду, а при достижении критической плотности популяции и определяемой этим собственной пороговой концентрации совершает обратное движение внутрь бактериальной клетки и, связываясь с рецепторным белком LuxR, запускает транскрипцию целевых генов.

Спектр предлагаемых технических решений для ингибирования систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа включает: 1) подавление образования АГЛ; 2) ферментативную или химическую деградацию этих молекул при их поступлении во внешнюю среду; 3) ингибирование связывания АГЛ с соответствующими LuxR-подобными рецепторными белками [4]. Анализ открытых патентных источников позволяет констатировать, что на основе данного подхода предложено несколько десятков изобретений, за последние десятилетия, нашедших отражение в международных охранных документах WO 96/29392; WO 99/27786; WO 01/85664; WO 02/102370; WO 03/106445; WO 2004/016588; WO 2006/125262; WO 2014142748 и др.

Отдельным направлением подобного поиска является обнаружение и исследование природных (растительных) соединений, в естественных условиях ингибирующих «кворум сенсинг» фитопатогенных бактерий, а при переносе в организм человека или животного способных оказывать аналогичное воздействие на стереотипно устроенные системы плотностно-зависимой коммуникации LuxI/LuxR типа у антропо- и зоопатогенных микроорганизмов.

Первым из описанных анти-кворум соединений растительного происхождения стали галогенизированные фураноны, образуемые морской красной водорослью Delisea pulchra и имеющие черты структурного сходства с АГЛ. При этом основным механизмом их действия была признана дестабилизация комплекса «АГЛ: LuxR», приводящая к ускорению оборота данного рецепторнбого белка в клетках морских бактерий Vibrio fischeri и Vibrio harveyi [5]. На данной основе был предложен патент [6], защищающий структуры соединений на основе натуральных и синтетических фуранонов, некоторые из которых по способности к подавлению систем «кворум сенсинга» даже превосходили свои природные аналоги. Однако большинство галогезированных фуранонов оказалось токсичными для человека и животных [7], что явилось существенным препятствием на пути их практического использования.

При исследовании съедобных растений внимание было обращено на чеснок Allium sativum, способность которого к продукции бактерицидов прямого действия (фитонцидов и фитоалексинов) достаточно хорошо изучена. В свою очередь поиск и идентификация анти-кворум активности данного растения позволила связать ее с присутствием аджоена - 2-пропенил-3[3-(2-пропенилсульфинил)-1-пропенил] дисульфида [8], по своей структуре напоминающего фитонцид аллицин и образующегося при его реакции с некоторыми пищевыми маслами. Полученный результат был положен в основу патента [9], однако, собственный терапевтический потенциал данного соединения оказался ограничен, а наилучший результат был достигнут при совместном использовании с антибиотиками: аджоен нарушал кворум-зависимое образование биопленки, что делало присутствующие в ней бактерии более чувствительными к антибиотику тобрамицину. Кроме того, у аджоена обнаружились и иные виды биологической активности, включающие индукцию апоптоза [10], необходимость учета которых усложняет перспективу его практического использования.

При исследовании лекарственных растений наиболее обширные сведения накоплены по эллагитанинам: вескалагину и его изомеру касталагину, изолированным из листьев произрастающего во Флориде (США) лекарственного растения Conocarpus erectus [11]. Экстракты названного растения и выделенные из него полифенольные соединения демонстрируют выраженную способность к ингибированию системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у широкого спектра фитопатогенных и зоопатогенных бактерий от Agrobacterium tumefaciens до Pseudomonas aeruginosa, что нашло свое отражение в материалах патента [12]. Однако ограниченный ареал распространения растения Conocarpus erectus, технологическая сложность выделения эллагитанинов при невозможности их химического синтеза, делают практическое применение названных соединений высоко затратным и экономически неэффективным.

Таким образом, анализ открытых источников научной и патентной литературы свидетельствует как о всевозрастающем интересе к поиску растительных ингибиторов «кворум сенсинга» бактериальных патогенов, так и о существовании ряда препятствий для их практического использования.

В этой связи задачей данного изобретения является применение имеющих растительное происхождение, нетоксичных, лишенных серьезных побочных эффектов и доступных для химического синтеза органических молекул, способных ингибировать различные варианты систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий.

В настоящем изобретении эта задача решается способом применением соединения на основе гамма-окталактона (название по IUPAC 5-butyloxolan-2-one), полностью описываемого формулой 1:

В данном изобретении раскрывается структурная формула соединения формулы 1 и способы его практического применения для регуляции коллективного поведения («кворум сенсинга) у бактерий.

В соответствии с настоящим изобретением регуляторный препарат (композиция) на основе гамма-окталактона содержит по весу от 0,0001 до 100% соединений формулы 1, остальное - нейтральные компоненты или вещества, позитивно модифицирующие (повышающие биодоступность, увеличивающие сроки действия и т.д.) свойства данной композиции.

Наиболее близким известным аналогом изобретения является патент [13], оговаривающий структуру, синтез и использование регуляторов «чувства кворума» общей формулы 2:

По сравнению с соединениями формулы 2 заявляемое соединение общей формулы 1 имеют ряд существенных отличий, отвечающих требованию новизны.

Во-первых, данный патент US patent 7910622, 2011, созданный на основе синтетических лигандов, способных интерферировать с гомосеринлактонами (ГСЛ) за связывание с соответствующими рецепторными белками, построен по «зонтичному» принципу и содержит сведения о многочисленных соединениях с аналогичным природным ГСЛ лактонным кольцом, ковалентно модифицированным ацильными группами различного строения и состава. В нашем случае, заявляемое соединение представляет собой соединение естественного природного происхождения, в большом количестве находящееся в растениях пищевого и лекарственного предназначения. Из доступной научной и патентной литературы регуляторы «чувства кворума» на основе гамма-окталактона не известны. Гамма-окталактон является ароматизирующим ингредиентом, активно используется в косметалогии как ароматизатор с низкой степенью токсичности [14]

Во-вторых, благодаря структурному сходству с природными авторегуляторными молекулами, проявляющими активность во многих luxI/luxR - подобных системах, заявляемое соединение общей формулы 1 обладает регуляторной активностью в отношении cvil/cviR - регулируемой системы биосинтеза виолацеина Chromobacterium violaceum (см. пример 1), а также других биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных виолацеин-продуцирующих, бактерий. При этом вероятной причиной активного действия соединения общей формулы 1 в названных системах «чувства кворума» лежит их избирательное взаимодействие с регуляторным белком CviR и его близкими гомологами и другими LuxR-подобными белками. В свою очередь наиболее тонкие механизмы определяются конформационным соответствием гамма-окталактона участку регуляторного белка, в естественных условиях ответственного за связывание лактонного кольца в молекуле ГСЛ. Для понимания сути изобретения также необходимо указать, что достигаемая применением соединения общей формулы 1 регуляция чувства кворума включает, но не исчерпывается только воздействием на продукцию виолацеина, т.к. под контролем регуляторного белка CviR находится ряд целевых генов (оперонов), в том числе ответственных за продукцию экзоферментов и образование биопленок. Использование же теста индукции или ингибирования биосинтеза виолацеина в настоящем изобретении определяется простотой и информативностью регистрируемого проявления регуляторной активности соединений общей формулы 1.

Защищаемое применение соединения общей формулы 1 подразумевает, в том числе, его использование для управления биотехнологическими процессами, реализуемыми с использованием виолацеин-продуцирующих микроорганизмов (справочно: виолацеин - производное индола, образующееся при окислении триптофана, сине-фиолетовый пигмент с антибактериальной, протистоцидной, противовирусной и другими биотехнологически и фармакологически полезными активностями). В этом случае соединение общей формулы 1 может вводиться в плотные или жидкие питательные среды в виде растворов, а также применяться в виде чистых веществ или иммобилизованными на различных носителях.

В состав патентуемого изобретения входит также применение соединения общей формулы 1 для регуляции активности других целевых генов (оперонов), в том числе вовлеченных в процессы порчи сельскохозяйственной продукции, а также развитие инфекционных заболеваний растений, животных и человека. С этой целью данное соединение может вводиться в организм для обеспечения системного эффекта, а также применяться местно для воздействия на определенные области (например, в составе перевязочных материалов для обработки ран, при обработке операционного поля и т.д.). Соединение может использоваться в виде твердых веществ, растворов или суспензий в воде или других растворителях, а также нанесенными на различные носители. Возможно также использование соединения общей формулы 1 в составе композиций с другими веществами, в том числе позитивно модифицирующими (повышающими биодоступность, увеличивающими сроки действия и т.д.) проявления их биологической активности.

Так же по сравнению с упомянутыми выше техническими решениями [6, 9, 12] заявляемое изобретение имеет ряд существенных отличий, отвечающих требованию новизны.

1) В отличие от патента US 20110105421 [12] способность к подавлению систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий установлена у соединения, выделяемого не из внесенного в Международную Красную книгу тропического растения Conocarpus erectus, но из широко распространенных в различных климатических поясах растений, в том числе произрастающих и в северных широтах: гамма-окталактон присутствует в чернике, персиках, абрикосах и других фруктах, а так же в эвкалипте, где он был нами обнаружен методами хромато-масс-спектрометрии, что снимает ресурсные (сырьевые) ограничения при получении присутствующих в них биологически активных компонентов. Данные растения произрастают на территории Российской Федерации, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных источников получения природных соединений общей формулы 1.

2) В отличие от патента WO 2004016588 [6], соединение общей формулы

1 не проявляют выраженной токсичности в отношении человека и животных (ЛД50=4400 мг/кг) [15]. В соответствии с заключением Европейского агентства по безопасности продуктов питания (EFSA) от 06.10.2004 г. гамма-окталактон признан нетоксичным соединением, пригодным для использования в парфюмерии и косметике, а так же разрешено его включение в продукты питания (например, кондитерские изделия и алкоголь) [14, 15].

3) В отличие от патента WO 2012076016 [9], соединение общей формулы 1 не имеет выраженных побочных эффектов, способных осложнить его практическое применение.

4) Предлагаемый способ применения соединения общей формулы 1 в качестве ингибитора систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий ранее не описано.

Известное применение данного соединения в микробиологии и фармацевтике, широко отражено в патентных обзорах, например: US 20150104399, US 2014178444, US 9125936, US 9334371, US 8623340, US 2014179645 и др., которые описывают вспомогательные (в качестве компонента, входящего в состав композиции) или прямые антибактериальные эффекты гамма-окталактона. В частности, патентом [16] оговаривается применение окта-лактона в качестве очищенного соединения в антимикробной композиции, а патент [14] оговаривает состав антибактериальной композиции с участием гамма-окталактона, но в большей степени как ароматизирующий агент на ряду с кумаринами и ванилинами, противмикробные свойства которых давно известны [17; 18]

Сказанное позволяет утверждать, что из открытых патентных и научных источников применение гамма-окталактона и его производных в качестве ингибиторов систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий не известно.

5) При обосновании настоящего изобретения заявителями получены оригинальные экспериментальные данные, доказывающие возможность применения соединения общей формулы 1 для ингибирования широкого спектра систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий, включающих индуцируемые различными по структуре ацилированными гомосерин-лактонами (АГЛ) системы LuxI/LuxR Vibrio fischeri, Cvil/CviR Chromobacterium violaceum, а также присутствующие у Pseudomonas aeruginosa системы Rhll/RhlR и LasI/LasR. При этом в некоторых случаях зафиксирована и прямая антибактериальная активность гамма-окталактона на фоне которой способность к подавлению «кворум сенсинга» проявляют субингибиторные концентрации тестируемого соединения.

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Способ применения гамма-окталактона для ингибирования различных систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий.

В качестве ингибитора «кворум сенсинга» у бактерий было использовано соединение, соответствующее общей формуле 1.

Определение способности данного соединения к ингибированию «чувства кворума» проводилось с использованием четырех различных бактериальных тест-систем LuxI/LuxR типа, каждая из которых индуцировалась определенным АГЛ и содержала соответствующие ему LuxR-подобный рецепторный белок. При этом три из них были сформированы на основе Escherichia coli JLD271 с мутацией в гене sdiA, ответственном за восприятие экзогенных АГЛ, что исключало интерференцию с клонированными в данном хозяйском штамме генноинженерными биолюминесцентными конструкциями [19]. В свою очередь сами подобные генетические конструкции были представлены плазмидами с последовательностями генов rhlRrhllr.luxCDABE, luxRlux!':iluxCDABE и lasRdasIwluxCDABE, специфически реагирующими развитием свечения при появлении в среде культивирования С4-АГЛ (N-бутаноил-L-гомосеринлактона), С6-оксо-АГЛ (N-(оксогексаноил)-L-гомосеринлактона) и С12-оксо-АГЛ (N-(оксододеканоил)-L-гомосеринлактона), соответственно. Четвертая тест-система была представлена Chromobacterium violaceum NCTC 13274, особенностью которого являлась инсерция транспозона Tn5 в ген cvil, ответственного за синтез С6-АГЛ (N-гексаноил-L-гомосеринлактона), с сохранением функционально активного гена cviR и кодируемого им рецепторного белка, ответственного за восприятие данного автоиндуктора [20]. Вследствие подобной генетической организации данный штамм в присутствии экзогенно вносимого С6-АГЛ образовывал доступный для оптической регистрации (575 нм) сине-фиолетовый пигмент виолацеин.

Возможность применения соединения 1 для ингибирования перечисленных систем «кворум сенсинга» проводилась путем внесения серий их двукратных разведений в жидкие питательные среды, содержащие бактериальный биотест и соответствующий ему автоиндуктор (АГЛ). Характеристикой ингибирующего эффекта служили выраженные в мМ величины ЕС50 - концентрации исследованного соединения общей формулы 1, вызывающие подавление биолюминесценции или нарушение образования пигмента виолацеина на 50% от максимально возможного выраженного эффекта, рассчитанного относительно соответствующих контролей: 0% - в отсутствие АГЛ; 100% - в присутствии только АГЛ. Результаты анализа зависимости «доза-эффект», иллюстрирующие ингибирующий эффект соединения 1 в отношении различных вариантов системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий отображены на Фиг. 1, а в обобщенном виде приведены в таблице 1.

Из приведенных значений видно, что способ применения гамма-окталактона позволяет проявлять ярко выраженное ингибирующее воздействие на все исследованные системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа, характеризуемое величинами ЕС50 от 0,15 до 0,4 мМ.

Положительным результатом подобного способа использования заявляемого изобретения является возможность подавления систем «кворум сенсинга» фитопатогенных и зоопатогенных бактерий.

Список литературы

1. Bhardwaj А.K., Vinothkumar K., Rajpara N. Bacterial Quorum sensing inhibitors: attractive alternatives for control of infectious pathogens showing multiple drug resistance // Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery. 2013. V. 8. P. 68-83.

2. Jiang Т., Li M. Quorum sensing inhibitors: a patent review. Expert Opin. Ther. Pat. 2013, V. 23(7), P. 867-894.

3. Waters С.М., Bassler B.L. Quorum-sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Ann. Rev. Cell and Developmental Biol, 2005, V. 21, P. 319-346.

4. Bhardwaj A.K, Vinothkumar K. Rajpara N. Bacterial quorum sensing inhibitors: attractive alternatives for control of infectious pathogens showing multiple drug resistance. Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 2013, V. 8, P. 68-83.

5. Manefield M., Rasmussen T.B., Henzter M., Andersen J.B., Steinberg P., Kjelleberg S., Givskov M. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover // J. Microbiolody (UK), 2002, V. 148, P. 1119-1127.

6. WO 2004016588, Furanone derivatives and methods of making same.

7. Hentzer M., Givskov M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections. // J. Clin. Invest., 2003, V. 112, P. 1300-1307.

8. Jakobsen Т.Н., Van Gennip M., Phipps R.K., Shanmugham M.S., Christensen L.D., Alhede M., Skindersoe M.E., Friedrich K., Uthe F., Jensen P.O., Moser C, Nielsen K.F., Eberl L., Larsen Т.О., Tanner D., Hoiby N., Bjarnsholt Т., Rasmussen T.B., Givskov M. Ajoene, a sulfur-rich molecule from garlic, inhibits genes controlled by quorum sensing // Antimicrob. Agents Chemother., 2012, V. 56(5), P. 2314-2325.

9. WO 2012076016, Process for the manufacture of ajoene derivatives.

10. Dirsch V.M., Gerbes A.L., Vollmar A.M. Ajoene, a compound of garlic, induces apoptosis in human promyeloleukemic cells, accompanied by generation of reactive oxygen species and activation of nuclear factor kappaB. // Molecular Pharmacology, 1998, V. 53(3), P. 402-407.

11. Adonizio A., Dawlaty J., Ausubel F.M., Clardy J., Mathee K. Ellagitannins from Conocarpus erectus exhibit anti-quorum sensing activity against Pseudomonas aeruginosa // Planta Med., 2008, V. 74, DOI: 10.1055/s-0028-1084373.

12. US 20110105421, Ellagitannins as inhibitors of bacterial quorum sensing

13. Blackwell H.E., Geske G.D., Campbell J.C. Modulation of bacterial quorum sensing with synthetic ligands. US patent 7910622, 2011.

14. Food and Cosmetics Toxicology. V. 14, P. 821, 1976.

15. Duke, James. ' Phytochemical and Ethnobotanical Databases. United States Department of Agriculture.' Agricultural Research Service, Accessed April 27 (2004).

16. US2014179645, Antimicrobial compositions

17. Kontogiorgis C., Detsi A., Hadjipavlou-Litina D. Coumarin-based drugs: a patent review (2008 - present) // Expert Opin. Ther. Pat, 2012, V. 22(4), P. 437-454;

18. Ponnusamy K., Paul D., Kweon J.H. Inhibition of quorum sensing mechanism and Aeromonas hydrophila biofilm formation by Vanillin // Environ. Eng. Sci., 2009, V. 26(8), P. 1359-1363.

19. Lindsay A., Ahmer B.M. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones // J.Bacteriol, 2005, V. 187(14), P. 5054-5058.

20. McClean K.H., et al. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acyl homoserine lactones // Microbiology, 1997, V. 143, P. 3703-3711.