Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БРОНХИАЛЬНЫХ СВИЩЕЙ, ВОЗНИКШИХ ПОСЛЕ РЕЗЕКЦИОННЫХ ОПЕРАЦИЙ НА ЛЕГКИХ

Изобретение относится к медицине, а именно к торакальной хирургии, регенеративной медицине, и может быть использовано для лечения бронхиальных свищей.

Бронхиальные свищи (БС) дыхательных путей остаются одним из распространенных и опасных осложнений лечения патологии органов грудной клетки. Частота БС после пневмонэктомии составляет примерно 2-15% (Panagopoulos ND, Apostolakis Е, Koletsis Е et al. Low incidence of broncho-pleural fistula after pneumonectomy for lung cancer. Interact Cardiovasc Thorac Surg 2009;9:571-575). Существующие консервативные и хирургические способы лечения характеризуются длительностью и малой эффективностью. Операции, выполняемые для закрытия БС, отличаются травматичностью, сопряжены с высоким риском фатальных осложнений, высокой частотой повторной несостоятельности культи бронха и летальностью, достигающей 71% (Cardillo G, Carbone L, Carleo F et al. The rationale for treatment of postresectional bronchopleural fistula: analysis of 52 patients. Ann Thorac Surg 2015;100:251-257).

В настоящее время распространены малоинвазивные эндобронхиальные и торакоскопические вмешательства (Lois М, Noppen М. Bronchopleural fistulas: an overview of the problem with special focus on endoscopic management. Chest. 2005;128:3955-65). Эти методы подходят для пациентов, имеющих небольшие размеры БС (менее 0,5 см в диаметре) и/или высокие хирургические риски. Для закрытия БС применяются различные материалы, например: клеи на основе цианокрилатов, на основе соединений фибрина; рассасывающиеся желатиновые губки; химическое прижигание (этанолом, трихлоруксусной кислотой, тетрациклином и нитратом серебра); эмболизация сосудов, субмукозные инъекции полидоканола.

Аналогом данной заявки является способ бронхоскопического лечения трахеомедиастинальных свищей с использованием аутологичных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) из жировой ткани (Diaz-Agero Alvarez Р, Garcia-Arranz М, Georgiev-Hristov Т, Garcia-Olmo D. A new bronchoscopic treatment of tracheomediastinal fistula using autologous adipose-derived stem cells. Thorax 2008; 63:374-376). Способ включает в себя выделение МСК из аутолипоаспирата по стандартному протоколу в конечной концентрации клеток 9,8×10⁶ в дозе. Половину клеток ресуспендировали в растворе тромбинового компонента фибринового клея до объединения с раствором тиссукола. МСК-содержащий фибриновый клей вводили в полость свища через бронхоскоп. Контрольную бронхоскопию проводили первые 3 месяца после операции, а затем каждые 3 месяца. Цитологические исследование мазков, взятых при браш-биопсии, проводили после каждой бронхоскопии. Полное закрытие свища наблюдалось через 3 месяца.

Основными недостатками данного способа являются: использование аутологичных МСК, что увеличивает риск трансформации клеток в опухолевые у пациентов с онкопатологией; также способ предусматривает однократное введение МСК, что может быть недостаточным для заживления свищей размером более 5 мм.

За ближайший аналог выбран способ применения клеточных технологий в торакальной хирургии (Егоров В.И., Ионов П.М., Юркевич Ю.В. Первый опыт применения клеточных технологий в торакальной хирургии. Вестник Северо-Западного медицинского университета им. И.И. Мечникова, 2015; Т. 7, №2:7-13), заключающийся в том, что пациентам на 7-10 день после развития несостоятельности культи бронха (диаметры дефектов культи бронха не превышали 5 мм) вследствие резекционной операции через бронхоскоп инъекционно вводили суспензию аллогенных фибробластов человека в подслизистый слой культи бронха в зону свища. Использовались фибробласты, удовлетворяющие критериям контроля качества и помещенные на длительное криохранение с последующим субкультивированием до достижения конфлюентности 80% в среде альфа-MEM с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки. Зону свища обкалывали в 2-5 точках, общим объемом 1,5 мл и в конечной концентрации клеток 3×10⁶/мл.

Основные недостатки данного способа:

1) лечение применяется при малых размерах свищей, не более 5 мм;

2) позднее начало применения методики на 7-10 день после развития несостоятельности культи бронха и однократное введение фибробластов;

3) отсутствие факторов роста и стимуляции фибробластов;

4) применение дополнительных манипуляций с фибробластами - субкультивирование после разморозки;

5) использование ксеногенной фетальной бычьей сыворотки в качестве добавки к питательной среде альфа-МЕМ;

6) отсутствие цитологического и гистологического контроля.

Задачами данного предложения являются:

1) повышение эффективности лечения бронхиальных свищей, возникших после резекционных операций на легких;

2) сокращение сроков заживления бронхиальных свищей размером более 5 мм;

3) снижение риска развития рецидива бронхиальных свищей;

4) упрощение способа и сокращение времени подготовки дермальных аллофибробластов к инъекционному введению;

5) сокращение материальных затрат;

6) совершенствование контроля эффективности лечения путем проведения цитологического и гистологического исследования.

Поставленные задачи достигаются тем, что в послеоперационном периоде после выявления методом фибробронхоскопии бронхиального свища размером более 5 мм, размораживают дермальные аллофибробласты и ресуспендируют в 2 мл 0,9% физиологического раствора NaCl до конечной концентрации клеток 2,0×10⁶ в дозе, и одновременно выполняют температурный лизис обогащенной тромбоцитами аутологичной плазмы с исходным содержанием в ней тромбоцитов 1,85×10⁹/л для получения 2 мл аутологичного лизата тромбоцитов,

затем полученные компоненты смешивают в шприце, подсоединяют шприц к эндоскопическому инъектору и производят 4-6 инъекций по периметру свища в подслизистый слой, отступив 1-2 мм от края свища на глубину 1 мм на одинаковом расстоянии друг от друга, с повторением вышеописанной процедуры на 3-й и 5-й дни лечения с последующим цитологическим и гистологическим контролем результатов лечения.

Технический результат способа лечения бронхиальных свищей, возникших после резекционных операций на легких, заключается в том, что введение двух компонентов: дермальных аллофибробластов, ресуспендированных в 2 мл 0,9% физиологического раствора NaCl в концентрации клеток 2,0×10⁶ в дозе, и аутологичного лизата тромбоцитов объемом 2 мл, по периметру свища в подслизистый слой отступив 1-2 мм от края свища на глубину 1 мм на одинаковом расстоянии друг от друга позволяет устранить послеоперационные дефекты бронхов размером более 5 мм, сократить время заживления свищей на 29% по сравнению с известными аналогами, что позволяет улучшить качество жизни пациентов. Это достигается за счет раннего начала терапии и неоднократного введения дермальных аллофибробластов, а так же повышения их активности за счет аутологичного лизата тромбоцитов. Способ является недорогим и простым в исполнении, кроме того предусматривает качественную оценку и контроль формирования рубцовой ткани с помощью цитологических и гистологических исследований.

Способ осуществляется следующим образом.

После выявления БС в послеоперационном периоде и принятия решения о малоинвазивном лечении выполняют одновременно подготовку двух компонентов к использованию. Для приготовления первого компонента производят забор периферической крови с гепарином из расчета 2 Ед/мл объемом 50 мл, из которой сначала готовят обогащенную тромбоцитами плазму с исходным содержанием в ней тромбоцитов 1,85×10⁹/мл методом двойного центрифугирования, а затем из обогащенной тромбоцитами плазмы готовят аутологичный лизат тромбоцитов методом двойного замораживания

при t -80°C и быстрого размораживания при t +37°С для лизиса тромбоцитов с последующим центрифугированием при 3000 об/мин 15 мин для осаждения фрагментов тромбоцитов. Потом супернатант, представляющий собой аутологичный лизат тромбоцитов, аликвотируют в три криопробирки по 2 мл, и помещают на хранение при t -80°С до использования. Одну криопробирку размораживают и используют в день введения.

Параллельно с первым компонентом готовят второй компонент. Из криобанка достают криопробирку с дермальными аллофибробластами объемом 2 мл, которые предварительно перед хранением были получены методом культивирования: дермальные аллофибробласты культивируют в культуральных флаконах на питательной среде, состоящей из раствора ДМЕМ / 10% карантинизированной донорской плазмы АВ группы / 100 ед/мл антибиотика-антимикотика, до плотности монослоя 80-90%, затем обрабатывают трипсин-версеном для открепления клеток от дна флакона и отмывают фосфатно-солевым буфером, замораживают с бессывороточным криопротектором. Перед хранением в криобанке проводят контроль качества, включающий вирусный и бактериологический контроль, цитогенетическое исследование на отсутствие генетических аберраций и иммуноцитохимическое исследование на онкогенность культуры дермальных аллофибробластов по экспрессии белка р53. Дермальные аллофибробласты размораживают стандартным методом и ресуспендируют в 0,9% физиологическом растворе NaCl в объеме 2 мл и конечной концентрации клеток 2×10⁶ в дозе.

Перед введением оба компонента смешивают в шприце объемом 5 мл, который подсоединяют к эндоскопическому инъектору, и производят 4-6 инъекций по периметру свища в подслизистый слой отступив 1 -2 мм от края свища на глубину 1 мм на одинаковом расстоянии друг от друга. Процедура введения проводится трехкратно на 1-й, 3-й и 5-й день лечения под местной анестезией через канал бронхоскопа диаметром 2-2,5 мм с помощью бронхоскопического инъектора диаметром 1,8 мм.

Контроль результата проведенного лечения осуществляют методом фибробронхоскопии, цитологическими и гистологическими исследованиями через 1, 3 и 6 месяцев.

По данному способу в клинических условиях ГБУЗ «Научно-исследовательский институт - Краевая клиническая больница №1 имени профессора С.В. Очаповского» министерства здравоохранения Краснодарского края пролечено 11 человек, в возрасте 48-75 лет с патологией: 1) свищ главного бронха - 6 человек; 2) свищ долевого бронха - 4 человека и 3) дефект анастомоза - 1 человек, большинство из которых (90% пациентов) оперированы по поводу рака легкого. Выздоровление наблюдалось у 100% пациентов.

Примеры дополнительно продемонстрированы на фотографиях, смотри приложение, где 1 - свищ правого бронха, 2 - полное закрытия свища бронха на 5-й день, 3 - морфологическая картина культи бронха в зоне закрытия свища, 4 - свищ культи нижнедолевого бронха справа, 5 - полное закрытия свища культи нижнедолевого бронха справа.

Пример 1. Больной С., 59 л. поступил в отделение торакальной хирургии с диагнозом: центральный с-r правого легкого, T2aN1Mx, у/д плоскоклеточный, состояние после пневмонэктомии справа, лимфодиссекции кл. гр. IV. Свищ культи правого главного бронха. Эмпиема постпневмонэктомической полости.

В плановом порядке ему была проведена пневмонэктомия справа, лимфодиссекция по поводу центрального с-r правого легкого T2aN1MxR0. В послеоперационном периоде у пациента на 12-е сутки по данным фибробронхоскопии была выявлена полная несостоятельность культи правого бронха, размер свища 9 мм (фото 1). В этот же день у пациента была забрана периферическая кровь с гепарином (100 Ед) объемом 50 мл и передана в лабораторию для приготовления аутологичного лизата тромбоцитов. На первом этапе была приготовлена обогащенная тромбоцитами плазма методом двойного центрифугирования с исходным содержанием в ней тромбоцитов 1,85×10⁹/мл. Затем обогащенную тромбоцитами плазму двукратно замораживали при t -80°С и размораживали t +37°С, центрифугировали при 3000 об/мин 15 мин для осаждения фрагментов тромбоцитов. Полученный аутологичный лизат

тромбоцитов в количестве 6 мл был аликвотирован в криовиалы по 2 мл и заморожен при t -80°C. За 2 часа до манипуляции дермальные аллофибробласты были разморожены по стандартной методике и ресупендированы в 2 мл физиологического раствора в конечной концентрации клеток 2×10⁶ в дозе. Криопробирка с аутологичным лизатом тромбоцитов была разморожена в водяной бане при t +37°С. Пробирка с аутологичным лизатом тромбоцитов и пробирка с клеточной взвесью в стерильных упаковках были доставлены в кабинет для проведения фибробронхоскопии. Непосредственно перед введением оба компонента смешивали в шприце объемом 5 мл, который подсоединяли к инъектору. Под местной анестезией был введен бронхоскоп BF-XT-40 №468, осмотрено и санировано бронхиальное дерево. Взяты посевы и биопсия зоны культи. Через бронхоскоп был введен инъектор, через который введена смесь, состоящая из взвеси дермальных аллофибробластов и раствора аутологичного лизата тромбоцитов, в подслизистый слой на глубину 1 мм по периметру свища в 6 точек на расстоянии 1-2 мм от края свища на одинаковом расстоянии друг от друга. Данную процедуру введения пациенту повторяли на 3-й и 5-й день. На 5-й день было отмечено полное закрытие свища бронха (фото 2). Пациент был выписан по месту жительства в удовлетворительном состоянии. Через 1, 3 и 6 месяцев контрольная фибробронхоскопии выявила сохранную культю правого главного бронха, отсутствие свища, что подтверждалось цитологическим и гистологическим контролем (фото 3).

Пример 2. Больной К., 72 лет, поступил в отделение торакальной хирургии с диагнозом: периферический с-r нижней доли правого легкого pT2aN2M0, состояние после нижней лобэктомии справа, II кл. гр. В плановом порядке ему была проведена нижняя лобэктомия справа. В удовлетворительном состоянии пациент был выписан по месту жительства.

Через 1,5 месяца после выписки при контрольной фибробронхоскопии был диагностирован свищ культи нижнедолевого бронха справа размером 7 мм (фото 4). В этот же день была забрана периферическая кровь в объеме 50 мл и приготовлен аутологичный лизат тромбоцитов в количестве 6 мл, аликвотирован по 2 мл и заморожен в криопробирках. В день каждой инъекции размораживали по одной пробирке с аутологичным лизатом тромбоцитов

объемом 2 мл и клеточной взвеси дермальных аллофибробластов объемом 2 мл. Размороженные дермальные аллофибробласты ресуспендировали в физиологическом растворе в объеме 2 мл и с концентрацией клеток 2×10⁶ в дозе. Полученная суспензия клеток и аутологичный лизат тромбоцитов в стерильной упаковке были доставлены в кабинет для проведения бронхоскопии. Перед введением оба компонента смешивали в шприце, который подсоединяли к инъектору. Через бронхоскоп BF-1T-60 №052 под местной анестезией, после санации была введена смесь из суспензии клеток и аутологичного лизата тромбоцитов в общем объеме 4 мл в подслизистый слой на глубину 1 мм по периметру свища в 4 точки на расстоянии 1-2 мм от края свища на одинаковом расстоянии друг от друга. Всего было проведено 3 бронхоскопии с введением суспензии дермальных аллофибробластов и аутологичного лизата тромбоцитов: на 1-й, 3-й, 5-й день. Контрольная фибробронхоскопия на 21-й день показала отсутствие признаков осложнений со стороны культи нижнего долевого бронха, свищ не выявлен (фото 5). Пациент был выписан по месту жительства в удовлетворительном состоянии. Через 3 и 6 месяцев контрольная фибробронхоскопии выявила сохранную культю правого главного бронха, отсутствие свища, что подтверждалось цитологическим и гистологическим контролем.